Summary

Swimmeret Система Раки: Практическое руководство для рассечения нервной цепочки и внеклеточной регистрацию структуры Motor

Published: November 25, 2014
doi:

Summary

Here we describe the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. We also demonstrate an electrophysiological technique to record fictive locomotion from swimmeret motor neurons.

Abstract

Здесь мы демонстрируем рассечение раков брюшной нервной цепочки. Препарат содержит две последние грудных ганглиев (T4, T5) и цепь брюшной ганглиях (А1-А6). Эта цепочка ганглиев включает в себя часть центральной нервной системы (ЦНС), что приводит скоординированной локомоции плеоподов (swimmerets): системы swimmeret. Он известен более пяти десятилетий, что в раков друг swimmeret управляется своим собственным независимым картины генерации ядра, который генерирует ритмичные переменного Задание 1-3. Моторные нейроны, иннервирующие мускулатуру каждого swimmeret состоять из двух анатомически и функционально различных групп населения 4. Один отвечает за отвода мощности (инсульт, PS) в swimmeret. Другие диски затяжного (обратный ход, RS) в swimmeret. Моторные нейроны swimmeret системы способны производить спонтанно фиктивный двигателя узор, который идентичен образцу, записанной в естественных условиях </EM> 1.

Целью данного отчета является ознакомление интересный и удобный модельную систему для изучения ритма генерирующих сетей и координации независимых микросхем для практических лабораторных курсов студентов. Протокол условии включает в себя шаг за шагом инструкции для вскрытия брюшной нервной цепочки раков, в пиннинга изолированной цепи ганглиев, desheathing ганглиев и записи swimmerets фиктивный шаблон двигателя внеклеточно от изолированных нервной системы.

Кроме того, мы можем контролировать деятельность swimmeret нейронов, записанных внутриклеточно из дендритов. Здесь мы также кратко описать эти методы и приведем несколько примеров. Кроме того, морфология swimmeret нейронов может быть оценена с помощью различных методов окрашивания. Здесь мы приводим примеры внутриклеточных (ионтофорезом) красителя заполнено нейронов и backfills бассейнов в swimmeret двигательных нейронов. В нашей лабораториимы используем этот препарат для изучения основных функций фиктивного передвижения, эффект сенсорной обратной связи о деятельности ЦНС и координации между микросхемами на клеточном уровне.

Introduction

В swimmerets раков выполнять функцию в контроле позы и бить ритмично, когда животные плавать вперед, проветрите их норы или женщины проветрить свои яйца 5, 6. The swimmerets сигнала раков, Pacifastacus leniusculus, встречаются парами из второго по пятое брюшной сегмент, с одной конечности на каждой стороне брюшной полости 7. Центральной нервной системы производит на собственной ритмической двигателя стук, который приводит в движение swimmeret в интактных животных, а также в изолированном препарате нервной цепочки. Когда нет сенсорная обратная связь или убывания вход настоящее ритмичный двигатель модели производятся называется фиктивным передвижение 1, 2. В системе swimmeret этот двигатель модели не отличается какого-либо параметра от деятельности swimmerets, измеренных в интактных животных.

Движение каждого swimmeret управляется микросхемой, который находится в и ограничивается одной сorresponding hemiganglion 1 -. 3 В каждой микросхемы есть шаблон генерации ядра, включает в себя пять выявленных удобства всплески интернейронов. Они могут быть функционально характеризуется либо как ингибитор хода силы (IPS) или ингибитор обратного хода (IRS) 8. Эти IPS и IRS интернейронов не являются эндогенными генераторы, а их переменный деятельность обусловлена ​​взаимного ингибирования 9. Потому что эти интернейронов ингибировать swimmeret моторные нейроны напрямую, переменное движение PS-RS генерируется 10. Передвижение однако, не только требуют создания деятельности, но и координации различных независимых микросхем. В системе swimmeret такая координация устанавливается координационного микросхемы, которая гарантирует, что конечности являются активными в правильное время. Эта микросхема построена на трех определенных нейронов в каждом сегменте 11-15.

Этот протокол предусматривает гое первый раз шаг за шагом рассечение руководство, чтобы изолировать цепь ганглиев (T4 до A6, рис 1). Мы покажем, как прикрепить Изолированная абдоминальная нервный тяж и desheathe каждый ганглий. В этом изолированном препарате нервной системы, нейроны, отвечающие за движения swimmeret готовы для использования в электрофизиологических и морфологических экспериментов. Вторая часть этого протокола демонстрирует основные особенности swimmeret узором двигателя. Это включает в себя шаг за шагом руководство для внеклеточно записи активности swimmeret двигательных нейронов. Аксоны двигательных RS нейроны проецируются через передней ветви нерва N1, в то время как аксоны PS двигательных нейронов проекта через заднюю ветви одного и того же нерва (рис 1) 4. Поэтому их деятельность может быть записано от этих отраслей с помощью дифференциальных контактных электродов.

Рисунок 1<br/> Рисунок 1: Изолированные нервной системы от грудного ганглия 4 (Т4) в брюшной ганглий 6 (A6) и принципиальная схема, что Т4.: Грудной ганглий 4; T5: грудной ганглий 5; A1, A2 … A6 брюшной ганглий 1, брюшной ганглий 2 … брюшной ганглий 6; N1: нерв N1; N2: нерв N2; N3: нерв N3; PS: рабочий ход; RS: возвращение-тактный. Направленные сокращения: = Передняя; P = задний.

Эта процедура рассечение и электрофизиологические техника продемонстрировала удобны для студентов и могут дополнять студентов практические занятия по физиологии. Изолированные цепи ганглиев был использован в ряде экспериментов по изучению функции нервной системы, координацию, или модуляцию swimmeret микросхем 6, а также нейронную контроль адаптивного поведения в локомоции 16, 17. Таким образом, система раков swimmeret обеспечивает огромное количество интересной преподавательской или тдождь возможности, которые все начинаются с рассечением брюшной нервной раков и внеклеточной записи фиктивного узором двигателя.

Protocol

Эта процедура рассечение в соответствии с Директивой Европейского сообщества совета 22 сентября 2010 года (2010/63 / ЕС). 1. Подготовка Получить раков, Pacifastacus leniusculus (Дана), обоих полов ≥8 см в размере. Убедитесь, что животные имеют жизненно важное значение и для ж…

Representative Results

При одновременном внеклеточных записей с РС и ПС, моторных нейронов одного ганглия, переменный активность этих бассейнов двигательных нейронов, можно контролировать (рисунок 18), представляющая собой фиктивную картину передвижения. <img alt="Рисунок 18" src="/files/ftp_upload/…

Discussion

Анатомия рака и их животе ганглии было описано ранее 5, 18, ​​19, 20, и рекомендуется, чтобы ознакомиться с ними до вскрытия для того, чтобы избежать сокращения важных нервов.

Очень важно, чтобы препарат при температуре ниже 23 ° C для предотвращения деградации изолир…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Jos Бургерт за помощь некоторые цифры. Мы благодарны Инго Selbach (и группы "Edelkrebsprojekt NRW") за его усилия на поставку в лабораторию с экспериментальными животными. Мы благодарим Анну К. Шнайдер за вычитку первые версии рукописи. Это исследование было поддержано грант Эмми Нётер DFG SM 206 / 3-1 и запуска гранта университета Кельна для женской факультета.

Materials

Name of Material/ Equipment Tipo Company Catalog Number Comments/   Description
4-channel extracellular amplifier: MA 102  Amplifier Elektroniklabor, Zoologie, Universität zu Köln, Germany for extracellular recording
air-table Technical Manufacturing Corporation
(TMC) a unit of AMETEK Ultra Precision Technologies, Peabody, MA, USA
63-534 for intracellular recording
Axon Digidata 1440A Digitizer Axon Instruments, Molecular Devices Design, Union City, CA DD1440A digitizes recorded signals 
big bucket  filled with ice
Clampex & Clampfit pClamp 10, recording and analysis software Molecular Devices Design, Union City, CA pClamps 10 Standard for extracellular recording
cold lamp source with flexible light guide (fiber optic bundle)  Euromex microscopes holland, Arnhem, BD LE.5211 & LE.5235
computer and monitor equipped with recording software for extracellular recording
container and pipette for liquid waste 
crayfish saline  contains (in mM): 5.4 KCl, 2.6 MgCl2, 13.5 CaCl2, and 195 NaCl, buffered with 10mM Tris base and 4.7mM maleic acid; aerated for 3 hours. Adjust at pH of 7.4.  always keep at temperatures ~ 4° C
dextran, Texas Red (3000MW, lysine fixable) fluorescent dye, lysine fixable Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany D3328 for intracellular dyefill of neurons
differential pin electrodes made from stainless steel ɸ 0.2 mm for extracellular recording
dissection dish  (l x w x h) 15x7x5 cm; linned with black silicone used in the gross disection
faraday cage for extracellular recording
fixing pins for pinning the specimen
forceps (biology, Dumont #5) Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX Fine Science Tools (FST), Germany 11252-20 fine forceps: used to pick nerves
forceps (biology, Dumont #55) Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX Fine Science Tools (FST), Germany 11255-20 extra fine forceps: used for desheathing
forceps (electronic, Dumont #5) Forceps: Standard, tip 0.1 x 0.06 mm, length 11cm, INOX Fine Science Tools (FST), Germany 11251-20 coarse forceps:                          used to grab specimen and pins
intracellular electrode Borosilicate glass capillaries (outer/inner diameter: 1mm/0.5mm), with filament Sutter Instruments, Novato, CA BF100-50-10 for intracellular recording and dyefill of neurons
Leica S8 Apo StereoZoom Dissection Microscope                       Zoom 1x – 8x Leica, Germany 10446298 for extracellular recording
microscope table for extracellular recording
mirror to illuminate preparation from below for extracellular recording
modeling clay for extracellular recording
Olympus SZ61 Dissection Microscope                       Zoom 0.67x – 4.5x Olympus, Germany for the dissection
petri dish  94 x 16 mm; lined with clear silicone Greiner bio-one, Germany 633180 used to pin the isolated chain of ganglia
ring scissors ThoughCut, cutting edge: sharp/blunt, straight: 13cm Fine Science Tools (FST), Germany 14054-13 for gross dissection                    (steps 2.1 – 2.11)
saline dispenser  with a 16 gauge needle (outer ɸ 1.6mm) attached via a flexible tube. Volume ~ 60ml, used for exsanguination
spring scissors or alternative: Vannas spring scissors cutting edge: 8 mm, tip diameter: 0.2mm, straight: 10cm or cutting edge 2.5 mm, tip diameter 0.075 mm, straight: 8cm Fine Science Tools (FST), Germany 15024-10 or          15000-08 for desheathing 
stainless steel wire ɸ 0.125 mm  to cut pins of 4-7 mm length Goodfellow GmbH, Bad Nauheim, Germany for pinning of the nerve cord
student Vannas  spring scissors or alternative:  Moria Spring Scissors cutting edge: 5mm, tip diameter: 0.35mm, straight: 9cm or cutting edge: 5mm, tip diameter 0,1 mm, straight: 8 cm Fine Science Tools (FST), Germany 91500-09 or           15396-00 for gross and fine disection        (steps 2.11 – 3.14)
sylgard 184 Silicone Elastomer Base and Curing Agent; for black sylgard add activated carbon Dow Corning, Midland, MI, USA
syringe filled with petroleum jelly and equipped with a 20 gauche needle with rounded tip for extracellular recording

Riferimenti

  1. Hughes, G. M., Wiersma, C. A. G. The Co-Ordination of Swimmeret Movements in the Crayfish, Procambarus-Clarkii (Girard). J Exp Biol. 37 (4), 657-670 (1960).
  2. Mulloney, B., Smarandache, C. Fifty Years of CPGs: Two Neuroethological Papers that Shaped the Course of Neuroscience. Front Behav Neurosci. 4, 45 (2010).
  3. Murchison, D., Chrachri, A., Mulloney, B. A Separate Local Pattern-Generating Circuit Controls the Movements of Each Swimmeret in Crayfish. J Neurophys. 70 (6), 2620-2631 (1993).
  4. Mulloney, B., Hall, W. M. Functional organization of crayfish abdominal ganglia. III. Swimmeret motor neurons. J Comp Neurol. 419 (2), 233-243 (2000).
  5. Davis, W. J. Lobster Righting Responses and Their Neural Control. Proc R Soc Ser B-Bio. 170 (1021), 435-456 (1968).
  6. Mulloney, B., Smarandache-Wellmann, C. Neurobiology of the crustacean swimmeret system. Prog Neurobiol. 96 (2), 242-267 (2012).
  7. Huxley, T. H. . The crayfish: An introduction to the study of zoology. , (1980).
  8. Smarandache-Wellmann, C., Weller, C., Wright, T. M., Mulloney, B. Five types of nonspiking interneurons in local pattern-generating circuits of the crayfish swimmeret system. J Neurophys. 110 (2), 344-357 (2013).
  9. Skinner, F. K., Mulloney, B. Intersegmental coordination of limb movements during locomotion: mathematical models predict circuits that drive swimmeret beating. J Neurosci. 18 (10), 3831-3842 (1998).
  10. Mulloney, B. During fictive locomotion, graded synaptic currents drive bursts of impulses in swimmeret motor neurons. J Neurosci. 23 (13), 5953-5962 (2003).
  11. Smarandache-Wellmann, C., Grätsch, S. Mechanisms of coordination in distributed neural circuits: Encoding coordinating information. J Neurosci. 34 (16), 5627-5639 (2014).
  12. Mulloney, B., Hall, W. M. Local commissural interneurons integrate information from intersegmental coordinating interneurons. J Comp Neurol. 466 (3), 366-376 (2003).
  13. Mulloney, B., Harness, P. I., Hall, W. M. Bursts of information: Coordinating interneurons encode multiple parameters of a periodic motor pattern. J Neurophys. 95 (2), 850-861 (2006).
  14. Smarandache, C., Hall, W. M., Mulloney, B. Coordination of Rhythmic Motor Activity by Gradients of Synaptic Strength in a Neural Circuit That Couples Modular Neural Oscillators. J Neurosci. 29 (29), 9351-9360 (2009).
  15. Smarandache-Wellmann, C., Weller, C., Mulloney, B. Mechanisms of Coordination in Distributed Neural Circuits: Decoding and Integration of Coordinating Information. J Neurosci. 34 (3), 793-803 (2014).
  16. Chrachri, A., Neil, D., Mulloney, B. State-Dependent Responses of 2 Motor Systems in the Crayfish, Pacifastacus leniusculus. J Comp Physiol A. 175 (3), 371-380 (1994).
  17. Chrachri, A., Neil, D. M. Interaction and Synchronization between 2 Abdominal Motor Systems in Crayfish. J Neurophys. 69 (5), 1373-1383 (1993).
  18. Skinner, K. The Structure of the 4th Abdominal-Ganglion of the Crayfish, Procambarus-Clarki (Girard) II. Synaptic Neuropils. J Comp Neurol. 234 (2), 182-191 (1985).
  19. Skinner, K. The Structure of the 4th Abdominal-Ganglion of the Crayfish, Procambarus-Clarki (Girard) I. Tracts in the Ganglionic Core. J Comp Neurol. 234 (2), 168-181 (1985).
  20. Mulloney, B., Tschuluun, N., Hall, W. M. Architectonics of crayfish ganglia. Microsc Res Techniq. 60 (3), 253-265 (2003).
  21. Braun, G., Mulloney, B. Cholinergic modulation of the swimmeret motor system in crayfish. J Neurophys. 70 (6), 2391-2398 (1993).
  22. Davis, W. J. Motoneuron Morphology and Synaptic Contacts – Determination by Intracellular Dye Injection. Science. 168 (3937), 1358-1360 (1970).
  23. Altman, J. S., Tyrer, N. M., Strausfeld, N. J., Miller, T. A. Filling Selected Neurons with Cobalt through Cut Axons. Neuroanatomical Techniques. , 373-402 (1980).

Play Video

Citazione di questo articolo
Seichter, H. A., Blumenthal, F., Smarandache-Wellmann, C. R. The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern. J. Vis. Exp. (93), e52109, doi:10.3791/52109 (2014).

View Video