تحفيز Optogenetic من العصب السمعي
Summary
زراعة قوقعة (CIS) تمكين السمع بواسطة التنبيه الكهربائي المباشر من العصب السمعي. ومع ذلك، وضعف وتيرة وشدة قرار يحد من جودة السمع مع رابطة الدول المستقلة. نحن هنا وصف optogenetic تحفيز العصب السمعي في الفئران باعتبارها استراتيجية بديلة للبحث السمعي وتطوير التهيئة المستقبلية.
Abstract
التحفيز الكهربائي المباشر من الخلايا العصبية العقدة الحلزونية (SGNs) من خلال زراعة قوقعة (CIS) يتيح الفهم خطاب مفتوح في غالبية المواضيع صماء مزروع 1- 6. ومع ذلك، ترميز الصوت مع التهيئة الحالية لديه ضعف وتيرة وشدة قرار بسبب انتشار واسع الحالي من كل اتصال القطب تفعيل عدد كبير من SGNs على طول محور التوضع النغمي من القوقعة 7- 9. ويقترح التحفيز البصري كبديل لالتحفيز الكهربائي الذي يعد أكثر مكانيا تنحصر تفعيل SGNs، وبالتالي، قرار تردد أعلى من الترميز. في السنوات الأخيرة، وقد استخدمت الإضاءة بالأشعة تحت الحمراء مباشرة من القوقعة لاستحضار الردود في العصب السمعي 10. ومع ذلك فإنه يتطلب طاقات أعلى من التحفيز الكهربائي 10،11 وعدم اليقين لا يزال لآلية الكامنة 12. نحن هنا تصف طريقة استنادا optogenetics لتحفيز SGNsمع كثافة منخفضة الضوء الأزرق، وذلك باستخدام الفئران المعدلة وراثيا مع التعبير العصبية من channelrhodopsin 2 (ChR2) 13 أو التعبير بوساطة فيروس من قبض ChR2-البديل 14. كنا ضوء الصغير الثنائيات (μLEDs) وأشعة الليزر، بالإضافة إلى تحفيز ألياف SGNs، معربا عن ChR2 من خلال فتحة صغيرة الاصطناعي (فغر القوقعة) أو إطار جولة. نحن يعاير ردود التسجيلات فروة الرأس من إمكانات أثار ضوئية (optogenetic استجابة الدماغ السمعية: oABR) أو عن طريق التسجيلات مسرى مكروي من المسار السمعي وقارنوها مع التحفيز الصوتية والكهربائية.
Introduction
وفقا لمنظمة الصحة العالمية، 360 مليون شخص في العالم يعانون من فقدان السمع. في موضوعات صماء، التحفيز الكهربائي المباشر للSGNs بواسطة التهيئة تمكين الفهم خطاب مفتوح في أغلبيتهم 1،2،4،5. على الرغم من التهيئة تم زرعها في أكثر من 200،000 شخص، وبالتالي كونها neuroprosthesis أنجح، ترميز الصوت مدفوعا زراعة قوقعة الحالية محدودة. تستند التهيئة على التحفيز الكهربائي من قبل عدد معين من الأقطاب الكهربائية حيث كل واحد ينشط منطقة التوضع النغمي من العصب السمعي وبالتالي تجاوز الجهاز الحسي مختلة كورتي في القوقعة. يمكن المستمعين السمع يميز أكثر من 2،000 الترددات، لكن استخدام عناصر التهيئة اليوم فقط ما يصل الى 12-22 تردد القنوات 4. هذا يرجع إلى تدفق التيار الكهربائي على نطاق واسع من كل 7،9 تحفيز وتفعيل عدد كبير من SGNs التي تمثل العديد من الترددات الصوتية المختلفة 8،15. هذايمكن تحسين الحد باستخدام التحفيز متعدد الأقطاب ولكن على حساب زيادة استهلاك الطاقة 16،17. على النطاق الديناميكي الناتج عن شدة الصوت محدودة أيضا، وعادة أقل من 4،18 ديسيبل 6-20. لهذه الأسباب، وتحسين وتيرة وشدة قرار هي أهداف هامة لزيادة أداء CI لتحسين التعرف على الكلام في البيئات الصاخبة، فهم علم العروض والموسيقى التصور.
وثمة خيار آخر لتحفيز العصب السمعي هو التحفيز البصري. الضوء يمكن أن تركز بشكل ملائم لاستهداف السكان SGN صغير، واعدا الحبس المكاني أفضل، وزيادة وتيرة وأيضا قرار توسيع النطاق الديناميكي، مما أدى إلى قرار كثافة أفضل. في الواقع، أظهرت التحفيز القوقعي مع ضوء الأشعة تحت الحمراء قرار تردد ممتازة في النماذج الحيوانية 10،11،19. ومن عيوب هذا النوع من التحفيز هو أنه يتطلب طاقات أعلى من التحفيز الكهربائي <sup> و10،11. وعلاوة على ذلك، أثيرت مخاوف بشأن قدرة طريقة لتحفيز الخلايا العصبية السمعية 12،20 مباشرة.
كبديل لتحفيز الأشعة تحت الحمراء، ونحن توظيف optogenetics لتقديم SGNs ضوء حساسية. Optogenetics هو النهج الجديد الذي يجمع بين التقنيات الوراثية والبصرية لغير جراحية وتحديدا السيطرة على الخلايا بدقة عالية الزمنية (مراجعات 21- 23). طريقة حاليا الأكثر استخداما توظف التعبير عن الميكروبي channelrhodopsin 2 (ChR2) الجين من كلاميدوموناس reinhardtii ومتغيراتها، ترميز قناة الموجبة بوابات الخفيفة 24. ChR2 هو بروتين 7 عبر الغشاء الحلزوني أنه عندما transduced في الخلايا العصبية وتفعيلها من خلال الضوء الأزرق، تعمل قناة الموجبة وغير انتقائية، وبالتالي إزالة إستقطاب الخلايا 24- 27. تم ChR2 تتميز كذلك 24،28- 31 و وقد وضعت العديد من المتغيرات لتعديل التدبير العمومين الطيف، النابضة ونفاذية خصائص 32،33. والهدف من عملنا هو إنشاء optogenetics القوقعة لتفعيل المسار السمعي. نلاحظ أن النهج optogenetic لتحفيز العصب السمعي يتطلب التلاعب الجيني للالعقدة الحلزونية للتعبير عن channelrhodopsin. العمل مع الفئران والجرذان يسمح باستخدام حيوانات معدلة وراثيا المتاحة 13،34،35، والتي توفر التعبير عن channelrhodopsin مع تقلب قليلا على طول محور التوضع النغمي وعبر الحيوانات 36. الجمع بين الأليلات الشرطية المناسبة مع 37 لجنة المساواة العرقية خطوط يوفر للتعبير عن خلية محددة. نقل الجينات إلى العقدة دوامة من الحيوانات الأخرى يتطلب استخدام فيروس مثل فيروس الغدة المرتبطة وهذا هو نهج موحد في optogenetics 38 وأننا أظهرنا للعمل بشكل جيد في الفئران 36. التلاعب الجيني والتعبير عن الجينات المحورة ترميز البروتينات الغريبة المخاطر الدب الآثار الضارة مثل immuردود شمال شرق و / أو انتشار، حالة خطر أو حتى موت خلايا التلاعب وراثيا. لغرض هذه المظاهرة نستخدم الفئران المعدلة وراثيا معربا عن ChR2 الخلايا العصبية في العقدة الحلزونية تحت PROMOTOR خاصتك-1 13 إلى تحفيز بصريا المسار السمعي. نلاحظ أن المتغيرات channelrhodopsin أخرى يمكن استخدامها لنفس الغرض كما أثبتنا باستخدام نقل الفيروس بوساطة من الصيد البديل 14 إلى 39 SGNs.
بينما optogenetics القوقعة يتطلب التلاعب الجيني، فإنه يوفر ضبط الجزيئي لتحسين SGN التحفيز والوعود تحسين تواتر وشدة قرار بالمقارنة مع التحفيز الكهربائي. التحفيز Optogenetic من المسار السمعي هو ذات الصلة للغاية لأبحاث السمع. على سبيل المثال، يعد التقدم في دراسات صقل تعتمد على النشاط tonotopy من خلال التنمية، في تحليل متطلبات الاندماج الطيفي في localizat الصوتايون ومدى التفاعل بين التوقعات تردد محدد وارد في النظام السمعي المركزي.
Protocol
Representative Results
Discussion
وصف التجارب تثبت التحفيز optogenetic من SGNs، ويمكن، من حيث المبدأ، يمكن استخدامه أيضا لتحفيز خلايا الشعر الداخلية و / أو الخارجية، قدمت التعبير عن opsins. هذه التجارب تتطلب الكثير من الصبر والرعاية. كما ذكر من قبل، الخطوات الأكثر أهمية هي جيدة فغر القوقعة / جولة نافذة الإدراج ف…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل الوزارة الاتحادية الألمانية للتعليم والبحوث (بيرنشتاين التركيز العصبية لمنح 01GQ0810، لT. موسر، وMED-EL ألمانيا)؛ المؤسسة الألمانية للبحوث من خلال مركز النانو المجهري وعلم وظائف الأعضاء الجزيئية في الدماغ (FZT 103، T. موزر) ومن خلال SFB889، لN. Strenzke وT. موزر).
Materials
| Urethane | Sigma Aldrich | U2500-100G | Anesthetic |
| Xylazine HCl | RXV | Sedative and analgesic | |
| Buprenorphine | Reckitt Benckiser | Analgesic | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | It is used to hold hard tissue, e.g. bone or materials. Never use them to hold soft delicated tissue |
| Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Only to be used to hold soft tissue |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | To open the skin and help with the muscle dissection |
| Lempert Rongeurs | Fine Science Tools | 16004-16 | They are very useful to easily remove the bone from the bulla |
| 473-nm laser | Changchun New Industries | MLL-III473 | 100 mW solid state 473 nm laser |
| Laser driver | Changchun New Industries | DPSSL MLL 100 mW | TTL operated laser driver |
| 250 µm optical fiber | Any comercial ; e.g. Thorlabs | M42L05 | |
| Acousto-optical modulator | Crystal Technology, Inc. | PCAOM VIS | Control the amount of light coupled into the fiber from the laser |
| Controller for Acousto-optical modulator | Crystal Technology, Inc. | 160T1-8SAR-24-0.8 | Control the acousto-optic modulator |
| Solo2 laser power & energy meter | Gentec-EO | Used to measure light intensity of the LED and the fiber coupled laser | |
| Blue µLED | Cree | C470UT200 | It is necessary to build several μLED devices because easily get damaged or the isolation is not good enough |
| TDT System | Tucker-Davis Technologies | RZ6-A-P1 | It can be used any system for stimulus generation presentation and data acquisition |
| Single-shank, 16-channel silicon probe | Neuronexus | a1x16-5mm-100-177-CM16LP | These are fragile devises, must be handled carefully and cleaned after use |
| Omnidrill | World Precision Instruments | 503598 | Perform craniotomy for IC recordings and reference screw implantation |
| Micro Drill Steel Burrs | any commercial; e.g. Fine Science Tools | 19007-07 | |
| Self tapping bone screw | any commercial; e.g. Fine Science Tools | 19010-10 | Reference screw |
| Micromanipulator | any commercial; e.g. Luigs+NeumannInVivo Unit Junior 4 axis | Positioning of recording probe |
Riferimenti
- Rubinstein, J. T. Paediatric cochlear implantation: prosthetic hearing and language development. Lancet. 360 (9331), 483-485 (2002).
- Middlebrooks, J. C., Bierer, J. A., Snyder, R. L. Cochlear implants: the view from the brain. Current opinion in neurobiology. 15 (4), 488-493 (2005).
- Clark, G. M. The multiple-channel cochlear implant: the interface between sound and the central nervous system for hearing, speech, and language in deaf people-a personal perspective. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 361 (1469), 791-810 (2006).
- Zeng, F. G., Rebscher, S., Harrison, W., Sun, X., Feng, H. Cochlear implants: system design, integration, and evaluation. IEEE reviews in biomedical engineering. 1, 115-142 (2008).
- Wilson, B. S., Dorman, M. F. Cochlear implants: a remarkable past and a brilliant future. Hearing research. 242 (1-2), 3-21 (2008).
- Moore, D. R., Shannon, R. V. Beyond cochlear implants: awakening the deafened brain. Nature neuroscience. 12 (6), 686-691 (2009).
- Shannon, R. V. Multichannel electrical stimulation of the auditory nerve in man. II. Channel interaction. Hearing research. 12 (1), 1-16 (1983).
- Fishman, K. E., Shannon, R. V., Slattery, W. H. Speech recognition as a function of the number of electrodes used in the SPEAK cochlear implant speech processor. Journal of speech, language, and hearing research: JSLHR. 40 (5), 1201-1215 (1997).
- Kral, A., Hartmann, R., Mortazavi, D., Klinke, R. Spatial resolution of cochlear implants: the electrical field and excitation of auditory afferents. Hearing research. 121 (1-2), 11-28 (1998).
- Izzo, A. D., Suh, E., Pathria, J., Walsh, J. T., Whitlon, D. S., Richter, C. P. Selectivity of neural stimulation in the auditory system: a comparison of optic and electric stimuli. Journal of biomedical. 12 (2), 021008 (2007).
- Richter, C. P., Rajguru, S. M., et al. Spread of cochlear excitation during stimulation with pulsed infrared radiation: inferior colliculus measurements. Journal of neural engineering. 8 (5), 056006 (2011).
- Teudt, I. U., Maier, H., Richter, C. P., Kral, A. Acoustic events and “optophonic” cochlear responses induced by pulsed near-infrared laser. IEEE transactions on bio-medical engineering. 58 (6), 1648-1655 (2011).
- Wang, H., et al. High-speed mapping of synaptic connectivity using photostimulation in Channelrhodopsin-2 transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (19), 8143-8148 (2007).
- Kleinlogel, S., Feldbauer, K., et al. Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca2+-permeable channelrhodopsin CatCh. Nature neuroscience. 14 (4), 513-518 (2011).
- Friesen, L. M., Shannon, R. V., Baskent, D., Wang, X. Speech recognition in noise as a function of the number of spectral channels: comparison of acoustic hearing and cochlear implants. The Journal of the Acoustical Society of America. 110 (2), 1150-1163 (2001).
- Donaldson, G. S., Kreft, H. A., Litvak, L. Place-pitch discrimination of single- versus dual-electrode stimuli by cochlear implant users (L). The Journal of the Acoustical Society of America. 118 (2), 623-626 (2005).
- Srinivasan, A. G., Shannon, R. V., Landsberger, D. M. Improving virtual channel discrimination in a multi-channel context. Hearing research. 286 (1-2), 19-29 (2012).
- Zeng, F. G., et al. Speech dynamic range and its effect on cochlear implant performance. The Journal of the Acoustical Society of America. 111 (1 Pt 1), 377-386 (2002).
- Matic, A. I., Walsh, J. T., Richter, C. P. Spatial extent of cochlear infrared neural stimulation determined by tone-on-light masking. Journal of biomedical. 16 (11), 118002 (2011).
- Verma, R., Guex, A. A., et al. Auditory responses to electric and infrared neural stimulation of the rat cochlear nucleus. Hearing research. 310, 69-75 (2014).
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annual review of neuroscience. 34, 389-412 (2011).
- Hegemann, P., Nagel, G. From channelrhodopsins to optogenetics. EMBO molecular medicine. 5 (2), 173-176 (2013).
- Packer, A. M., Roska, B., Häusser, M. Targeting neurons and photons for optogenetics. Nature neuroscience. 16 (7), 805-815 (2013).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Nagel, G., Szellas, T., Kateriya, S., Adeishvili, N., Hegemann, P., Bamberg, E. Channelrhodopsins: directly light-gated cation channels. Biochemical Society transactions. 33 (Pt 4), 863-866 (2005).
- Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Current biology: CB. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Bamann, C., Kirsch, T., Nagel, G., Bamberg, E. Spectral characteristics of the photocycle of channelrhodopsin-2 and its implication for channel function. Journal of molecular biology. 375 (3), 686-694 (2008).
- Ritter, E., Stehfest, K., Berndt, A., Hegemann, P., Bartl, F. J. Monitoring light-induced structural changes of Channelrhodopsin-2 by UV-visible and Fourier transform infrared spectroscopy. The Journal of biological chemistry. 283 (50), 35033-35041 (2008).
- Berndt, A., Prigge, M., Gradmann, D., Hegemann, P. Two open states with progressive proton selectivities in the branched channelrhodopsin-2 photocycle. Biophysical journal. 98 (5), 753-761 (2010).
- Kato, H. E., et al. Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel. Nature. 482 (7385), 369-374 (2012).
- Hegemann, P., Möglich, A. Channelrhodopsin engineering and exploration of new optogenetic tools. Nature methods. 8 (1), 39-42 (2011).
- Mattis, J., Tye, K. M., et al. Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins. Nature methods. 9 (2), 159-172 (2012).
- Arenkiel, B. R., Peca, J., et al. In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Transgenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2. Neuron. 54 (2), 205-218 (2007).
- Tomita, H., Sugano, E., et al. Visual Properties of Transgenic Rats Harboring the Channelrhodopsin-2 Gene Regulated by the Thy-1.2 Promoter. PLoS ONE. 4 (11), e7679 (2009).
- Hernandez, V. H., et al. Optogenetic stimulation of the auditory pathway. The Journal of clinical investigation. 124 (3), 1114-1129 (2014).
- Madisen, L., Mao, T., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nature Neuroscience. 15 (5), 793-802 (2012).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Hernandez, V. H., et al. Optogenetic stimulation of the auditory pathway. The Journal of clinical investigation. 124 (3), 1114-1129 (2014).
- Gunaydin, L. A., Yizhar, O., Berndt, A., Sohal, V. S., Deisseroth, K., Hegemann, P. Ultrafast optogenetic control. Nature neuroscience. 13 (3), 387-392 (2010).
- Klapoetke, N. C., Murata, Y., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature methods. 11 (3), 338-346 (2014).
