Vorbereitung einer Blutkultur Pellet Rapid Identifizierung von Bakterien und Antibiotika Empfindlichkeitsprüfung
Summary
Eine schnelle Bakterienpellet Herstellung von einer positiven Blutkultur kann als eine Probe für Anwendungen wie die Identifizierung durch MALDI-TOF, Gram-Färbung, antibiotische Resistenzprüfung und PCR-basierte Tests verwendet werden. Die Ergebnisse können schnell auf Ärzte mitgeteilt, das Ergebnis von Patienten mit Infektionen der Blutbahn zu verbessern.
Abstract
Blutstrominfektionen und Sepsis sind eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität. Der Erfolg von Patienten mit Bakteriämie, hängt von einer schnellen Identifizierung des Erregers zu führen optimale Behandlung mit Antibiotika. Die Analyse der Gram Flecken aus positiver Blutkultur kann schnell durchgeführt werden und bereits erhebliche Auswirkungen auf die antibiotische Therapie. Jedoch ist die genaue Identifikation des Erregers erforderlich, um die optimale gezielte Behandlung etablieren. Wir stellen Ihnen hier eine einfache und schnelle Zubereitung von Bakterienpellet einer positiven Blutkultur, die als Probe für mehrere wesentliche Downstream-Anwendungen wie Identifikation durch MALDI-TOF-MS, antibiotische Empfindlichkeitsprüfung (AST) durch Scheibendiffusionstest oder automatisierte AST-Systemen verwendet werden können und durch automatisierte PCR-basierten Diagnosetests. Die Leistung dieser direkt auf die Blutkultur Bakterienpellets angewendet unterschiedliche Identifikationssysteme und AST ist sehr similar auf die Leistung in der Regel aus isolierten Kolonien auf Agar-Platten gezüchtet wurden. Im Vergleich zu herkömmlichen Ansätzen, die schnelle Beschaffung eines Bakterienpellet reduziert die Zeit, um sowohl Identifikation und AST zu melden. So kann nach einer Blutkultur Positivität Identifizierung durch MALDI-TOF in weniger als 1 Stunde in der Erwägung Ergebnisse AST durch automatisierte Systeme AST oder Scheibendiffusionstests innerhalb von 8 bis 18 h, jeweils angegeben werden. Ebenso können die Ergebnisse einer schnellen PCR-basierten Assays, um den Kliniker mitgeteilt weniger als 2 Stunden nach dem Bericht einer Bakteriämie. Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass die rasche Erstellung eines Blutkultur Bakterienpellet hat einen signifikanten Einfluss auf die Identifizierung und AST Bearbeitungszeit und damit auf das erfolgreiche Ergebnis von Patienten mit Infektionen der Blutbahn.
Introduction
Bakteriämien und Sepsis bei hospitalisierten Patienten sind eine der Hauptursachen von Morbidität und Mortalität. So ist die Sterblichkeit im Zusammenhang mit Infektionen Blutbahn in etwa 14% bis 37% der stationären Patienten beobachtet und kann auf 35% auf Intensivstationen Patienten 1-3 erhöhen. Die schnelle Identifizierung des Erregers ist entscheidend zu führen optimale antimikrobielle Behandlung und den erfolgreichen Abschluss der antimikrobiellen Therapie 4,5 zu erhöhen. Die schnelle Analyse von Gram Flecken aus positiver Blutkultur hat bereits einen erheblichen Einfluss auf die Anpassung der antimikrobiellen Therapie 6,7, aber eine genaue Identifizierung des Erregers erforderlich, um die am besten geeigneten Antibiotika-Behandlung für die Patienten zu schaffen. Zum Beispiel haben unterschiedliche Antibiotika-Behandlung nicht ausreichend, um folgende Bakteriämie mit Enterokokken und Streptokokken, die nur schwer durch Gram-Färbung unterscheiden, sind umgesetzt werden. Ebenso Identifikation an der Art Level ist erforderlich, um Gram-negative Enterobakterien erkennen eine chromosomale ampC Gen, das eine erhöhte Resistenz gegenüber 8-Lactamen β kodiert.
Mit einer positiven Blutkultur ist die herkömmliche diagnostische Ansatz, um die Infektionserreger auf verschiedenen Agar-Platten, die mehrere Stunden zusätzliche Inkubation vor der Identifikation mit verschiedenen Ansätzen, einschließlich biochemische Tests, Wachstum auf verschiedenen Selektionsmedien und automatische Identifikationssysteme erfordert mikrobiellen Subkultur. Die Zeit, um Ergebnisse einer herkömmlichen diagnostischen Ansatz von etwa 1 bis 3 Tagen.
Die Entstehung der Matrix-unterstützte Laser-Desorption / Ionisation Time-of-Flight Massenspektrometrie (MALDI-TOF)-Technologie für die schnelle Identifizierung von Mikroorganismen wurde ein neues Werkzeug schnell Mikroorganismen von Kolonien auf Agar-Platten gezüchtet, sondern auch direkt von der positiven Identifizierung Blut bereitgestellt Kulturen (Abbildung 1) 9-12. The Verwendung von MALDI-TOF, um einen infektiösen Erreger aus Blutkulturen zu identifizieren deutlich die Zeit, um Ergebnisse zu ein paar Minuten anstelle von den Stunden und Tagen nach traditionellen Verfahren erforderlich ist, reduziert. Wie von Croxatto et al. Diskutiert 13 stützt sich die Effizienz der MALDI-TOF-Identifizierung von verschiedenen Parametern wie Reinheit und Menge des Mikroorganismus. Diese beiden Kriterien sind leicht von diskreten Kolonien auf Agar-Platten gezüchtet wurden, aber benötigt eine vorge analytischen Behandlung für bakterielle Anreicherung und Reinigung von komplexen Proben wie Blutkultur, die mehrere zelluläre und Protein-Komponenten, die mit MALDI-TOF-Identifikations stören kann enthalten.
Verschiedene Mikroorganismen Isolierungsverfahren aus Blutkulturen wurden in einer Reihe von Studien einschließlich Saponin oder andere milde Detergentien Verfahren zur Extraktion bakterieller 9,14, Serumtrennverfahren 10 verwendet Lyse Zentrifugationsverfahren 12 </sauf> und kommerziell Lösungen wie das sepsityper-Kit. Unsere Bakteriologie Diagnoselabor hat einen einfachen Blutkultur Bakterienpellet Zubereitung auf Basis von Ammoniumchlorid-Lyse Erythrozyten, die eine schnelle Identifizierung von Bakterien und Hefe durch MALDI-TOF-und automatisierte Identifikationssysteme (Abbildung 2) 15 erlauben entwickelt. Dieses Blutkultur Pelletzubereitung stellen auch eine Probe für andere direkte nachgeschalteten Anwendungen wie Gram-Färbung, automatisierte PCR-basierten diagnostischen Tests wie POCT-PCRs zum schnellen Nachweis von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) und antibiotische Resistenzprüfung mit automatisierte AST-Systeme und / oder Plattendiffusionstests auf Agarplatten (Abbildung 3).
In dieser Arbeit wurden die verschiedenen Schritte zur Herstellung des Blutkulturbakterienpellet beschreiben wir, wie durch Prod'hom et al erläutert. 15 (Figur 4). Wir werden auch DESchreiber die Protokolle für drei der wichtigsten Anwendungen, die auf die Blutkultur Pellet durchgeführt werden können: Identifizierung mittels MALDI-TOF-15, Identifikation (ID) und Antibiotika-Empfindlichkeitsprüfung (AST) mit den automatisierten Systemen 16 für Enterobacteriaceae und Staphylokokken und automatisierte PCR- basierten diagnostischen Test zum Nachweis von MRSA 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Im Vergleich zu herkömmlichen positiven Blutkultur diagnostische Ansätze, die schnelle Beschaffung eines Bakterienpellet mit Hilfe der Ammoniumchlorid-Lyse Zentrifugation Ansatz reduzieren die Zeit, um die Identifizierung von 16 bis 24 h und die Zeit bis AST von 24 bis 48 Stunden zu melden (Abbildungen 1 und berichten 3).
Rasche Einführung von geeigneten Antibiotika-Therapie ist entscheidend, um das Ergebnis von Patienten mit Infektionen der Blutbahn zu v…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den Technikern der Bakteriologie-Labor der Universitätsklinik von Lausanne für ihre Hilfe, die Techniken im Labor umzusetzen.
Materials
| 20 needle gauge | Terumo, Leuven, Belgium | NN-2038R | |
| 50 ml Falcon tube | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 352070 | 50 ml centrifuge tubes |
| Ammonium chlorure | Merck, Darmstadt, Germany | 101145 | |
| Potassium hydrogen carbonate | Fluka, St. Louis, MO, USA | 60340 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F0507 | Flammable, corrosive |
| a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Fluka, St. Louis, MO, USA | 70990 | Acute toxicity |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 271004 | Flammable, acute toxicity |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T6508 | Corrosive, acute toxicity |
| Vitek 2 60 instrument | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 27202 | automated microbial system instrument |
| Vitek 2 Gram-positive (GP) card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 21342 | automated GP identification card |
| Vitek 2 AST-P580 card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 22233 | automated microbial AST system |
| Vitek 2 Gram-negative (GN) card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 21341 | automated GN identification card |
| Vitek 2 AST-N242 card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 413391 | automated microbial AST system |
| Xpert MRSA | Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA | GXMRSA-100N-10 | nucleic acid amplification technology MRSA |
| GeneXpert IV instrument | Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA | GXIV-4-D | nucleic acid amplification technology instrument |
| Microflex LT MALDI-TOF MS instrument | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | BDAL microflex LT/SH | |
| MSP 96 target steel BC | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 280799 | MALDI target plate |
| Densitometer Densicheck instrument | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 27208 | |
| MALDI Sepsityper kit 50 | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 8270170 | |
| Mac Conkey agar | Biolife, Milano, Italy | 4016702 | |
| Mueller-Hinton agar | Oxoid, Hampshire, England | CM0337 | Mueller-Hinton agar (MH) |
| MHF agar | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 43901 | Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF) |
| BD columbia III agar | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 254071 | blood agar |
| BD chocolate agar | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 254089 | chocolate agar |
| BD schaedler agar | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 254084 | Schaedler agar |
Riferimenti
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