Un<em> In Vitro</emPreparazione muscolare-nervosa> Adult mouse per studiare le proprietà di cottura delle afferenze muscolari

Adeguati etici nazionali e istituzionali devono essere ottenuti prima di eseguire esperimenti su animali. 1 Rimozione di EDL muscoli e dei nervi Pesare e anestetizzare profondamente un topo adulto con isofluorane inalato usando un vaporizzatore con il 5% isofluorane più un 1,5 L / min flusso di ossigeno o di una campana di vetro con isofluorane imbevuto di cotone sul fondo. Assicurarsi che il mouse è profondamente anestetizzato e non risponde ad un pizzico punta. Decapitare rapidamente utilizzando grandi, forbici affilate o una ghigliottina. Fare un taglio linea mediana ventrale attraverso le costole con le forbici e rimuovere gli organi interni. Pelle animale afferrando la pelle dal collo e tirandolo oltre i piedi. Rimuovere le gambe tagliando sopra i fianchi e posizionare le gambe dalla pelle in un piatto con freddo (4 ° C), carbogenated (95% O 2, 5% di CO 2) basso livello di calcio, magnesio bicarbonato alta tamponata contai soluzione salinaning in mM: 128 NaCl, KCl 1.9, 1.2 KH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 0.85 CaCl 2, 6.5 MgSO 4, e 10, il glucosio (pH di 7,4 ± 0,05) 16. Il basso di calcio, soluzione ad alta magnesio inibisce la trasmissione sinaptica durante la dissezione. Posizionare le gambe lato dorsale nel piatto e pin le gambe e fianchi in giù con aghi o spilli insetti in modo che le articolazioni del ginocchio e della caviglia sono ad un angolo di 90 °. Inserire un perno su ciascuna estremità dei piedi e un pin su ciascuna delle cosce anteriore e posteriore per tenere il tessuto in posizione. Utilizzando le forbici a molla Castroviejo, sollevare lo strato superiore del muscolo sulle cosce e fare una linea mediana tagliare per esporre il nervo sciatico direttamente sotto. Il nervo sciatico si trova appena sotto lo strato muscolare superiore e corre sopra il femore dalla sua uscita in prossimità dei fianchi finché si dirama nel peroneo comune e nervo tibiale appena prima l'articolazione del ginocchio. Rimuovere il muscolo sopra il nervo sciatico fino al Point in cui le profonde peronei immersioni ramo del nervo nel muscolo flessore lungo dell'alluce (FHL) è visibile. Utilizzando # 55 pinze, sezionare il tessuto connettivo intorno al ramo peroneo per liberarlo dalle gastrocnemio e soleo muscoli, che sono sul lato mediale della tibia. Tagliare i tendini dei muscoli gastrocnemio e soleo e rimuovere con cautela li da sotto il nervo. Rimuovere il muscolo superficiale sulla parte laterale della tibia per esporre tre fasci distinti tendine alla caviglia-da mediale a laterale: FHL, EDL, e tibiale anteriore (TA), con l'EDL nascosto sotto il TA. Tagliare il tendine TA alla caviglia, sollevare il TA e lontano dalla EDL, e tagliare il muscolo vicino al ginocchio per rimuoverlo. Tagliare il tendine FHL alla caviglia e sollevarlo di nuovo per raggiungere la zona in cui il nervo entra nel FHL. Tagliare appena sotto quel punto e rimuovere ~ 2/3 del muscolo FHL. Tagliare il nervo sciatico più vicino possibile alla articolazione dell'anca come posbile e striscia delicatamente via tutti i rami nervosi, tranne per il ramo peroneo profondo. Tagliare i tendini EDL sia a caviglia e del ginocchio con grosse forbici a molla. Utilizzando forbici affilate, rimuovere la EDL, il restante FHL e nervo dal tessuto circostante tagliando attraverso l'osso della tibia al ginocchio ea metà strada attraverso la coscia. Tagliare l'osso della tibia rimanente in modo che solo la EDL, parte della FHL e nervo rimangono. 2 Montaggio del muscolo EDL e Nerve nella Bath Tissue (Figura 1A) Prima dell'inizio dell'esperimento, preparare il bagno tessuto. Costantemente profumato il bagno con ossigenata (100% O 2) liquido interstiziale sintetico (SIF) contenente (in mM) 123 NaCl, 3.5 KCl, 0,7 MgSO 4, 1.7 NaH 2 PO 4, 2.0 CaCl 2, 9.5 NaC 6 H 11 O ( gluconato di sodio), 5.5 glucosio, saccarosio 7,5, e 10 N -2-hydroxyethylpiperazine- N '-2-etL'acido hanesulfonic (HEPES); pH 7,4 ± 0,05 17. Si raccomanda una velocità di flusso di 15-30 ml / min. Viene mostrato un bagno disponibile in commercio di 25 ml con due elettrodi stimolanti fissati al fondo della vasca, un post tessuto montato e un supporto per un regolatore di forza e lunghezza (dimensioni approssimative bagno 8,5 centimetri x 3 cm x 1 cm per le specifiche vedi tabella dei materiali / attrezzature). Utilizzare il restante tessuto FHL per gestire l'isolato muscolo-nervo e metterlo nella vasca tessuti. Inserire un piccolo pezzo di sylgard sul fondo del piatto e utilizzare un perno insetto attraverso il rimanente tessuto FHL per stabilizzare il muscolo. Utilizzare 6-0 punti di sutura in seta per legare entrambi i tendini ed apporre una estremità al posto del tessuto e l'altra al braccio di leva della forza e regolatore di lunghezza (vedi Tabella dei materiali / attrezzature per le specifiche). Utilizzare la lunghezza più piccola sutura che è pratico. Rimuovere il perno di insetti e sylgard dopo aver legato i tendini. NOTA: Per facilitare facilecollegamento alla leva braccio un piccolo pezzo di filo può essere piegato in un "j" gancio sagomato e fissato al braccio leva con resina epossidica. La sutura può essere legato al filo anziché infilato nel piccolo foro sul braccio leva. Fai elettrodi di aspirazione da 16 SA vetro da prima con un estrattore micropipetta di vetro (calore = 286, Pull = 0, Velocity = 150, Tempo = 200); rompere la punta posteriore e macinare manualmente su una pietra per affilare fino a quando non vi è circa un cono 3 mm. Sciogliere la punta con un microforge al diametro interno punta desiderato tra 10 – 100 micron a seconda della zona del nervo si vuole campionare (vedi figure 1B-1C per elettrodo schematico e nella tabella dei materiali / Attrezzature per informazioni sul prodotto). Riempire un elettrodo di vetro di aspirazione premade al filo d'argento interno con SIF. Aspirare l'estremità tagliata del nervo nel elettrodo e collegarlo alla porta positivo di un amplificatore differenziale. Avvolgere l'elettrodo con un argento chloridedfilo che si collega alla porta negativo della headstage. A terra il bagno SIF eseguendo un secondo filo chlorided argento dal bagno alla porta terra del headstage. Anche a terra il tubo di perfusione alla gabbia di Faraday in più punti a ridurre il rumore elettrico introdotto tramite le pompe di perfusione. Stimolare il muscolo attraverso gli elettrodi montati su ciascun lato del muscolo nel bagno tessuto per indurre una contrazione contrazione. In alternativa posizionare un elettrodo stimolante sul tagliata del nervo. Aumentare la tensione stimolante finché si osserva una forza contrattile picco e quindi aumentare la tensione di un ulteriore 15% per raggiungere la tensione sovramassimale (0,5 di larghezza di impulso msec). Continuare le contrazioni contrazione alla tensione sopramassimale, con 10 sec di riposo nel mezzo, ma variare la lunghezza del muscolo finché una forza contrattile picco è raggiunto per trovare la lunghezza ottimale (L o) del muscolo. Tutte le rampe di lunghezza e le vibrazioni inizieranno con il muscolo in questo lengesimo. Lasciare la preparazione muscolo-nervo rimanga nel bagno per almeno 1 ora prima della successiva raccolta dati per consentire al tessuto di raggiungere la temperatura del bagno e per la normale trasmissione sinaptica a recuperare dopo dissezione in una soluzione a basso calcio. Per raccogliere i dati ad una temperatura diversa temperatura ambiente, posizionare una sonda di temperatura nella vasca di tessuto in prossimità del muscolo. Lentamente portare la vasca a temperatura pompando acqua riscaldata attraverso la piastra di carta igienica di base. Avvolgere argilla rilievi di riscaldamento per microonde intorno al serbatoio SIF per aiutare a mantenere una temperatura costante. 3 Raccolta dati Per identificare un afferente come afferente mandrino, registrare l'attività neuronale durante le contrazioni contrazione ripetute prodotte da una tensione di stimolo 0,5 sopramassimale msec consegnato una al secondo. NOTA: Muscle afferenze mandrino devono mettere in pausa durante il 18,19 contrazione contrazione (Figura 2). Uso dasoftware di acquisizione ta per applicare le variazioni di lunghezza a velocità diverse e diverse lunghezze. Utilizzare uno script personalizzato per automatizzare questo compito (vedi informazioni supplementari per uno screenshot dello script e le indicazioni su come personalizzare i tratti indicati). Applicare tratti rampa-and-hold di 4 sec a lunghezze tratto di 2,5%, 5%, e 7,5% o L e velocità tratto di 20, 40, o 60% o L / sec 15. NOTA: Vedere il manuale utente per forza specifica e regolatore di lunghezza per necessario fattore di conversione tensione-millimetro. Alla fine dell'esperimento, determinare la salute dei muscoli a 24 ° C con massime contrazioni tetaniche isometriche (500 msec treno, treno frequenza 120 Hz, 0,5 di larghezza di impulso msec, tensione sovramassimale). Confrontare la forza contrattile picco a valori precedentemente riportati (~ 24 N / cm 2 9,20).