A transfecção altamente eficiente de THP-1 por macrófagos humanos Nucleofection
Summary
Este protocolo apresenta um método eficaz e fiável para transfectar humanos THP-1, macrófagos com siRNA ou de ADN de plasmídeo por electroporação com alta eficiência de transfecção elevada, mantendo a vitalidade celular e capacidade total de diferenciação de macrófagos e de polarização.
Abstract
Os macrófagos, como os jogadores-chave da resposta imune inata, estão no foco da pesquisa lidando com homeostase do tecido ou várias patologias. A transfecção com siRNA e DNA plasmídeo é uma ferramenta eficiente para o estudo de sua função, mas a transfecção de macrófagos não é uma questão trivial. Embora muitas abordagens diferentes para a transfecção de células eucarióticas estão disponíveis, apenas alguns permitem transfecção eficiente e confiável de macrófagos, mas reduziu a vitalidade celular e comportamento das células severamente alterada como capacidade diminuída para a diferenciação ou polarização são freqüentemente observadas. Por conseguinte, um protocolo de transfecção é exigido que seja capaz de transferir siRNA e o DNA de plasmídeo em macrófagos, sem causar efeitos secundários graves, permitindo, assim, a investigação do efeito do siRNA ou plasmídeo no contexto do comportamento celular normal. O protocolo aqui apresentado fornece um método para a transfecção de forma fiável e eficiente humanos THP-1 e macrófagos monocytes com vitalidade celular elevada, alta eficiência de transfecção, e efeitos mínimos sobre o comportamento das células. Esta abordagem baseia-se Nucleofection eo protocolo foi otimizado para manter a capacidade máxima para a ativação de células após a transfecção. O protocolo é adequado para células aderentes após a separação, bem como células em suspensão, e pode ser usado para pequenas e médias números de amostra. Assim, o presente método é útil para investigar os efeitos reguladores do gene durante a diferenciação de macrófagos e de polarização. Além de apresentar os resultados que caracterizam macrófagos transfectados acordo com este protocolo, em comparação com um método químico alternativo, o impacto da cultura de células de seleção médio após transfecção no comportamento das células também é discutida. Os dados apresentados indicam a importância de validar a selecção de diferentes configurações experimentais.
Introduction
Entre os componentes celulares do sistema imunitário humano, os macrófagos são de grande importância para a resposta imune inata. Suas tarefas são diversas; eles estão envolvidos na fagocitose de agentes patogénicos e material necrótico, estes desempenham um papel importante na homeostase de tecido e produzem e segregam um grande número de citocinas para regular e orquestrar a resposta imune 1. Portanto, os macrófagos são integralmente envolvido em muitos processos fisiológicos e condições fisiopatológicas. Devido à diversidade das suas tarefas, os macrófagos são um tipo de célula muito heterogênea e multifacetada. Isto é conseguido por diferentes polarizações; dependendo macrófagos estímulos externos podem se desenvolver em diferentes fenótipos 2. Variabilidade e o impacto dos macrófagos na resposta imune torná-los objeto de pesquisa muito interessante. A fim de elucidar seu metabólica complexa e funções de regulação, macrófagos apropriado modelos in vitro são required que refletem corretamente heterogeneidade macrófagos e variabilidade.
A transfecção de células com vectores de DNA plasmídeo ou pequenos RNAs de interferência (siRNAs), a fim de alterar a expressão genética celular tornou-se uma ferramenta amplamente utilizada e poderosa em biologia celular para investigar tanto a regulação gênica e função do gene. Atualmente existe uma grande variedade de diferentes ferramentas disponíveis para a transfecção de células eucarióticas. Estas ferramentas incluem a aplicação de vectores virais, métodos mecânicos (tais como pistolas de genes), as abordagens químicas (que dependem de polímeros ou lípidos que podem formar complexos com os ácidos nucleicos), e electroporação de células 3. Todas estas abordagens têm as suas vantagens e desvantagens e escolher o mais adequado a partir desta matriz ampla para um tipo específico de célula e de aplicação pode ser um processo difícil e de consumir tempo.
Os macrófagos são notoriamente difíceis de transfectar transfe como quase todos bem estabelecidaabordagens ction reduzir drasticamente viabilidade 'macrófagos ou interferir com o seu comportamento, ou seja, a diferenciação e em particular de polarização. Portanto, apresentamos aqui um protocolo eficiente, não-viral para transf humanos THP-1 macrófagos utilizando a tecnologia Nucleofector baseada em eletroporação, o que representa uma abordagem eletroporação otimizado exigindo quantidades reduzidas de DNA. Nucleofection é bem adequado para as células sensíveis, tais como monócitos e macrófagos. Este protocolo é uma adaptação de versões publicadas anteriormente 4,5.
Em resumo, de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) é utilizada para diferenciar humanos Monócitos THP-1 durante 48 horas em macrófagos prematuros antes da transfecção com DNA de plasmídeo ou de siRNA. Para a transfecção os macrófagos predifferentiated são separadas enzimaticamente por tratamento Accutase eu. A transfecção é realizada usando um dispositivo Nucleofector 2b para electroporação das células. Após a transfecção, diferemciação é continuada durante mais de 24 a 48 horas, conforme necessário. Finalmente, os macrófagos maduros transfectadas são incubadas com diferentes tipos de compostos para estudos funcionais.
Esta abordagem permite a transfecção de linhas de células humanas, tais como THP-1, monócitos e macrófagos, e tem sido aplicada com êxito no passado 6-10. Em contraste com a maioria dos métodos de transfecção química, o nosso procedimento Nucleofection modificada usando macrófagos prematura produz altas eficiências de transfecção em combinação com a viabilidade das células intactas, sem a necessidade de utilizar vectores virais ou adicionar novos compostos veiculares com efeitos secundários desconhecidos. Além disso, os macrófagos retêm o seu potencial para a diferenciação assim como a polarização, permitindo, assim, as investigações funcionais desimpedidos 11 a seguir à transfecção.
Além disso, o meio de cultura de células aplicado após Nucleofection influencia fortemente estudos funcionais seguinte transfection; em particular, a capacidade dos macrófagos para a polarização pode ser influenciada pelo tipo de meio de cultura aplicadas. Aqui quatro diferentes tipos de meios de cultura celular (IMDM, X-VIVO 20, LGM3 e do rato T celular médio Nucleofector) foram testados em condições desativando usando interleucina (IL) 10 Usando THP-1 macrófagos, observamos que a resposta das células de IL10 é mais forte quando o meio celular Nucleofector rato T é utilizado em comparação com os outros meios de cultura acima mencionados. Estes resultados demonstram que a optimização adequada de todas as condições de cultura de células é essencial para a transfecção bem sucedida de estudos funcionais subsequentes und como estas podem melhorar significativamente os resultados experimentais.
Como os macrófagos estão envolvidos em várias doenças humanas, muita pesquisa está focada em elucidar o comportamento dos macrófagos, bem como mecanismos reguladores que influenciam macrófagos ou por sua vez controlados por macrófagos. Portanto, este protocolo é de relevância emmuitas áreas de investigação diferentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descrito aqui apresenta uma maneira confiável e eficiente para transf THP-1 macrófagos, que são geralmente bastante difícil para transf. A transfecção pode ser conseguida com a eficiência de transfecção de 90% para acima de siRNA, sem redução significativa da vitalidade celular. Eficiências de plasmídeos pode ser menor devido ao seu tamanho, mas de transfecção eficiência de cerca de 70% podem ser normalmente alcançados. A eficiência de knockdown mediada por siARN pode atingir 80 a 90%, dependendo do siRNA aplicada. Uma grande vantagem deste protocolo é que ele não interfira com a diferenciação celular. Após transfecção as células ainda responder normalmente a diferenciação agente PMA (Figura 1A a 1B e Figura 4) 12. Além polarização celular por estímulos de citocinas, tais como IL-10 ou com LPS / IFN-y não é afectada de 12, embora este também depende fortemente do meio seleccionada para cultura após a transfecção de ums mostrado na Figura 4.
Existem várias opções dentro do procedimento que pode ser modificado, a fim de adaptar o protocolo para requisitos específicos. Como mostrado na Figura 4, as células de reagir de forma diferente ao mesmo estímulo IL10, dependendo do meio de cultura seleccionado após a transfecção. Isto indica que a composição do meio tem uma forte influência sobre o comportamento celular. Como o efeito impostas pelo meio pode ser diferente para diferentes estímulos experimentais, é possível que a forma optimizada pode mudar e, por conseguinte, há uma necessidade de se verificar a adequação do meio de diferentes experiências de forma independente. No entanto, o meio RPMI-1640, que é a forma padrão usada para cultivo de células THP-1, tem provado ser pouco adequado para o cultivo após transfecção como observou-se uma significativa perda de vitalidade das células. Além disso, o protocolo pode também ser aplicado para monócitos THP-1 sem diferenciação induzida por PMA antes deste,obviamente, elimina a necessidade de separação de células durante o processo, mas todos os passos restantes não têm de ser ajustados. Os monócitos THP-1 podem ser diferenciadas em seguida, se necessário.
Os elementos mais críticos do protocolo são, em primeiro lugar o desapego e em segundo lugar o tempo necessário para a transfecção. A separação deve ser realizada o mais suavemente possível, a fim de manter a viabilidade celular elevada. Portanto, recomendamos o desprendimento enzimática relativamente leve por Accutase I em relação aos métodos bastante agressivos, como tripsinização. Outros métodos, tais como descolamento de tratamento com Lidocain ou raspagem foi encontrado para ser um pouco prejudicial e não deve ser utilizada. No caso de que 30 minutos de tratamento Accutase I não deve ser suficiente para retirar todas as células propriamente este geralmente é uma indicação de uma solução armazenada de forma incorrecta ou expirou Accutase I ou de vários ciclos de congelamento-descongelamento. Temos obtido bons resultados, armazenando pequenas alíquotas de Accutase I a -20 °C para reduzir o número de ciclos de congelamento e descongelamento. No entanto, quando existe descolamento insuficiente ou substituir Accutase I com Accutase fresco ou aumentar o tempo de incubação de até 1 h. Além toque suave ou a lavagem do frasco ou placa pode ajudar descolamento. No que diz respeito ao tempo necessário para a transfecção o tempo de exposição das células à solução de Nucleofector puro tem grande impacto na sobrevivência celular e, assim, deverá ser tão curto quanto possível. A melhor maneira de conseguir isso é a realização de cada transfecção de cada vez (Passos 2,10-2,15) e não vários transfections em paralelo.
Se a eficiência knockdown é baixo, o que normalmente não é causada por uma baixa eficiência de transfecção, mas isto pode ser facilmente verificado através de citometria de fluxo ou microscopia de fluorescência e de siARN marcado com fluorescência ou um plasmídeo que codifica a GFP. Principalmente a causa é um siRNA ou plasmídeo de DNA ineficiente. Sob estas circunstâncias deve considerar-se a aumentar a quantidade de siRNA (até 2-3 ug) ouo plasmídeo de ADN (até 1-2 mg) ou a utilização de um siRNA ou vector de expressão diferente, se disponível. Alternativamente, os resultados satisfatórios podem também ser conseguido através da utilização de uma associação de várias diferentes siRNAs dirigidos contra o mesmo alvo. Além disso, as experiências de cursos de tempo pode ser necessário determinar com precisão o período de efeito máximo, o qual é geralmente atingido após 24 a 72 h após a transfecção.
Para além da transfecção por electroporação, existem ainda as técnicas bem estabelecidas para a transfecção de células de mamíferos. Frequentemente são utilizados sistemas de agentes de transfecção químicas que podem formar complexos com o ácido nucleico de carga e, em seguida, facilitar o transporte para as células. Os reagentes mais usados são ou baseados em diferentes espécies de lípidos, ou pode ser escolhido a partir de um número de polímeros catiónicos 3. Para tanto se aproxima de uma variada seleção está disponível comercialmente. Estes reagentes de transfecção oferecem a vantagem de que eles são geralmenteé fácil de usar, não exigem muito tempo, e trabalhar com células aderentes, bem como, eliminando assim a necessidade de destacamento. Infelizmente, os macrófagos são bastante difíceis de transfectar por estes métodos como eles não proliferam significativamente in vitro e possuem mecanismos de defesa contra ADN citosólica externa 13-15. Assim, as abordagens química transfecção resultam frequentemente numa diminuição acentuada da viabilidade celular. No entanto, como mostrado na Figura 2, há agentes de transfecção químicos que podem ser transferidos com sucesso siRNA em macrófagos, mas como citometria de fluxo (Figura 2A) e de microscopia de fluorescência (Figura 2B) as análises indicam que eles não conseguem atingir a mesma distribuição homogénea de siRNA dentro das células como obtido por Nucleofection. Na verdade, os dados de citometria de fluxo indicam que duas populações diferentes de células transfectadas ocorrer, em primeiro lugar, com uma população semelhante de fluorescência que as células após Nucleofection é detectado e em segundo lugar, há uma população com mais intensa fluorescência. Confirmação definitiva ainda é necessário, mas supõe-se que a primeira população é na microscopia de fluorescência idênticas às células que apresentam uma distribuição homogénea de siRNA fluorescente dentro do citoplasma, enquanto a segunda população susceptível corresponde às células com aglomerados muito brilhantes. Os dados da citometria de fluxo mostrado na Figura 2A resultados sugerem que Nucleofection em menos de siRNA por célula do que a abordagem alternativa lipofecção. No entanto, os dados da Figura 3 mostra que, mesmo a quantidade comparativamente pequena de siRNA incorporada por Nucleofection já é suficiente para 80 a 90% knockdown do gene alvo. Portanto, o montante adicional de siRNA incorporado pela segunda população após transfecção química é muito provável excedente e é, portanto, mais propensos a causar efeitos colaterais indesejáveis do que para aumentar ainda mais a eficiência knockdown. Além de queformação de aglomerados intracelulares já é em si mesmo indesejável uma vez que estas moléculas não são siRNA provavelmente funcional ou, pelo menos, menos eficiente do que as moléculas de siRNA livres e pode causar efeitos fora do alvo. Além disso, a verdadeira natureza destes aglomerados ainda não está clara. É possível que estes pontos brilhantes representam endossomas, indicando que o siARN foi internalizada pelas células mas, subsequentemente, soltar a partir dos endossomas falhou e o siRNA permanece presa e, por conseguinte, ineficazes. Em alternativa, os pontos podem ser aglomerados que são formadas intracelularmente. Avaliações funcionais da transfecção química estão pendentes, portanto, não há indicações definitivas sobre a eficiência knockdown pode ser feito, no entanto, ainda a existência de duas populações distintas já é desfavorável, pois isso significa que todos os resultados descrevem a média de ambas as populações, este, portanto, não corresponde à quer das populações. Por essa razão é Nucleofection a abordagem superior.
<p class = "jove_content"> No entanto, há também limitações ao processo de transfecção descrito aqui. Uma vez que as células têm que estar em suspensão em células aderentes Nucleofection precisa ser desmontada, o que apresenta um factor de stress adicional para as células. Além disso, todo o protocolo é bastante moroso. Desde transfecções não podem ser realizadas simultaneamente, mas tem que ser realizada rapidamente, a fim de evitar os danos celulares, o número de amostras seja limitada a cerca de 8-10 por experiência. Assim, esse protocolo não é adequado para projetos de rastreio de elevada capacidade. Para aplicações de alto rendimento diferentes sistemas Nucleofector estão disponíveis. Em primeiro lugar, existe o sistema 4D-Nucleofector que proporciona um formato de tira 16 bem. Para ainda maior rendimento, há o sistema de transporte de 96 poços e 384 poços sistema HT Nucleofector. No entanto, como estes sistemas mais recentes trabalham com eletrodos de Polímeros Condutores em vez de alumínio e, portanto, condições elétricas, ou seja, programas e composition de solução Nucleofector, ter mudado de acordo, ele precisa ser determinado se o nosso protocolo pode ser transferida para esses sistemas.No entanto, apesar destas limitações do protocolo apresentado aqui se obter uma transfecção eficaz e fiável de células THP-1, que é superior a todas as outras abordagens não virais. Este protocolo permite a investigação dos efeitos de expressão genética alterada, em células THP-1, que em todos os outros aspectos diferenciam e segregam, normalmente e, portanto, mostram como pequenos efeitos secundários de transfecção quanto possível.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos gratos a Lonza Group Ltd. por patrocinar esta publicação, cobrindo os custos de publicação. Agradecemos a Deutsche Infarktforschungshilfe, Wilhelm-Vaillant-Stiftung, Ernest Solvay–Stiftung, eo Thüringer Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Kultur de apoio financeiro para SL.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Accutase I | Sigma-Aldrich | A6964 | |
| Amino acids, nonessential | PAA | M11-003 | |
| Centrifuge tubes (15 ml) | TPP | TPP91015 | |
| Fetal calf serum (FCS gold) | PAA | A15-151 | |
| Human Monocyte Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1007 | Contains Nucleofector Solution, cuvettes and Pasteur pipettes |
| Human serum off the clot | Lonza | C11-020 | |
| Isove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) with 25 mM HEPES and 25 mM L-glutamine | Lonza | 12-722F | |
| Lymphocyte Growth Medium 3 (LGM3) | Lonza | CC-3211 | |
| Mouse T Cell Nucleofector Medium | Lonza | VZB-1001 | |
| Nucleofector 2b | Lonza | AAD-1001 | |
| Penicillin / Streptomycin / L-glutamine (100×) | Sigma-Aldrich | G1146 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Fisher Scientific | BP685 | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI 1640) | PAA | E15-840 | |
| siRNA / plasmid | |||
| Sodium pyruvate (100 mM) | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| THP-1 human leukemia monocytes | CLS | 300356 | |
| Tissue culture flasks (75 cm²; 150 cm²) | TPP | TPP90076/TPP90151 | |
| Tissue culture plates (6-well; 12-well) | TPP | TPP92406/TPP92012 | |
| Tubes (1.5 ml) | StarLab | S 1615-5500 | |
| Water (nuclease-free) or appropriate siRNA/plasmid buffer | |||
| X-Vivo 20 with Gentamycin | Lonza | BE04-448Q | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |
Riferimenti
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