The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ.
Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca2+]i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca2+]i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca2+]i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca2+]i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca2+]i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca2+]i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca2+]i signals in the striatal microcircuitry.
האסטרוציטים הם תאי גליה נמצאים בכל מקום ובשפע של המוח. היא מבוססת היטב כי האסטרוציטים לשמש תמיכה חיונית ותפקידים ההומיאוסטטית כוללים חציצה של K + ריכוז במרחב החוץ תאי, ספיגה של מוליכים עצביים כמו גם חומרים מזינים מתן. עם זאת, המחקרים אחרונים מראים שהם גם להציג אני אותות [Ca 2 +], אשר מתרחשים באופן ספונטני ועלו בפעילות עצבית 1. קיומו של astrocyte [Ca 2 +] איתות אני כבר חשב יותר ויותר כדי לעורר את התקשורת שלהם עם תאי עצב, ולפיכך, היה להתפרש כסוג של "רגישות Ca 2 +" בתוך האסטרוציטים. הנתונים הזמינים בשני העשורים האחרונים מצביעים על שתי הגדרות שבי האסטרוציטים ונוירונים רשאיות להתקשר, אולי באופן דו-כיווני. ראשית, האסטרוציטים מגיבים לעתים קרובות בעלייה ב[ Ca 2 +] i כאשר מופעלת על ידי נוירוטרנסמיטורים וneuromodulators שוחררה מתא העצב 2. שנית, [Ca 2 +] אני עולה בתוך האסטרוציטים לגרום לשחרור של מולקולות איתות מהאסטרוציטים שבתורו יכול להשפיע נוירונים וכלי דם. ראיות עולה כי מולקולות שוחררו מהאסטרוציטים להביא לשינויים בפונקציות של סינפסות, מעגלים וסופו של דבר התנהגות 3-5 באמצעות איתות astrocyte לנוירון. עם זאת, זה עדיין תחום מחקר המתפתח במהירות, וזה כבר טען שיש צורך בהבנה טובה יותר ומפורטת של astrocyte [Ca 2 +] i כדי לפתור חלק מאי הוודאות הנוכחי 6.
בעבודה האחרונה, זה היה הראה כי טעינה בתפזורת של צבעי מחוון אורגניים Ca 2 + לתוך האסטרוציטים לא מצליחה לזהות באופן אמין [Ca 2 +] i אותות בתוך האסטרוציטים כל בתרבות ובאתרו 7-10. ממצאים אלה נדונו על ידינו ואחרים 6,11,12. Emerginתמונת g היא ש[ Ca 2 +] i אותות בתוך תהליכי astrocyte (למשל, ענפים וbranchlets), המהווים את האתרים העיקריים לאינטראקציות עם תאי עצב וכלי דם, כמעט שלא נחקר בפירוט. לאחרונה, השימוש באינדיקטורים מקודד גנטי סידן (GECIs) כגון GCaMP3 cytosolic, GCaMP5G וGCaMP6 וקרום פלזמה גרסאות קשורות (למשל, LCK-GCaMP3) התיר למחקר שלי אותות [Ca 2 +] בתאים קטנים של האסטרוציטים כזה רזים כמו תהליכים, ליד קרום הפלזמה ובתוך טריטוריות שלמות 7,8. עם זאת, יש לי GECIs חסרון אחד על פני צבעי מחוון אורגניים Ca 2 + וזה הדרישה לשיטות גנטיות כדי לספק את הגנים מקודדות באופן סלקטיבי לתאים כוכביים in vivo לתקופות של שבועות לGECIs להיות כראוי הביע. ביטוי in vivo מושגת בדרך כלל באמצעות עכברים מהונדסים, לדפוק בעכברים או באפליקצית משלוח מבוסס וירוסמקקים. במאמר יופיטר הנוכחי אנו מדווחים שיטות ונהלים מועסקים כדי לספק GECIs להאסטרוציטים striatal באמצעות adeno הקשורים וירוסים. אנו מתמקדים בציטומגלווירוס-GCaMP3 כדוגמא, אבל באותו ההליך בסיסי עובד עבור כל Geci אחר או כתב חלבון פלואורסצנטי מבוסס.
השיטות שתוארו במסמך זה אפשרו לנו להביע את ציטומגלווירוס-GCaMP3 בהאסטרוציטים striatal in vivo להדמיה הבאה [Ca 2 +] i באתר. לשיטה זו יתרונות על פני שימוש במהונדס או עכברים לדפוק ב, כוללים ביטוי חזק של החלבון, המהירות ממוקדת וגמישות של יישום ניסיוני וספציפיות אנ?…
The authors have nothing to disclose.
רוב העבודה וכוח האדם המעורב נתמכו על ידי NIH מענק NS060677 ובחלקו על ידי מענקי NIH MH099559 וMH104069 (לBSK). חלק מהעבודה נתמכת גם על ידי קרן CHDI.
Syringe Pump | Harvard Apparatus | 704506 | |
Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
Micropipette puller | Narishige | PC-10 | |
Micropipette grinder | Narishige | EG-40 | |
pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3 | Addgene | 44331 | a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging |
I mL syringe | BD | 309628 | |
syringe needle | BD | 305109 | |
AAV2/5 virus | UPenn vector core | NA | |
Sudan red IV | Sigma-Aldrich | 67386 | |
Mineral oil | CVS Pharmacy | 152355 | |
Cryostat | Leica | CM3050 S | |
Stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900LS | |
High Speed Rotary Micromotor Kit | FOREDOM | K.1070 | |
Paraformaldehyde | Santa cruz biotechnology | sc-281692 | |
Super Glue | Krazy®Glue | KG925 | |
Microslicer | Ted Pella | DTK-Zero 1 | |
Confocal microscopes | Olympus | FV300 and FV1000 | |
Normal goat serum | Vector | S-1000 | |
chicken anti-GFP | Abcam | ab13970 | |
mouse anti-s100β | Sigma-Aldrich | S2532 | |
mouse anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
mouse anti-glutamine synthetase | Millipore | MAB302 | |
goat anti-mouse-Alexa546 | Invitrogen | A11003 | |
goat anti-chicken-Alexa488 | Invitrogen | A11039 | |
Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5J | |
Mounting Medium | Vector | H-1000 |