L'expression de protéines fluorescentes en<em> Branchiostoma lanceolatum</em> Par injection dans l'ARNm non fécondés ovocytes

Pendant le développement, une seule cellule donne naissance à un organisme entier dans un processus très complexe qui implique les deux divisions et les mouvements cellulaires. Pour mieux comprendre les principes biologiques sous-jacents la dynamique du comportement cellulaire, biologie du développement ont commencé à utiliser des techniques d'imagerie in vivo par fluorescence. Compartiments spécifiques des cellules, telles que les membranes cellulaires, peuvent soit être marquées par des traitements avec des colorants fluorescents, une approche entravée par le manque de spécificité et de la pénétration du tissu ^1, ou par l'introduction spécifique dans l'embryon d'ARNm exogène codant pour les protéines fluorescentes ^deux. Différentes techniques peuvent être utilisées pour la prestation efficace de composés exogènes, tels que les ARNm. Ceux-ci comprennent, mais ne sont pas limités à, la micro-injection, l'électroporation, le bombardement avec des microparticules, la lipofection et ^3,4 transduction. Bien que toutes ces approches peut être utilisé pour introduire des composés exogènes dans unle développement embryonnaire, la micro-injection ne permet l'application de quantités prédéfinies et précis dans chaque cellule ^3. techniques de microinjection ont été décrits pour tous les principaux systèmes de modèle de développement ⁴ (par exemple, les mouches des fruits, des vers nématodes, de poisson zèbre, grenouilles, souris) ainsi que pour certains autres modèles ^4, y compris ceux utilisés pour des études comparatives visant à comprendre l'évolution des mécanismes de développement (par exemple, les anémones de mer, vers annélides, les oursins, tuniciers d'ascidies, l'amphioxus de céphalochordé).

Céphalochordés, qui, avec les tuniciers et les vertébrés établissent le phylum des chordés, sont particulièrement bien adaptés modèles pour étudier l'évolution des chordés et la diversification des vertébrés d'un ancêtre invertébrés ^5-8. La lignée de céphalochordé divergé très tôt pendant l'évolution des chordés; et céphalochordés existantes, qui sont subdivisés en trois genres (Branchiostoma, Asymmetron et Epigonichthys), ressemblent vertébrés à la fois en termes d'anatomie et de l'architecture globale du génome ^5-8. Sur les 30 espèces de céphalochordés qui ont été décrites à ce jour, cinq sont disponibles pour des études embryologiques et de développement ^6,9: Asymmetron lucayanum (le lancelet Bahama), Branchiostoma floridae (le amphioxus Floride), Branchiostoma lanceolatum (l'amphioxus européenne), Branchiostoma belcheri (le amphioxus chinoise) et Branchiostoma japonicum (le amphioxus japonais). Adultes mûrs de trois de ces espèces (B. lanceolatum, B. belcheri et B. japonicum) peuvent être induits à pondre à la demande au cours de la saison de reproduction ^10,11. En outre, au moins pour B. lanceolatum, frai efficace peut aussi être induite dans l'eau de mer artificielle ^12, ce qui rend cette espèce de céphalochordé particuliers accessible pour laborators qui ne ont pas accès à l'eau de mer naturelle. La combinaison, dans B. lanceolatum, d'un accès pratique et fiable pour les embryons avec une méthode de livraison efficace, tels que la micro-injection, jusqu'à présent, la seule technique de livraison développé en amphioxus (à la fois B. et B. floridae belcheri) ^13-15, va permettre le développement d'un nouvelle gamme de techniques de manipulation, y compris la lignée tracing- et les approches de comportement de cellules dynamique.

Un protocole pour la micro-injection d'ARNm efficace pour exprimer des protéines fluorescentes dans le B. lanceolatum embryon a donc été développé. En outre, de fournir un ensemble d'outils de base pour l'imagerie en direct de B. embryons lanceolatum, systèmes de vecteurs ont été développés qui permettent associée à la membrane nucléaire et l'expression de protéines fluorescentes. Pour le ciblage de la membrane, le renforcement de la protéine fluorescente verte (eGFP) a été fusionnée à la boîte de CAAX HRAS humaine et localisation nucléaire de mCherry et eGFP étaitobtenu par fusion à l'exon poisson zèbre histone 2B (H2B) (figure 1, fichier supplémentaire 1). En outre, dans le but d'optimiser la traduction des protéines, des séquences de Kozak et des codons des constructions ont été modifiées et adaptées à l'utilisation dans B. lanceolatum. Pris ensemble, la méthode d'injection et des vecteurs d'expression présentés ici serviront de base pour la génération de nouvelles approches expérimentales pour céphalochordés, notamment en utilisant les analyses par fluorescence les dernières techniques d'imagerie in vivo.