ニワトリ胚から解離感覚ニューロンの単離および培養

ニューロンは、感覚、視覚、運動運動、学習、およびメモリを含む、さまざまな機能に不可欠な情報を伝達する複雑な細胞である。他の細胞型からのユニークな、ニューロンは、通信のための不可欠な神経の高速道路を形成するために、軸索と呼ばれる、アーム状のプロセスを拡張します。成長円錐と呼ばれる成長の軸索の先端に位置して開発専門のコンパートメント、中、その適切な宛先に軸索をリードして、細胞外手がかりのコンサートをナビゲート。成長円錐ナビゲーションの根底にある複雑な分子メカニズムは完全には理解されていない。より良いこれらのメカニズムを理解するために、研究者らは、in vitro環境で定義され、簡略化のニューロンを研究するための細胞培養モデルを使用している。神経分化^2、細胞骨格のダイナミクス、エンドサイトーシスおよび人身売買、デンドライト：文化¹に留学ニューロンは、ニューロンを含む細胞生物学の理解において大きな進歩をもたらしたレギュレーション^3,4、軸索再生^5、そのような神経障害⁶などの臨床症状。加えて、培養神経細胞は、成長円錐の運動性のタイムラプス分析などの免疫細胞化学、細胞表面共免疫沈降、ウエスタンブロット、トランスフェクション、RNAiは、ライブイメージングを含む、研究技術の広い範囲に非常に適している。このように、一次ニューロンを培養したニューロンの細胞生物学の多くの側面を解明するための強力なアプローチである。

細胞培養モデルは、環境条件や変数を詳細に制御した研究者を提供しています。例えば、ニューロンがメッキ（および上に成長）された基質は、容易に操作することができる。ここでは、二つの異なる基質、低ラミニン-1濃度が1およびラミニン-1の飽和濃度で他を生成するための詳細な手順を提供する。驚くべきことに、同じ分子の異なる濃度は、劇的な効果を持つことができ内部のニューロンの状態だけでなく、それらの細胞表面組成に。例えば、インテグリンのcAMPおよび表面レベルの細胞内レベルは、これらの2つの基層^7,8上にめっきニューロンが有意に異なっている。追加の研究は、フィブロネクチンおよびコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを含む他の分子は、細胞表面分子の発現および神経運動性^7-11に影響^を与えることが示されている。また、このようなニューロトロフィンおよびニューロトロピン等の水溶性分子はまた、細胞膜の組成および神経運動性^12-16に影響^を及ぼし、容易かつ正確に細胞培養モデルで操作することができる。

ここでは、単離するための方法が記載されているし、培養ニワトリ胚から感覚ニューロンを解離さ。この手順は、軸索伸長^{5,7,8,10,11,16-21}含む神経生物学における重要なブレークスルーを製造するために使用されており、神経節細胞^22を分離するように設計された手順を改変した。ありこの手法にはいくつかの利点。まず、ひよこ後根神経節（DRG）の開発の多くの機能はよく出産、軸索伸長のための時間枠を含む特徴とし、タンパク質発現は、このように試験管内実験で有益構築するための有益な基礎を提供し^{、2,23-28プロファイル} 。第二に、神経細胞培養は研究者がより直接的に（神経細胞および非神経細胞を含む）は、無傷のDRG外植片および/または解離神経細胞および非神経細胞の両方を含む混合培養を用いて別のアプローチと比較して、神経細胞を研究することを可能に解離。第三に、ここで説明する手順は、簡単で安価で学部生に適している。したがって、この技術は、研究ならびに教育目的のために使用することができる。さらに、このプロトコルのマイナーバリエーションはDRGを以外のソースからのニューロンの速い、高収率の精製を可能にする必要があります。例えば、この手順はneuronally ENRを提供するために修正することができるそのような胚前脳や脊髄などの他の組織からの文化をiched。

免疫細胞化学プロトコールは、これらの解離ニューロン培養のために最適化されており、ここでは詳細に記載されている。神経細胞接着分子（NCAM）及びβ1インテグリンに対する二重免疫細胞化学のための手順が提供される。これらの免疫細胞化学的方法から生成されたデータは、培養ニューロン^8,16のいくつかの分子の空間パターニングおよび強度を調べるために使用されてきた。