A Manual Small Molecule Screen Naderend High-throughput Met behulp van zebravis embryo's

Chemische genetica in de zebravis kan een belangrijke invloed hebben op de progressie van drug discovery maken. Dit protocol biedt een handmatige high-throughput methode om chemische genetica presteren in de zebravis embryo's met een WISH uitlezing, effectief waardoor een individu of een klein team aan een klein molecuul scherm uit te voeren. Dit minimal-resource methode breidt de haalbaarheid van chemische genetica aan vele onderzoeksgroepen. Specifiek deze strategie scherm geeft een belangrijk alternatief voor het gebruik van robotachtige instrumenten, zoals zulke systemen niet breed toegankelijke over onderzoeksgroepen. Dit handbediend scherm kan één individu om een ​​96 wells plaat van verbindingen te testen met een WISH uitlezing in een 6 daagse werkweek. Omdat zebravis zijn ovipaar, de embryo ontwikkeling buiten de ouder, en de embryo's zijn groot genoeg om met het blote oog (tussen 1-3 mm), zijn ze vatbaar voor het hanteren met eenvoudige instrumenten en de onderzoeker kan reeks monstersmeerputjesplaten zonder gebruik van een microscoop. Aangezien verder zebravis snel ontwikkelen, kleine molecule blootstelling effectief met een enkele behandeling van een verbinding, in plaats herhaalde doses, die verder handmatige verwerking minimaliseert zijn. Zebravis embryo's zijn gemakkelijk gekweekt omdat hun dooier biedt een bron van voeding tot 5-6 dagen na de bevruchting, waarbij de complicatie van bak voeden elimineert. Bovendien is de meerderheid van de larvale organen ontwikkeld en functioneel worden tijdens deze periode, die de mogelijkheid om een ​​breed scala van onderzoeksvragen bestuderen levert. De eenvoudige toevoeging van kleine moleculen de embryo incubatiemedium niet-invasief en kan de onderzoeker (s) te kiezen voor drug dosis, tijdstip van toevoeging en de duur van de blootstelling, waardoor strakke controle over vele variabelen en waarbij specifieke ontwikkelingsprocessen van belang om te worden bevraagd. Zoals hier beschreven, kunnen aanzienlijke onderzoeksproductiviteit in een korte timefr bereiktame met behulp van deze handleiding scherm methodologie. In onze ervaring is een hoog rendement op het ingelegde inzet, die kan worden verkregen door een bekende bioactieve chemische bibliotheek een werkwijze van belang, zoals nefron segmentatie tijdens renale ontwikkeling ervan (figuur 4; Poureetezadi en Wingert, ongepubliceerd).

De handleiding chemische scherm hier beschreven is bijzonder veelzijdig omdat het gaat om een ​​test op vaste exemplaren zebravis. Bijvoorbeeld kan deze strategie worden herzien om verschillende platen van testverbindingen in een week en daarna embryo's score van de volgende week. Alternatieve assays op vaste zebravis monsters, zoals immunohistochemie of ander weefsel kleuring preparaten kunnen ook worden vervangen door de WISH uitlezing. Experimentele strategieën uitvoeren cellulaire assays zebravis aanpasbaar door de optische helderheid en transparantie van de vroege ontwikkelingsstadia. Verder kunnen onderzoekers remmen pigmentatie bij later stages gebruik van chemicaliën of te vermijden de complicatie van pigment ontwikkeling helemaal door het gebruik van pigment-minder genetische lijnen zoals casper of pure zebravis ^13. Het is mogelijk om kleine moleculen handmatig beheren, verwerken de vlek (s) van belang, en handmatig scoren embryo's met behulp van een eenvoudige stereomicroscoop. Het is echter belangrijk om in gedachten te houden dat geautomatiseerde beeldanalyse kan worden uitgevoerd, en kan in feite worden verlangd voor hoge resolutie fenotype analyse. Zo kan het de voorkeur om samen een geautomatiseerd systeem voor beeldanalyse met een directe test, zoals een transgene reporter, omdat dit stroomlijnt de handmatige verwerking van monsters, kwantificeert verschillen niet gemakkelijk te onderscheiden met het blote oog, en elimineert onderzoeker vooringenomenheid ^15. Gelukkig is een aantal geautomatiseerde imaging systemen zijn zowel gebruiksvriendelijk en zuinig in termen van software kosten ^15. Het gebruik en de mogelijkheden van andere geautomatiseerde systemen zich snel hebben ontwikkeld en kanworden gebruikt om te oriënteren organismen, beheren behandelingen met medicijnen, en zelfs te verhuizen organismen ^12,15. Deze geautomatiseerde systemen hebben een nieuw technologisch tijdperk van onderzoek aangekondigd en hebben innovatieve oplossingen voorzien om grote hoeveelheden van proefpersonen te manipuleren en dus HTS voeren en HCS benaderingen in de gehele organismen ^12,15. Hoewel dergelijke machines zijn onmiskenbaar handige tools, ze zijn ook zeer kostbaar en zijn buiten het bereik van vele fundamentele onderzoekslaboratoria. Zonder toegang tot deze geautomatiseerde functies het lijkt chemische schermen zijn niet mogelijk. Echter, dit protocol schetst een handleiding voor hoe je een handbediend scherm dat kan worden gebruikt om een ​​scherm van chemische genetica te voltooien op een praktische manier over een redelijke termijn uit te voeren.

Nadelen voor zowel handmatige screening en chemische genetica in het algemeen bestaan, en moet in gedachten worden gehouden bij het overwegen van een chemische scherm. In het bijzonder, de werkwijze hier aangetoond vereist enige matevan fysieke behendigheid. Deze zorg is verminderd of geheel ondervangen door herhaling, zoals behendigheid zal verbeteren met de praktijk. Daarnaast is er een minimale ruimte voor grove fout, want er zijn slechts 10 embryo's per goed voor analyse. Kleine moleculen kunnen variëren in de penetrantie van het fenotype dat wordt opgewekt, zodat een redelijk scorende regime om verbindingen van belang moeten worden nageleefd om te identificeren. Het is van vitaal belang dat de onderzoekers met behulp van dit protocol te bedenken voldoende strenge criteria voor wat ze een hit zal overwegen. Het is ook belangrijk om in gedachten te houden dat de aard van deze vorm van scherm een ​​bepaald gedeelte van valse positieven die worden afgebakend door verdere chemische opwerking waarschijnlijk zal opleveren. Verder, is het essentieel om embryo nauwkeurig fase en koppelingen voor screening verzamelen kort na de bevruchting, zoals asynchrone ontwikkeling kan leiden tot complicaties in het effect van behandeling met geneesmiddelen nauwkeurig evalueren. Verder, met betrekking tot chemische screening afperimental strategie, zijn er tal van beperkingen. Verbinding oplosbaarheid en toxiciteit van dragermoleculen (bijvoorbeeld dimethylsulfoxide (DMSO)) kan ook een probleem oplevert en prohibitief in testen vele moleculen. Het chorion kan ook fungeren als barrière voor blootstelling aan het geneesmiddel. Tenslotte, terwijl zebravis is een krachtige en translationele model chemische genetica erop moet altijd bij het ​​bepalen of een andere chemische screen strategie, bijvoorbeeld met een in vitro systeem taken zoals een cellijn, kan vervangen het gebruik van hele dieren. Niettemin is chemische behandeling het gehele zebravis systeem beschouwd voorkeur geleidende soortgelijke aanpak in zoogdieren, omdat het het voordeel van het verzamelen van de systemische effecten van de verbindingen en kunnen onderzoekers door de lijst van te onderzoeken verbindingen in een zoogdiermodel triage.

Tot op heden hebben de zebravis chemische schermen voorzien van een krachtige experimentele instrument to bakenen de mechanismen van ontwikkeling en kandidaat farmacologische middelen bepalen voor gebruik in de geneeskunde, zoals de identificatie van moleculen die in staat profylactische pathologieën. Bijvoorbeeld, een studie van Burns en collega's ontwikkelden een geautomatiseerde micro-well assay hartfrequentie transgene zebravis embryo die GFP tot expressie gebracht in het myocardium ^42. Ze gebruikten deze transgene lijn om de hartslag in de ontwikkeling te analyseren en hoe het werd beïnvloed op de behandeling met geneesmiddelen ^42. Een andere studie, door het testen van de bevolkingsdichtheid van hematopoietische stamcellen in het zebravis embryo, vastgesteld prostaglandine E2 regelt de HSC niche ^23. Deze bevinding werd bevestigd in de muis, en werd later geïmplementeerd voor klinische tests in de menselijke navelstreng transplantaties ^23,31-33 (NIH, Clinical Trials.gov, NCT00890500; NCT01627314). Door middel van een aantal recente studies, heeft de chemische genetica bewezen nuttig bij het bestuderen van nierziekte met behulp van de zebravis te zijn <sup> 43. De zebravis nier biedt een uitstekend paradigma voor nefrogenese of regeneratie van het nefron, de functionele eenheid die de nier bestaan ​​tijdens de ontwikkeling en acute nierschade ⁴³ bestuderen. Nefron structuur is sterk geconserveerd tussen de zebravis embryonale nier en de volwassen zoogdieren nier ^44-50. Verschillende studies naar de zebravis embryonale nier illustreren duidelijk zijn inherente translationeel potentieel wanneer gekoppeld aan chemische genetica. Een scherm chemische genetica werd uitgevoerd op twee zebravis mutanten die werden toegewezen aan de genen PKD2 en ift172, waarvan bekend is dat belangrijke spelers in polycystische nierziekte (PKD) ³⁴ zijn. Het scherm resulteerde in het identificeren van de pan-histon deacetylase (HDAC) remmer trichostatine A (TSA) als een klein molecuul dat de morfologische defecten normaal gezien in de mutante embryo kon neutraliseren. Een andere aanpak van de Groh en collega's gescreend op verbindingen die Induced oedeem in wild-type zebravis embryo's, die een verstoring van de nierfunctie ³⁵ zou aangeven. Na het identificeren PTBA een hit, zij opgemerkt dat naast het veroorzaken oedeem, PTBA verhoogde ook de expressie van pax2a, een marker van renale voorlopers. Belangrijk is dat een geoptimaliseerde afgeleide van PTBA vervolgens aangetoond dat het percentage fataliteit van volwassen zebravissen die-gentamicine geïnduceerde nierschade onderging en bovendien versneld het herstel van muizen die lijden van nierschade ²⁷ verlagen. Tezamen bieden deze bijdragen van de zebravis chemische genetica showcase van de types van ontdekkingen die gemaakt kunnen worden met behulp van de in dit protocol beschreven methode.

Terwijl chemische genetica onderzoek draagt ​​substantieel verdienste, het is niet zonder bepaalde uitdagingen. Uitsluitend een chemisch genetische benadering kan het ingewikkeld om het specifieke gen of genen die worden beïnvloed door een verbinding te bepalen. Zelfs als een doel (en) wordt gevonden, een significant kloof kan tussen identificatie verbinding en het begrijpen van het mechanisme (s) van de actie waarbij het kleine molecuul gedraagt ​​blijven. Bijvoorbeeld, kan het moeilijk zijn om het mechanisme waarin een klein molecuul optreedt omdat een enkele verbinding kan hebben een aantal verschillende effecten in een organisme te bepalen. Echter, met de komst van nieuwe technologieën en chemische genetische screens in zebravis voltooid, het probleem van het bepalen van een mechanisme krimpt. Een methode om te bepalen de moleculaire effecten van die verbindingen om een ​​geneesmiddel bibliotheek van bekende bioactieve voor screening, waarbij eventueel mechanismen kunnen worden afgeleid uit eerder geannoteerde gegevens te selecteren. Daarnaast chemoinformatic algoritmes, zoals Discovery poort, zijn beschikbaar voor gebruik dat structurele overeenkomsten van een verbinding met een database van verbindingen kunnen vergelijken met toegeschreven mechanismen ^14. Nog een andere manier om het mechanisme van een verbinding helderen zou een micr genererenoarray profiel na behandeling en ondervraag dit profiel in een compilatie van microarray geneesmiddel profielen, zoals Connectivity kaart, zoekt mechanistisch gedefinieerde verbindingen die een soortgelijk effect ¹⁴ wekken. Deze benadering kan ook worden gebruikt om genetisch mutanten met een soortgelijk effect als de verbinding van belang te identificeren. Het vinden van een verbinding tussen een verbinding en een mutant zou kunnen suggereren dat de verbinding werkt moleculair stroomopwaarts of stroomafwaarts van de bijbehorende gen, die kunnen worden afgebakend door behandeling van de mutanten met de verbinding en morpholinos. Een andere optie zou massaspectrometrie, die blijft meer geoptimaliseerd voor zebravis te worden. Deze methode kan worden gebruikt om specifieke wijzigingen eiwit of post-translationele modificaties na behandeling met geneesmiddelen bakenen. Tot slot, kleine moleculen of zelfs hele bibliotheken zijn soms gemerkt kan worden voor pull-down van bindende partners. Het is ook vermeldenswaard, dat, terwijl het mechanisme van hoe een klein molecuul functies is significante invoer, er FDA goedgekeurde geneesmiddelen waarvoor de mechanismen onbekend.

Hoewel zebravis vertonen veel overeenkomsten zoogdieren zowel genetisch en fysiologisch, er nog steeds een probleem geneesmiddel crossover ^14. Een studie onderzocht de crossover vermogen van de hits van een scherm voor celcyclus inhibitoren in de zebravis embryo's ^50. Het scherm resulteerde in de identificatie van 14 hits die voordien onbekend celcyclus bezitten waren. Van deze 14 verbindingen, 6 bleken celcyclus activiteit in menselijke en zebravis celkweektests, 3 werden geïnactiveerd serum in celkweek assays, 1 was alleen actief in zebravis cellen en 4 hadden geen activiteit in beide zebravis of humane celkweek assays, maar alleen in de zebravis hele organisme. Met name de verbindingen die 4 hadden alleen activiteit in de zebravis blijkt dat er verschillen tussen zebravis en zoogdieren die kunnen prohibeet de translationele vermogen van sommige verbindingen. Dit is een belangrijke overweging bewust van, maar er zijn voorbeelden van kleine moleculen, zoals _PGE2 die het vermogen van HSCs om engraft menselijke ontvangers en PTBA-derivaten die de mate van renale herstel in zoogdieren te verbeteren versterkt, waardoor het bewijs te van principe dat crossover is mogelijk ^23,31-33.

Ongeacht deze valkuilen, chemische genetica en deze minimal-resource benadering heeft veel aan de onderzoeksgemeenschap te bieden. Chemische genetica is vooral handig in de zebravis en blijft een cruciale rol spelen in de moleculaire route verhoor en drug discovery. Chemische schermen gebaseerd op discrete moleculaire doelen hebben in het verleden onderhevig aan een hoge percentage mislukkingen te wijten aan wat bekend staat als de constellatie van adsorptie, distributie, metabolisme, excretie en toxicologische (ADMET) eigenschappen ^51. Chemische schermen gebruik te maken van zebravisgericht op een werkwijze, in plaats van een discrete doel kunnen verschillende ADMET problemen omzeilen en identificeren van verbindingen die werkzaam in de context van het gehele organisme. Met de toenemende pool van beschikbare middelen voor de zebravis onderzoek, inclusief de huidige gemuteerde stammen en de mogelijkheid om genoom bewerken gebruiken om gerichte genetische mutanten en transgene planten te creëren, zijn er vrijwel een onbeperkt aantal potentiële chemische genetische screens met behulp van de zebravis. Veel chemische bibliotheken zijn samengesteld, en overspanning collecties met bekende bioactieve, nieuwe verbindingen, structureel divers en structureel vergelijkbaar. Deze reagentia leveren een schat aan interessante mogelijkheden voor het scherm combinaties die momenteel beschikbaar zijn en zullen waarschijnlijk verder zal groeien in de komende jaren. Met deze mogelijkheden in de hand, deze handleiding en high-throughput-protocol zorgt voor een praktische en gebruiksvriendelijke manier om het vermogen van de onderzoeksgroepen aan chemische genetische screens ondernemen met behulp van zebravis verhogen.