Isolierung und Charakterisierung von Quantitative Immunzytochemische Primäre myogenen Zellen und Fibroblasten aus menschlichen Skelettmuskel
Summary
The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.
Abstract
Die Reparatur und Regeneration von Skelettmuskel erfordert die Wirkung von Satellitenzellen, die die residenten Muskelstammzellen sind. Diese können von menschlichen Muskel-Biopsie-Proben mit enzymatische Verdauung und deren myogene Eigenschaften untersucht in der Kultur isoliert werden. Quantitativ sind die aus der enzymatischen Verdauung erhaltenen beiden Haupt adhärenten Zelltypen: (i) die Satellitenzellen (genannt myogenen Zellen oder Muskel-Vorläuferzellen), zunächst als CD56 + identifiziert und später als CD56 + / Desmin + Zellen und (ii) Muskel- Fibroblasten, wie CD56 identifiziert – und TE-7 +. Fibroblasten vermehren sehr effizient in der Kultur und in gemischten Zellpopulationen diese Zellen myogenen Zellen, die Kultur zu dominieren überrannt. Die Isolierung und Reinigung der verschiedenen Zelltypen von menschlichen Muskel ist somit ein wichtiger methodischer Berücksichtigung, wenn sie versuchen, um die angeborene Verhalten der beiden Zelltypen in Kultur zu untersuchen. Hier descr wirIBE ein System der Sortierung auf der Basis der sanften enzymatische Verdauung von Zellen unter Verwendung von Collagenase und Dispase durch magnetische Zellsortierung (MACS), unter dessen gibt sowohl eine hohe Reinheit (> 95% myogenen Zellen) und guter Ausbeute (~ 2,8 × 10 6 ± 8,87 x 10 5 Zellen / g Gewebe nach 7 Tagen in vitro) für Experimente in der Kultur. Dieser Ansatz basiert auf Inkubieren der gemischten Muskel abstammenden Zellpopulation mit magnetischen Mikrokügelchen Kügelchen mit einem Antikörper gegen CD56, konjugiert und dann vorbei Zellen wenn ein Magnetfeld beruht. CD56 + Zellen an Mikrokügelchen gebunden sind durch das Feld während CD56 behielt – Zellen durch die Säule ungehindert. Zellsuspensionen aus jeder Stufe des Sortierprozesses kann plattiert und kultiviert werden. Nach einer bestimmten Intervention, die Zellmorphologie und die Expression und die Lokalisierung von Proteinen einschließlich Kerntranskriptionsfaktoren unter Verwendung von Immunfluoreszenz-Markierung mit spezifischen Antikörpern und einem Bild p quantifizierenrocessing und Analysepaket.
Introduction
Die Reparatur und Regeneration von Skelettmuskel erfordert die Wirkung von Satellitenzellen 1, die myogene Stammzellen 2,3. In vivo diese Zellen existieren in einem Ruhezustand reversibel zwischen Sarkolemma und Basallamina jedes myofibre befindet sich aber aktiviert zu werden, um zu proliferieren, Sicherung und zu differenzieren, wie Muskelgewebe beschädigt, repariert und regeneriert 3. Satelliten-Zellen können aus jungen und älteren menschlichen Muskel-Biopsie-Proben mit enzymatische Verdauung 4 und deren myogene Eigenschaften isoliert werden anschließend in Primärkultur 5 untersucht werden. Die Effizienz dieses Isolierungsverfahren in Bezug auf sowohl Ausbeute und Reinheit der Zellpopulation abhängig von den verwendeten Verfahren und kann von Probe zu Probe variieren. Die aus enzymatische Verdauung erhalten zwei Haupt adhärenten Zelltypen sind die Satellitenzellen (jetzt genannt myogenen Zellen oder Muskel-Vorläuferzellen), zunächst als CD56 + / Desmin Zellen und mu identifiziertscle abgeleiteten Fibroblasten, wie CD56 identifiziert – und TE7 + Zellen 5. Fibroblasten haben eine schnelle Proliferationsrate und keine irreversiblen Wachstumsstillstand und terminale Differenzierung bei der Zell-Zell-Kontakt wie myogenen Zellen zu unterziehen; damit in Mischpopulationen kann Fibroblasten myogenen Zellen überlaufen, um die Kultur zu dominieren.
Fibroblasten wurden oft als eine Irritation für Muskel Biologen angesehen, aber es ist jetzt ein wachsendes Interesse an Fibroblasten-Zellen eine Untersuchung wert in ihrem eigenen Recht, vor allem, da sie gezeigt haben, um eine kooperative Rolle mit myogenen Zellen im Muskel-Reparatur 6 haben . Die Isolierung und Reinigung von verschiedenen Zelltypen aus menschlichem Muskel ist damit ein wichtiger methodischen Betrachtung beim Versuch, den angeborenen Verhalten beider Zellarten in Kultur zu untersuchen. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) ist ein Verfahren, durch das Zellen für eine weitere Untersuchung nach und / oder gezählt undanalysiert. FACS wurde gezeigt, zuverlässig zu bereichern menschlichen myogenen Zellen, aber die Ausbeute an Zellen für die anschließende Kultur bisher nicht hoch 7. Angesichts der begrenzten Replikationspotenzial der Körperzellen wie Satelliten-Zellen abgeleiteten myogenen Zellen und die ganz Armen Proliferation und Differenzierung mit Seneszenz 4 verbunden sind, werden sanfter Ansätze erforderlich. Einzelne Muskelfaserkulturen bieten eine andere, weniger aggressiv, bedeutet der Erhalt murine Satellitenzellen noch in den sublaminalen Nische und nach ihrer Aktivierung in der Kultur 8,9 ansässig. Dies ist jedoch häufig nicht möglich, aus der menschlichen Muskelbiopsie Material (weil Fasern können selten von Sehne zu Sehne erhalten werden), was bedeutet, dass diese Technik möglicherweise nicht für viele Forschungslabors Interesse an einem Studium menschlichen Muskel-abgeleitete Zellen sein. Darüber hinaus liefert die Einzelfaser-Technik nur sehr begrenzt Zellzahlen.
Hier beschreiben wir ein System zur Sortierung auf der Basis des Generatortle enzymatische Verdauung von Zellen unter Verwendung von Collagenase und Dispase durch zwei aufeinanderfolgende Runden der magnetischen Zellsortierung (MACS), das sowohl eine hohe Reinheit (> 95% myogenen Zellen) und Ausbeute (~ gibt anschließend 2,8 x 10 6 ± 8,87 x 10 5 Zellen / g Gewebe) für Experimente in der Kultur. CD56 wird als Goldstandard Oberflächenmarker zur Identifizierung von menschlichen Satellitenzellen in situ 10 und in vitro 11 und stellt die ideale Oberflächenmarker Kandidat Wulst Befestigung. Bei diesem Ansatz CD56 Antikörpern zu Eisenoxid und polysaccharidhaltigen superparamagnetische Perlen werden zu den Zellen durch eine Hochgradienten-Magnetzellseparationssäule in einem starken Magnetfeld 12,13 angeordnet gebunden geleitet konjugiert. Die Trennsäulen sind mit einer Matrix aus ferromagnetischen Stahlwolle oder Eisenkugeln, die magnetischen Feldlinien in Richtung ihrer Fläche, die starke Magnetfeldgradienten (~ 4tesla) konzentrieren dienen gefüllte 14. In diesen Spalten auch leicht magnetisch Zellen werden angezogen und auf ihrer Oberfläche 14 adsorbiert. Unbound (CD56 -) Zellen durch die Säule, während CD56 + Zellen mit magnetischen Mikrokügelchen gekennzeichnet sind, bis zur Entfernung aus dem Magnetfeld 12,15 beibehalten.
Zellsuspensionen aus jeder Stufe des Sortierprozesses kann bei der gewünschten Dichte für weitere Experimente plattiert werden. Nach einer bestimmten Intervention die zellulären Bestandteile mittels Immunzytochemie ermittelt werden, aufgenommen mit Weitfeld oder konfokaler Fluoreszenzmikroskopie und unter Verwendung eines Bildanalyseansatz, die einen schnellen objektive Messung aller markierten Zellen in einem gegebenen Bild ermöglicht quantitativ analysiert. In unserem Labor haben wir diese doppelte immun Sortierung Ansatz gefolgt von Bildanalyse 16 verwendet haben, dass CD56 zeigen – menschlichen Fibroblasten leicht in Fettzellen transdifferen, während myogenen Zells von satelliten Ursprungs sind sehr widerstandsfähig gegen diese adipogenen Umwandlungs 5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben eine immunomagentic Sortierverfahren für die selektive Anreicherung von menschlichen Muskel-abgeleitete Vorläufer aus kleinen Proben der Muskelbiopsie Material beschrieben. Diese Technik hat sich für die Überwindung der Verlust des menschlichen Muskel-abgeleitete Kulturen auf Fibroblasten von unschätzbarem Wert in unserem Labor, sondern auch für das Verständnis der einzigartigen Verhalten unterschiedliche Populationen von Muskel-Vorläuferzellen abgeleitet. Nachdem gereinigtes myogenen Zellen können Ve…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors wish to thank Carl Hobbs and Lindsey Majoram for their technical assistance, and Professor Pat Doherty for use of microscopy facilities. Dr. Agley was supported by a studentship from King’s College London. Funding from the Spurrell Trust is also acknowledged.
Materials
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | Must be filter sterilized before use |
| Trypsin/EDTA | (Gibco) Invitrogen | 15400-054 | |
| 100 micron cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| Collagen solution ( 3 mg/ml in 0.1% acetic acid) | Sigma, Dorset, UK | C8919 | |
| Minisart SRP15 syringe filter (0.2 micron) | Sartorius | 17573ACK | Polytetrafluorethylene (PTFE) membrane |
| CD56 human Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-050-401 | Be aware of the limited shelf life of microbeads |
| Anti- fibroblast Microbeads, human | Miltenyi Biotech | 130-050-601 | |
| 40 μm Pre-separation filters | Miltenyi Biotech | 130-041-407 | |
| Large Cell Collumns | Miltenyi Biotech | 130-042-202 | These columns come with a flow resistor. Use of the flow resistor is not necessary to obtain the high myogenic purities described here. |
| LS columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MiniMacs Seperator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | This separator fits the large cell column but not the LS column. |
| MidiMACS | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| BSA | Sigma | Must be filter sterilized before use | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| Triethyl phosphate | Sigma | 538728 | |
| Whatman Paper | Sigma | Z241121-1PAK | No. 42, Ashless. To prepare the filter fold the circular filter paper to make a semi circle, then fold the semi-circle in half again to form a cone shape. Fit the cone into a funnel for filtering. |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Molecular Probes, Invitrogen | P36930 | This can be purchased with or without DAPI and does not quench initial fluorescence. |
| AxioVision | Carl Zeiss | Contact Zeiss | |
| Adobe Photoshop CS5 Extended | Adobe (purchased from Pugh Computers) | ADPH16982* |
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