The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ.
Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca2+]i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca2+]i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca2+]i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca2+]i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca2+]i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca2+]i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca2+]i signals in the striatal microcircuitry.
الخلايا النجمية هي الخلايا الدبقية في كل مكان وفيرة من الدماغ. ومن الثابت أن الخلايا النجمية خدمة الدعم الحيوي والأدوار التماثل الساكن بما في ذلك التخفيف من K + التركيز في الفضاء خارج الخلية، امتصاص الناقلات العصبية، فضلا عن توفير المواد المغذية. ومع ذلك، تشير الدراسات الحديثة أنها أيضا عرض [كا 2+] ط إشارات، والتي تحدث بشكل عفوي وبنسبة نشاط الخلايا العصبية 1. وجود نجمية [كا 2+] ط إشارات لقد كان يعتقد على نحو متزايد لتحريك تواصلهم مع الخلايا العصبية، وعلى هذا النحو قد تفسر على أنها شكل من أشكال "كا 2+ استثارة" داخل الخلايا النجمية. وتشير البيانات المتاحة على مدى العقدين الماضيين في ضبط الخلايا النجمية والخلايا العصبية التي قد تواصل، ربما بطريقة ثنائية الاتجاه. أولا، تستجيب الخلايا النجمية في كثير من الأحيان مع زيادة في [كا 2+] أنا عندما تفعيلها من خلال الموصلات العصبية وneuromodulators سراحهم من الخلايا العصبية 2. الثانية، [كا 2+] ط زيادات في الخلايا النجمية تسبب اطلاق سراح يشير الجزيئات من الخلايا النجمية التي بدورها قد تؤثر على الخلايا العصبية والأوعية الدموية. تشير الدلائل إلى أن الجزيئات التي صدرت من الخلايا النجمية تؤدي إلى تغيرات في وظائف من نقاط الاشتباك العصبي، والدوائر والسلوك في نهاية المطاف 3-5 عبر نجمية إلى إشارات الخلايا العصبية. ومع ذلك، يظل هذا المجال البحوث تتطور بسرعة، وقيل أن فهم أفضل ومفصل نجمية [كا 2+] هناك حاجة ط لحل بعض الشكوك الحالية 6.
في الأعمال السابقة، وقد تبين أن تحميل الجزء الأكبر من العضوية الكالسيوم 2+ الأصباغ مؤشر إلى فشل الخلايا النجمية لكشف موثوق [كا 2+] ط إشارات داخل الخلايا النجمية بكاملها في الثقافة و7-10 في الموقع. وقد نوقشت هذه النتائج من قبل الولايات المتحدة وغيرها 6،11،12. ومؤسسة Emerginز الصورة هي أن [كا 2+] ط إشارات ضمن عمليات نجمية (على سبيل المثال، الفروع والأفرع)، وهي المواقع الأساسية للتفاعل مع الخلايا العصبية والأوعية الدموية، ونادرا ما يتم استكشافها بالتفصيل. في الآونة الأخيرة، واستخدام مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs) مثل GCaMP3 عصاري خلوي، GCaMP5G وGCaMP6 وغشاء البلازما الإصدارات المربوطة (على سبيل المثال، LCK-GCaMP3) قد يسمح دراسة [كا 2+] ط إشارات في مقصورات صغيرة من الخلايا النجمية مثل هذه عمليات رقيقة، بالقرب من غشاء البلازما وداخل الأراضي كلها 7،8. ومع ذلك، GECIs ديك عيب واحد على العضوية الكالسيوم 2+ مؤشر الأصباغ وهذا هو الشرط للطرق الوراثية لتقديم جينات ترميز بشكل انتقائي على الخلايا النجمية في الجسم الحي لفترات تتراوح بين أسابيع لGECIs أن يكون مناسب التعبير عنها. وعادة ما يتحقق التعبير في الجسم الحي باستخدام الفئران المعدلة وراثيا، الضربة القاضية في الفئران أو مع فيروس أساس تسليم التطبيقالصراصير. في المقالة إن الرب الحالية نفيدكم الأساليب والإجراءات المستخدمة لتقديم GECIs إلى الخلايا النجمية الجسم المخطط باستخدام فيروسات الغدة المرتبطة. ونحن نركز على خلوي GCaMP3 كمثال على ذلك، ولكن يعمل نفس الإجراء الأساسي لأي GECI الآخرين أو البروتين الفلوري مراسلة مقرها.
وقد أتاحت الطرق الموصوفة هنا لنا للتعبير عن خلوي GCaMP3 الخلايا النجمية في الجسم المخطط في الجسم الحي لاحق [كا 2+] ط التصوير في الموقع. هذا الأسلوب له مزايا أكثر باستخدام الفئران المعدلة وراثيا أو الضربة القاضية في، بما في ذلك التعبير القوي للاستهدا?…
The authors have nothing to disclose.
وقد أيد غالبية العمل والموظفين المشاركين من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح NS060677 وجزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح MH099559 وMH104069 (لBSK). وأيد بعض الأعمال أيضا من قبل مؤسسة CHDI.
Syringe Pump | Harvard Apparatus | 704506 | |
Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
Micropipette puller | Narishige | PC-10 | |
Micropipette grinder | Narishige | EG-40 | |
pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3 | Addgene | 44331 | a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging |
I mL syringe | BD | 309628 | |
syringe needle | BD | 305109 | |
AAV2/5 virus | UPenn vector core | NA | |
Sudan red IV | Sigma-Aldrich | 67386 | |
Mineral oil | CVS Pharmacy | 152355 | |
Cryostat | Leica | CM3050 S | |
Stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900LS | |
High Speed Rotary Micromotor Kit | FOREDOM | K.1070 | |
Paraformaldehyde | Santa cruz biotechnology | sc-281692 | |
Super Glue | Krazy®Glue | KG925 | |
Microslicer | Ted Pella | DTK-Zero 1 | |
Confocal microscopes | Olympus | FV300 and FV1000 | |
Normal goat serum | Vector | S-1000 | |
chicken anti-GFP | Abcam | ab13970 | |
mouse anti-s100β | Sigma-Aldrich | S2532 | |
mouse anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
mouse anti-glutamine synthetase | Millipore | MAB302 | |
goat anti-mouse-Alexa546 | Invitrogen | A11003 | |
goat anti-chicken-Alexa488 | Invitrogen | A11039 | |
Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5J | |
Mounting Medium | Vector | H-1000 |