In Analisi Vitro di Myd88 mediata Cellular Immune Response to West Nile virus mutante Strain Infezione

Virus West Nile (WNV), una neurotropo, plus-rilevati flavivirus, è una minaccia per la salute pubblica emergente. Attualmente, vaccini sono stati approvati per uso umano ^1. Un ceppo WNV attenuato, che ha una sostituzione P38G nel non strutturale (NS) di proteine ​​4B, è noto per indurre non letalità nei topi ma citochine superiore innate e le risposte delle cellule T nei topi wild-type di WNV NY99 ceppo ^2. I topi immunizzati con il mutante NS4B-P38G stati tutti protetti da una sfida secondario con letale wild-type WNV. Questo suggerisce che il mutante NS4B-P38G ha caratteristiche adatte per un vaccino candidato ideale. I meccanismi con cui il mutante NS4B-P38G induce protezione ad alta immunità adattativa non sono chiaramente ancora capito. Toll-like receptors (TLR), che riconoscono pattern molecolari associati ai patogeni, svolgono un ruolo fondamentale nell'avvio di immunità innata alle infezioni virali. Il percorso di segnalazione nucleo TLR utilizza mieloide risposta differenziazione primaria geNE 88 (MyD88) come scheda primaria ^3,4. In un recente studio, la segnalazione MyD88 ha dimostrato di giocare un ruolo importante nello sviluppo delle cellule mediata durante WNV NS4B- P38G infezione nei topi mutanti ^5. Le cellule dendritiche (DC) sono una delle più importanti cellule presentanti l'antigene espositrici la capacità unica di avviare le risposte delle cellule T primarie durante l'infezione virale ^6,7. Cellule T CD4 ⁺ e CD8 ⁺ entrambi contribuiscono all'immunità protettiva di lunga durata e sono importanti per la sopravvivenza di accoglienza a seguito di tipo selvaggio WNV infezione ^8,9. Due saggi immunologici sono stati usati in questo studio per valutare le funzioni di queste cellule nei topi mutanti infettati NS4B-P38G.

In primo luogo, un dosaggio priming di cellule T in vitro è stato utilizzato per confrontare la capacità presentanti l'antigene di DC di wild-type WNV-infetti e MyD88 ^{– / –} mice. Per aumentare la sensibilità del test, ingenuo CD4 <sup> + cellule T sono stati isolati da OTII topi transgenici che esprimono uno specifico Vα2 / Vβ5 TCR per l'ovoalbumina pollo (OVA) peptide 323 – 339. DC di WNV topi infetti sono stati purificati, e co-coltura con carboxyfluorescein succinimidil Pasqua (CFSE ) -labeled cellule CD4 ⁺ T in presenza di OVA peptide. Dopo 5 giorni di co-coltura, le cellule sono state raccolte e fissate con paraformaldeide (PFA) e analizzati mediante citometria a flusso. Saggi proliferativa, sono state tradizionalmente effettuata mediante incorporazione di 5-bromo-2'-deossiuridina (BrdU) o triziata deoxyriboside timina ⁽³ HTdr) ^10. Tuttavia, questi test sono o radioattivi e / o che necessitano di apparecchiature speciali a livello di biosicurezza (BL) 3 strutture, dove vengono condotti studi WNV. L'analisi citofluorimetrica della proliferazione dei linfociti dimezzando seriale dell'intensità di fluorescenza del colorante vitale CFSE è diventato più comunemente usato in saggi immunologici, come il colorante è più stabilee uniformemente incorporati in cellule, rilevata facilmente mediante citometria di flusso, ed è non radioattivo ^11. Il test ha anche la capacità di valutare il numero di divisioni cellulari. Uno dei principali vantaggi di questo test in studi WNV è che la fissazione delle cellule infettate con 1-2% PFA possa inattivare WNV ^12, che consentirà l'acquisizione dei campioni con un citometro a flusso in un laboratorio BL2.

Successivamente, una procedura modificata intracellulare di citochine colorazione (ICS) è stato utilizzato per studiare il ruolo di MyD88 segnalazione nella regolazione del WNV specifiche risposte delle cellule T in NS4B-P38G topi mutanti-infettati. In questo saggio, splenociti isolati da topi infetti sono stati trattati in vitro con WNV peptidi specifici. Brefeldina A inserito mantenere le citochine all'interno della cellula. Dopo 5 ore di incubazione, le cellule sono state raccolte, lavate e colorate per sottogruppi di cellule T. Le cellule sono state poi fissati in PFA, permeabilizzate e colorate per interferone (IFN) -γ e analizzate mediante citometria a flusso.Come con altri flusso-citometria saggio basato, una volta che le cellule vengono trattate con fissazione e tampone di permeabilizzazione contenente PFA, campioni infetti possono essere trasferiti ad un laboratorio BL2 per l'ulteriore elaborazione e analisi. In diversi studi pubblicati, abbiamo usato ICS per misurare le funzioni effettrici delle cellule T in WNV-infetti topi ^13,14. Anche se è ben consolidata, uno svantaggio principale di questo saggio è che la procedura è molto lunga e potrebbe essere più tempo quando eseguita all'interno di strutture BL3. Qui, un metodo basato ICS-tube micro-centrifuga ha dimostrato di essere più fattibile, facile procedere e richiede meno tempo quando eseguita all'interno di un laboratorio BL3.