Analyse rapide et robuste de cellulaire et moléculaire de polarisation induite par des chimiokines de signalisation
Summary
Chemokine signaling elicits marked alterations of cellular morphology and some important redistributions of intracellular proteins. Here, a rapid and detailed protocol is provided to study these events.
Abstract
Les cellules répondent à la stimulation par la chimiokine perdre leur forme ronde dans un processus appelé polarisation, et en modifiant la localisation subcellulaire de nombreuses protéines. Techniques d'imagerie classiques ont été utilisées pour étudier ces phénomènes. Cependant, ils doivent l'acquisition manuelle de nombreuses cellules, suivie par une quantification du temps de la morphologie et de la co-localisation de la coloration de plusieurs dizaines de cellules. Ici, un procédé rapide et puissant est décrit à étudier ces phénomènes sur des échantillons constitués de plusieurs milliers de cellules en utilisant une cytométrie en flux de la technologie de formation d'image qui combine les avantages d'un microscope à celles d'un cytomètre. Utilisation de lymphocytes T stimulés avec CCL19 et coloration pour les molécules MHC de classe I et de l'actine filamenteuse, une stratégie de déclenchement est présenté simultanément à mesurer le degré de modifications de forme et l'étendue de la co-localisation de marqueurs qui sont affectés par la signalisation de CCL19. En outre, cette stratégie de porte nous a permis de OBSERVe la séparation de l'actine filamenteuse (à l'avant) et phosphorylée Ezrin-Radixin-Moesin (phospho-ERM) protéines (à l'arrière) dans les cellules T polarisées après CXCL12 stimulation. Cette technique est également utile pour observer l'effet de blocage sur la polarisation de deux éléments différents: l'inhibition de la polymérisation de l'actine par un inhibiteur pharmacologique et l'expression de mutants de la / voie de signalisation de la PKC atypique PAR6. Ainsi, la preuve montre que cette technique est utile d'analyser les altérations morphologiques et redistributions de protéines.
Introduction
Les chimiokines sont de petites protéines solubles qui attirent les cellules à des endroits spécialisés 1. Par conséquent, ils participent au positionnement correct de cellules dans les tissus, un rôle crucial dans le développement et la physiologie. Le système immunitaire ne fait pas exception à cette règle car il repose sur l'action de nombreux différents types de cellules qui agissent de concert pour monter une réponse immunitaire efficace. En contrôlant la localisation spécifique d'un type de cellule immunitaire dans un état donné, les chimiokines sont des pré-requis avant antigènes étrangers peuvent être détectés et neutralisés.
Dans les lymphocytes T en particulier, les chimiokines se lient à des récepteurs spécifiques de surface qui, lors de l'engagement, suscitent de nombreux signaux intracellulaires (élévation du calcium, la phosphorylation de ERK, activation GTPases Rho, augmentation des intégrines affinité et altérations du cytosquelette) qui favorisent motilité des cellules T 2,3. Au niveau cellulaire, on peut observer des altérations morphologiques induites par stimulation de chimiokine.Ces changements dans les formes cellulaires sont particulièrement dramatique dans les cellules T: les cellules T au repos ont une morphologie ronde bourrelet lorsque vous voyagez dans le flux sanguin. Cependant, la détection de la présence de chimiokines dans les sites inflammatoires ou à proximité des organes lymphoïdes va changer la forme des cellules T qui adoptent désormais une «main-miroir» morphologie typique composé d'une forme bipolaire: un bord d'attaque à l'avant et un bord arrière, ou uropode, 4 à l'arrière. En outre, les composants intracellulaires peuvent séparer dans ces deux régions opposées d'une cellule T de polarisation pour maintenir la migration. Par exemple, les filaments d'actine polymérisation augmente lors d'une stimulation de chimiokine 5 actine polymérisée et se accumule à l'avant d'une cellule polarisée T 2. D'autre part, plusieurs protéines telles que les protéines phosphorylées de la famille Ezrin-Radixin-Moesin (ERM) qui relient la membrane plasmique au cytosquelette d'actine corticale, relocaliser au uropode de polarisationLes cellules T 6. Fait intéressant, nous et d'autres avons montré que ce processus de polarisation est nécessaire pour la migration des cellules T. En effet, un traitement qui interfère avec la polarisation va inhiber la motilité cellulaire. Par exemple, l'inhibition de l'activité des membres de la protéine atypique kinases C (PKC) famille, PKCÇ et PKCι blocs T polarisation de la cellule et le processus de balayage de migration des cellules dendritiques 7. T polarisation cellulaire est également réglementée par GTPases Rho. Nous avons montré que la modulation de l'activité de la protéine RhoA par Fam65b récemment décrit interfère avec les changements de cellules T de la morphologie et de leur capacité à migrer dans un dosage 6 Transwell. Comme polarisation est une étape préalable à la motilité cellulaire, il est donc crucial d'être en mesure de quantifier comme un indicateur principal de réponses de chimiokines. modifications de la forme des cellules ont déjà été mesurés manuellement 8. Cependant, ce type de dosage est très chronophage, de sorte que seuls quelques-uns habituellementdizaines de cellules sont prises en compte.
Ici, une nouvelle méthode est présentée à quantifier rapidement le degré de modifications de forme de lymphocytes T exposés à la chimiokine stimulation. Un flux d'imagerie de cytométrie la technologie (voir le tableau des réactifs spécifiques / Équipement) est utilisée, qui combine les avantages d'un cytomètre de flux et un microscope neuf pour quantifier efficacement la quantité de cellules polarisées dans différentes conditions de stimulation de chimiokine. En plus de la quantification des altérations morphologiques que l'on peut mesurer robuste avec cette technologie, il est également possible d'évaluer les changements dans la localisation subcellulaire de certaines protéines de chimiokine sur la signalisation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Grâce à une technologie récente des flux d'imagerie de cytométrie une stratégie rapide et informative déclenchement d'analyser des événements cellulaires et moléculaires induits par la stimulation de la chimiokine est présenté. A partir d'une seule expérience, on peut obtenir deux types d'informations: les changements dans la morphologie cellulaire induites par stimulation de la chimiokine et la distribution subcellulaire de protéines différentes pendant le processus de polarisation. Fait i…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient grandement Pierre Bourdoncle, Thomas et Louise Guilbert Rimbault du Fonds Cochin Imaging. Ce travail a été soutenu par l'Inserm, le CNRS et la Ligue Nationale contre le Cancer (Equipe labellisée).
Materials
| Name of the material/Equipment | Company | Catalog number | Comments/Description (optional) |
| RPMI | Gibco | 61870-010 | |
| Human serum AB | PAA | C11-021 | Pre-heat to inactivate the complement. |
| Fetal calf serum | PAN Biotech | P30-3300 | Pre-heat to inactivate the complement. |
| Human T cell nucleofactor kit | Lonza | VCA-1002 | |
| Murine IL7 | Peprotech | 217-17 | |
| HBSS | Gibco | 14025-050 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Hepes | Gibco | 15630-056 | |
| Murine CCL19 | Peprotech | 250-27B | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. |
| Human CCL19 | Peprotech | 300-29B | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. |
| Human CXCL12 | Peprotech | 300-28A | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. This chemokine can also be used on mouse T cells. |
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 157-8-100 | This is a 8 % PFA solution in water. Mix volume to volume with 2X PBS to obtain a 4 % PFA solution in PBS. |
| BSA | Sigma | A3059 | |
| Saponin | Fluka | 84510 | |
| Alexa Fluor 594 phalloidin | Invitrogen | A12381 | |
| FITC-anti-HLA-ABC antibody | Beckman Coulter | IM1838 | clone B9.12.1 |
| Anti-P-ERM antibody | Cell Signaling Technology | 3149P | |
| ImageStreamx Mark II | Amnis |
Riferimenti
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