وتحليل وعائية عصبية إعادة عرض في Entorhino-الحصين الثقافات شريحة عضوي النمط
Summary
بروتوكول للثقافات شريحة عضوي النمط-entorhino الحصين، والذي يسمح استنساخ جوانب كثيرة من إصابات الدماغ الدماغية، ويرد. من خلال دراسة التغيرات في neurovasculature بالإضافة إلى التغييرات في الخلايا العصبية، وهذا البروتوكول هو أداة مرنة لدراسة التغيرات البلاستيك في الأنسجة العصبية بعد الإصابة.
Abstract
إصابات الدماغ الدماغية هي من بين الشروط الأكثر شيوعا ومدمرة المساومة على وظيفة الدماغ السليم ويؤدي إلى استمرار العجز الوظيفية في المرضى المصابين كثير من الأحيان. على الرغم من الجهود البحثية المكثفة، لا تزال هناك أي خيار العلاج الناجع الذي يقلل الإصابة العصبية ويحمي الخلايا العصبية في المناطق الدماغية من الموت الثانوي تأخير. البحوث في هذا المجال عادة ما ينطوي على استخدام نماذج حيوانية متقنة ومعقدة. وتنشأ الثقافات شريحة عضوي النمط-Entorhino الحصين تحدى مع الأكسجين والحرمان الجلوكوز (OGD) في نماذج المختبر التي تحاكي نقص التروية الدماغية. الجانب الرواية من هذه الدراسة هو أن يتم دراسة التغيرات في الأوعية الدموية في الدماغ بالإضافة إلى التغيرات العصبية وردود الفعل من كل من الخلايا العصبية وحجرة حجرة الأوعية الدموية يمكن مقارنة والمترابطة. الطرق الواردة في هذا البروتوكول توسيع كبير في التطبيقات المحتملة للأوganotypic نهج ثقافة شريحة. تحريض OGD أو نقص الأكسجة وحدها يمكن تطبيقها بوسائل بسيطة إلى حد ما في الثقافات شريحة عضوي النمط ويؤدي إلى الضرر موثوقة وقابلة للتكرار في الأنسجة العصبية. هذا هو في تناقض صارخ مع التجارب على الحيوانات معقدة وإشكالية حمل السكتة الدماغية ونقص التروية في الجسم الحي. من خلال توسيع التحليل ليشمل دراسة رد فعل الأوعية الدموية يمكن أن توفر طرق جديدة حول كيفية حفظ واستعادة وظائف المخ. نهج ثقافة شريحة المقدمة هنا قد تتطور إلى أداة جذابة وهامة لدراسة إصابات الدماغ الدماغية ويمكن أن تكون مفيدة لاختبار التدابير العلاجية المحتملة التي تهدف إلى العصبية.
Introduction
الجهاز العصبي المركزي حساس بشكل خاص للخسارة أو تخفيض إمدادات الأكسجين والجلوكوز بواسطة الأوعية الدموية. حتى انقطاع قصير بدلا من إمدادات الدم إلى الدماغ يمكن أن تحدث خسارة دائمة في وظيفة من مناطق الدماغ ذات الصلة مما يؤدي إلى أعراض السكتة الدماغية نموذجية. بالإضافة إلى فقدان الخلايا العصبية في المناطق المتضررة الأولية، هناك عادة إضافية فقدان الخلايا العصبية المتأخرة من خلال الضرر الثانوي. للأسف حتى الآن، كان يوجد علاج اعصاب للحد من موت الخلايا العصبية الثانوي المتاحة 1. الجهود البحثية لدراسة آليات الضرر الثانوي تعتمد على استخدام نماذج حيوانية من نقص التروية الدماغية مثل انسداد الشريان الدماغي الأوسط ومختلف تقنيات انسداد الجلطات (لمراجعة حديثة انظر 2). في موازاة ذلك، أيضا بسبب القيود والمخاوف الأخلاقية مع استخدام النماذج الحيوانية، ثقافة شريحة عضوي النمط من مختلف أنسجة الجهاز العصبي المركزي وقد استخدمت تسمح ستودى من ردود الفعل العصبية إلى نوع مختلف من إصابات 3-5.
لدراسة رد فعل الخلايا العصبية في ظل الظروف التي تحاكي إصابات الدماغ الدماغية، وقد تم تطوير النظام النموذجي للحرمان الأكسجين الجلوكوز (OGD). في هذا النموذج، تتعرض الثقافات شريحة مؤقتا إلى المتوسطة التي تفتقر الجلوكوز وتم معايرتها مع غاز النيتروجين في غياب الأكسجين. مع مثل هذا العلاج، فمن الممكن للحث على إصابة الخلايا العصبية وفقدان الذي يشبه إلى حد ما واحد وحظ بعد الإصابة الدماغية في الجسم الحي 6 و 7. في الحصين، فإن مثل هذا العلاج يستحث فقدان الخلايا العصبية وتحديدا في CA1، ولكن ليس في منطقة CA3 أو التلفيف المسنن من الحصين. في المقابل، فإن دراسة التفاعلات الوعائية في الثقافات شريحة لم يجر على نطاق واسع حتى الآن. لسبب واضح هو عدم وجود الدورة الدموية والأوعية الدموية نضح في نموذج الثقافة شريحة. ومع ذلك، لقد أظهرنا سابقا أنه من الممكن للحفاظ على بسفن lood في الجهاز العصبي المركزي شريحة الثقافات لعدة أيام 8 و 9.
الهدف العام من هذه الطريقة هو مراقبة ليس فقط مصير الخلايا العصبية بعد OGD بل تمتد الدراسة إلى مصير وإعادة تشكيل الأوعية الدموية التي هي جزء مهم من استجابة الاصابة. حتى الآن قد تتطلب هذه الدراسات استخدام التجارب على الحيوانات (دي يونغ وآخرون، 1999؛ Cavaglia وآخرون، 2001). في قدم بروتوكول هنا، فإننا سوف بالتفصيل كيف يمكن القيام به في مثل هذه الدراسات الثقافات شريحة عضوي النمط-entorhino الحصين تحدى إما مع نقص الأكسجة أو الآفات excitotoxic المواد تليها تحليل كل من البقاء والأوعية الدموية ردود الفعل العصبية. ويستند هذا البروتوكول على دراسة نشرت سابقا حول هذا الموضوع 10 ويمكن أن تكون مفيدة لأي مختبر ترغب في التفاعلات الوعائية العصبية في الجهاز العصبي المركزي.
Protocol
Representative Results
Discussion
مع الأساليب المعروضة هنا، الحصين الثقافات شريحة عضوي النمط يمكن استخدام أداة مرنة لدراسة التغيرات البلاستيك في الأنسجة العصبية بعد الإصابة. في حين الثقافات شريحة عضوي النمط وقد استخدمت في الماضي لدراسة ردود الفعل العصبية بعد نقص التروية 6، 7 الجانب الجديد من ا…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل جامعة بازل، قسم الطب الحيوي، ومؤسسة العلوم الوطنية السويسرية (31003A_141007). قدم ماركوس Saxer الدعم التقني.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Minimum Essential Medium MEM | Gibco | 11012-044 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | stabilized form of L-glutamine |
| Millicell cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | |
| Basal medium Eagle | Gibco | 41010-026 | |
| Horse serum | Gibco | 26050-088 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Anaerobic strips | Sigma-Aldrich | 59886 | |
| Propidium iodide solution | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| AMPA | R&D systems | 0169-10 | |
| CNQX | R&D systems | 0190/10 | |
| TTX | R&D systems | 1078/1 | |
| polyclonal anti-laminin | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| anti-MAP2 | Abcam | ab11267 | |
| Alexa anti mouse 350 | Molecular Probes | A11045 | |
| Alexa anti mouse 488 | Molecular Probes | A11001 | |
| Alexa anti rabbit 350 | Molecular Probes | A11046 | |
| Alexa anti rabbit 488 | Molecular Probes | A11008 | |
| Statistics software | GraphPad Software | GraphPad Prism | |
| McIlwain tissue chopper | Ted Pella | 10180 | |
| Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 |
Riferimenti
- Turner, R. C., Dodson, S. C., Rosen, C. L., Huber, J. D. The science of cerebral ischemia and the quest for neuroprotection: navigating past failure to future success. J Neurosurg. 118, 1072-1085 (2013).
- Bacigaluppi, M., Comi, G., Hermann, D. M. Animal models of ischemic stroke. Part two: modeling cerebral ischemia. Open Neurol J. 4, 34-38 (2010).
- Woodhams, P. L., Atkinson, D. J. Regeneration of entorhino-dentate projections in organotypic slice cultures: mode of axonal regrowth and effects of growth factors. Exp Neurol. 140, 68-78 (1996).
- Prang, P., Del Turco, D., Kapfhammer, J. P. Regeneration of entorhinal fibers in mouse slice cultures is age dependent and can be stimulated by NT-4, GDNF, and modulators of G-proteins and protein kinase. C. Exp Neurol. 169, 135-147 (2001).
- Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model. Eur J Neurosci. 27, 2483-2492 (2008).
- Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence. Brain Res Brain Res Protoc. 4, 173-184 (1999).
- Rytter, A., Cronberg, T., Asztély, F., Nemali, S., Wieloch, T. Mouse hippocampal organotypic tissue cultures exposed to in vitro ‘ischemia’ show selective and delayed CA1 damage that is aggravated by glucose. J Cereb Blood Flow Metab. 23, 23-33 (2003).
- Bendfeldt, K., Radojevic, V., Kapfhammer, J., Nitsch, C. Basic fibroblast growth factor modulates density of blood vessels and preserves tight junctions in organotypic cortical cultures of mice: a new in vitro model of the blood-brain barrier. J Neurosci. 27, 3260-3267 (2007).
- Camenzind, R. S., et al. Preservation of transendothelial glucose transporter 1 and P-glycoprotein transporters in a cortical slice culture model of the blood-brain barrier. Neuroscienze. 170, 361-371 (2010).
- De Jong, G. I., et al. Cerebral hypoperfusion yields capillary damage in the hippocampal CA1 area that correlates with spatial memory impairment. Neuroscienze. 91, 203-210 (1999).
- Cavaglia, M., et al. Regional variation in brain capillary density and vascular response to ischemia. Brain Res. 910, 81-93 (2001).
- Chip, S., Nitsch, C., Wellmann, S., Kapfhammer, J. P. Subfield-specific neurovascular remodeling in the entorhino-hippocampal-organotypic slice culture as a response to oxygen-glucose deprivation and excitotoxic cell death. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 508-518 (2013).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
