Isolement et quantitative immunocytochimique caractérisation des cellules myogéniques primaires et fibroblastes de muscle squelettique humain

La réparation et la régénération du muscle squelettique nécessite l'action des cellules satellites ^1, les cellules souches myogéniques ^2,3. In vivo ces cellules existent dans un état ​​réversible de repos située entre le sarcolemme et lame basale de chaque myofibre, mais se activent à proliférer, fusible et de différencier que le tissu musculaire est endommagé, réparer et régénérer ^3. Les cellules satellites peuvent être isolés à partir d'échantillons de biopsie musculaire humaine jeunes et les personnes âgées en utilisant une digestion enzymatique ⁴ et leurs propriétés myogéniques peut ensuite être étudié en culture primaire ^5. L'efficacité de ce processus d'isolement en ce qui concerne à la fois le rendement et la pureté de la population de cellules dépend des méthodes utilisées et peut varier d'un échantillon à. Les deux principaux types de cellules adhérentes obtenues à partir de la digestion enzymatique sont les cellules satellites (cellules myogéniques maintenant appelés ou des cellules précurseurs du muscle), identifiés initialement comme cellules CD56 ⁺ / desmine, et mufibroblastes SCLE dérivés, identifiés comme CD56 ^– et TE7 ^{+ 5} cellules. Fibroblastes ont un taux de prolifération rapide et ne subissent pas un arrêt de croissance irréversible et différenciation terminale lors d'un contact cellule-cellule comme les cellules myogéniques; Ainsi, dans des populations mixtes, les fibroblastes peuvent dépassement cellules myogéniques à dominer la culture.

Fibroblastes ont souvent été considérée comme une irritation pour les biologistes musculaires, cependant, il ya maintenant un intérêt croissant dans les fibroblastes en cellules dignes d'étude à part entière, d'autant plus qu'ils ont été montré pour avoir un rôle de coopération avec des cellules myogéniques pendant la réparation musculaire ⁶ . L'isolement et la purification de types de muscle humain de cellules différentes est donc une considération méthodologique importante lorsqu'il se agit d'enquêter sur le comportement inné de deux types de cellules en culture. Fluorescence-activated tri cellulaire (FACS) est un procédé par lequel les cellules peuvent être triés pour une étude plus poussée et / ou comptées etanalyser. FACS a été montré pour enrichir de manière fiable cellules myogéniques humaines, mais le rendement des cellules pour la culture subséquente a jusqu'à présent pas été élevé ^7. Compte tenu du potentiel de réplication limitée des cellules somatiques telles que les cellules satellite dérivés de cellules myogéniques et les très pauvres prolifération et la différenciation associés à la sénescence ^4, des approches plus douces sont nécessaires. Simples cultures de fibres musculaires offrent une autre, moins agressive, des moyens d'obtenir des cellules satellites murins résident encore dans leur niche sublaminal et après leur activation dans la culture ^8,9. Cependant, ce ne est souvent pas possible à partir de matériel de biopsie musculaire humaine (parce que les fibres peuvent rarement être obtenus à partir de tendon tendon) ce qui signifie que cette technique peut ne pas être accessible à de nombreux laboratoires de recherche intéressés à l'étude des cellules musculaires humaines dérivées. De plus, la technique de fibre simple ne fournit que le nombre de cellules très limitées.

Ici, nous décrivons un système de tri en fonction de la gendigestion enzymatique tle de cellules en utilisant de la collagénase et de la dispase suivie de deux cycles successifs de cellules activées magnétique de tri (de MACS) qui donne à la fois une grande pureté (> 95% des cellules myogéniques) et le rendement (~ 2,8 x 10 ⁶ ± 8,87 x 10 ⁵ cellules / g de tissu) pour des expériences dans la culture. CD56 est considéré comme le marqueur de surface or standard pour l'identification des cellules satellites humaines in situ et in vitro ¹⁰ et ¹¹ fournit la surface de marqueur candidat idéal pour la fixation de talon. Dans cette approche anticorps CD56 conjugués à l'oxyde de fer et des billes superparamagnétiques contenant des polysaccharides sont liés aux cellules et passé à travers une colonne de séparation cellulaire magnétique à gradient élevé placé dans un champ magnétique puissant ^12,13. Les colonnes de séparation sont remplis avec une matrice de laine d'acier ou de fer sphères ferromagnétiques qui servent à concentrer les lignes de champ magnétique vers leur surface générer des gradients de champ magnétique intense (~ de 4tesla) ¹⁴. Dans ces colonnes cellules même légèrement magnétiques sont attirés et adsorbées à leur surface ^14. Non consolidé (CD56 ^-), les cellules passent à travers la colonne alors que CD56 ⁺ des cellules marquées avec des microbilles magnétiques sont retenues jusqu'à ce que le retrait du champ magnétique ^12,15.

Les suspensions cellulaires de ne importe quelle étape du processus de tri peuvent être étalées à la densité désirée pour de nouvelles expérimentations. Suite à une intervention donnée les constituants cellulaires peuvent être identifiés en utilisant immunocytochimie, imagé en utilisant grand champ ou la microscopie confocale à fluorescence et analysé quantitativement en utilisant une approche d'analyse d'image qui permet une mesure objective rapide de toutes les cellules marquées dans une image donnée. Dans notre laboratoire, nous avons utilisé cette approche double tri immunomagnétique suivie par analyse d'image ¹⁶ pour démontrer que CD56 ^– fibroblastes humains transdifférencient facilement dans les adipocytes, tandis que la cellule myogéniques d'origine par satellite sont très résistants à cette conversion adipogénique ^5.