Ein<em> In-vitro-</em> Adult Maus Muskel-Nerven Vorbereitung für das Studium der Brenneigenschaften des Muskel-Afferenzen

Entsprechenden nationalen und institutionellen Ethik sollte vor der Durchführung von Tierversuchen gewonnen werden. 1. Entfernung von EDL Muskel und Nerv Wiegen und tief betäuben einen erwachsenen Maus mit inhalativen Isofluoran mit einem Verdampfer mit 5% Isofluran sowie ein 1,5 l / min Sauerstoffflussrate oder eine Glasglocke mit Isofluoran getränkten Watte auf der Unterseite. Sicherzustellen, dass die Maus tief anästhesiert, und nicht zu einem Zehenklemm reagieren. Enthaupten schnell mit großen, geschärft einer Schere oder einem Guillotine. Machen Sie eine ventralen Mittellinie Schnitt durch die Rippen mit einer Schere entfernen und die inneren Organe. Die Haut des Tieres durch Greifen die Haut vom Halsbereich und ziehen vorbei an den Füßen. Entfernen Sie die Beine, indem über den Hüften und legen Sie die Beine Haut in eine Schüssel mit kaltem (4 ° C), carbogenated (95% O 2, 5% CO 2) geringe Kalzium Hoch Magnesiumbicarbonat Kochsalzlösung contaiNing in mM: 128 NaCl, 1,9 KCl, 1,2 KH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 0,85 CaCl 2, 6.5 MgSO 4, und 10 Glucose (pH 7,4 ± 0,05) 16. Der niedrige Kalzium Hochmagnesiumlösung hemmt die synaptische Übertragung während der Präparation. Legen Sie die Beine dorsale Seite nach oben in die Schüssel und stecken Sie die Beine und Hüften nach unten mit Nadeln oder Insekten Pins, so dass die Knie-und Knöchelgelenke im 90 ° Winkel sind. Legen Sie einen Stift an jedem Ende der Füße und auf jeder der vorderen und hinteren Oberschenkel einen Stift, um das Gewebe an Ort und Stelle zu halten. Castroviejo mit Federschere, heben Sie die obere Schicht der Muskel an den Oberschenkeln und eine Mittellinie geschnitten, um den Ischiasnerv direkt unter aussetzen. Der Ischiasnerv ist knapp unter dem oberen Muskelschicht gelegen und verläuft oberhalb des Oberschenkelknochens aus seiner Ausfahrt in der Nähe von den Hüften bis es Niederlassungen in den gemeinsamen Wadenbein und Schienbeinnerv kurz vor dem Kniegelenk. Entfernen Sie den Muskel über dem Ischiasnerv, bis die point, bei dem die tiefen Wadenbeinnerv Zweig taucht in das flexor hallucis longus (FHL) Muskel ist sichtbar. Mit # 55 Pinzetten, sezieren das Bindegewebe rund um den Wadenbein Zweig, um ihn von den gastrocnemius und soleus Muskeln, die an der medialen Seite der Tibia sind kostenlos. Schneiden Sie die Sehnen der gastrocnemius und soleus Muskeln und sorgfältig entfernen Sie sie aus unter dem Nerv. Entfernen Sie die oberflächliche Muskel auf der lateralen Seite des Schienbeins zu drei verschiedene Sehnenbündel am Sprunggelenk-von medial nach lateral aussetzen: FHL, EDS und tibialis anterior (TA), wobei der EDS unterhalb der TA verborgen. Schneiden Sie die TA Sehne am Sprunggelenk, heben Sie die TA oben und weg von der EDL, und schneiden Sie den Muskel in der Nähe der Knie, um sie zu entfernen. Schneiden Sie den FHL-Sehne am Knöchel und heben Sie sie zurück, um den Bereich, wo der Nerv in den FHL erreichen. Schneiden Sie direkt unter diesem Punkt und entfernen ~ 2/3 der FHL Muskel. Schneiden Sie den Ischiasnerv so nahe dem Hüftgelenk als poslich und schonend entfernen alles Nervenäste mit Ausnahme der tiefen Wadenbein Zweig. Schneiden Sie die EDL Sehnen an beiden Knöchel-und Kniegelenke mit großen Feder Schere. Mit einer scharfen Schere, entfernen Sie die EDL, die verbleibende FHL und Nerven aus dem umgebenden Gewebe durch einen Schnitt durch die Tibia Knochen im Knie und in der Mitte des Oberschenkels. Schneiden Sie die verbleibende Tibiaknochen, so dass nur die EDL, ein Teil der FHL und Nerven bleiben. 2. Montage der EDL Muskel und Nerv in das Gewebe Bath (Abbildung 1A) Vor Beginn des Experiments vorbereitet Gewebebad. Ständig durchströmen das Bad mit Sauerstoff angereichertem (100% O 2) synthetische interstitiellen Flüssigkeit (SIF), die (in mM) 123 NaCl, 3,5 KCl, 0,7 MgSO 4, 1,7 NaH 2 PO 4, 2,0 CaCl 2, NaCl 9,5 6 H 11 O ( Natriumgluconat), 5.5 Glucose, 7.5 Saccharose und 10 N-2-hydroxyethylpiperazine- N '-2 ethanesulfonic Säure (HEPES); pH 7,4 ± 0,05 17. Eine Fließgeschwindigkeit von 15-30 ml / min empfohlen. Gezeigt ist ein im Handel erhält Bad von 25 ml Kapazität mit zwei an der Unterseite der Wanne, brachten Gewebe Pfosten und einer Halterung für eine Kraft und Längenregler (ungefähre Abmessungen Badewanne befestigt stimulierenden Elektroden 8,5 cm x 3 cm x 1 cm; Spezifikationen siehe Tabelle der Materialien / Ausrüstung). Verwenden Sie die restlichen FHL Gewebe, um das isolierte Muskelnerv behandeln und legen Sie sie in das Gewebe Badewanne. Legen Sie ein kleines Stück Sylgard auf der Unterseite der Schale und verwenden Sie ein Insektenstift durch die verbleibenden FHL Gewebe, um den Muskel zu stabilisieren. Verwenden Sie 6-0 Seidenfäden, beide Sehnen binden und bringen ein Ende mit dem Gewebe Post und die andere mit dem Hebelarm der Kraft und Länge Controller (siehe Tabelle der Materialien / Ausrüstung für Daten). Verwenden Sie den kleinsten Fadenlänge, die praktisch ist. Entfernen Sie die Insektenstift und Sylgard, nachdem Sie die Sehnen gebunden haben. HINWEIS: Um einfach zu erleichternVerbindung mit dem Hebelarm ein kleines Stück Draht in einen "J" förmigen Haken in der Hebelarm mit Epoxy gebogen und befestigt werden. Das Nahtmaterial kann dann mit dem Draht verbunden werden, anstatt in die kleine Öffnung am Hebelarm fädelt. Machen Saugelektroden von SA 16 Glas indem Sie zuerst eine Glasmikropipette Puller (Heat = 286, Ziehen = 0, Velocity = 150, Time = 200); brechen Sie die Spitze zurück und manuell schleifen es auf einem Schleifstein, bis es zu einem 3 mm Konus. Schmelzen Sie die Spitze mit einem Mikroschmiede auf die gewünschte Innendurchmesser der Spitze von 10 – 100 um abhängig von dem Bereich der Nerven man von probieren möchte (siehe den 1B-1C für Elektrodenschaltplan und Tabelle der Materialien / Ausrüstung für Produktinformationen). Füllen Sie ein Glas vorgefertigten Saug-Elektrode mit der inneren Silberdraht mit SIF. Absaugen des geschnittenen Endes des Nervs in der Elektrode und eine Verbindung zu dem positiven Anschluss des Differenzverstärkers. Wickeln Sie die Elektrode mit einem chlorierten SilberDraht, der mit dem negativen Port des heads verbindet. Erden Sie die SIF-Bad, indem Sie einen zweiten chlorierten Silberdraht aus dem Bad zu Boden-Port des heads ist. Auch erden Infusionsschlauch an den Faraday-Käfig an mehreren Punkten zu elektrischen Störungen über die Perfusion Pumpen eingeführt mildern. Stimulieren die Muskeln über die auf beiden Seiten des Muskels im Gewebe Bad, ein Zucken Kontraktion induzieren montiert Elektroden. Alternativ stellen eine stimulierende Elektrode, die auf dem geschnittenen Ende des Nervs. Erhöhen Sie die anregende Spannung, bis eine Spitzenkontraktionskraft beobachtet und dann erhöhen die Spannung um weitere 15% auf supraSpannung (0,5 ms Pulsbreite) zu erreichen. Weiterhin Twitch Kontraktionen im supramaximaler Spannung mit einer 10 sec Rest dazwischen, sondern variieren die Länge des Muskels bis zu einem Spitzenkontraktionskraft erreicht ist, um die optimale Länge (L o) des Muskels zu finden. Alle Längen Rampen und Schwingungen mit dem Muskel an diesem Leng startenth. Damit das Muskelnerven Zubereitung in dem Bad für mindestens 1 Stunde bleiben, bevor nachfolgende Datenerfassung zu ermöglichen, das Gewebe um die Badtemperatur zu erreichen und für die normale synaptische Übertragung zu erholen folgende Zerlegung in einem niedrigen Calciumlösung. Um die Daten an einem anderen als Raumtemperatur Temperatur zu sammeln, legen Sie einen Temperaturfühler in das Gewebe Bad in der Nähe des Muskels. Langsam bringen das Bad auf Temperatur durch Pumpen erwärmte Wasser durch das Gewebe Bad Bodenplatte. Wickeln Ton mikrowellen Heizkissen um die SIF Reservoir zu helfen, eine gleichbleibende Temperatur. 3. Datensammlung Um eine afferente als afferenten identifizieren, notieren Sie die neuronale Aktivität während der wiederholten Kontraktionen Zucken von einem 0,5 ms supraSpannungsReiz produziert geliefert einmal pro Sekunde. HINWEIS: Muskelspindel-Afferenzen sollten während der Kontraktion Zucken 18,19 (Abbildung 2) zu unterbrechen. Verwenden data Erfassungssoftware zu Längenänderungen bei unterschiedlichen Geschwindigkeiten und zu unterschiedlichen Längen gelten. Verwenden Sie ein benutzerdefiniertes Skript, um diese Aufgabe zu automatisieren (siehe Zusatzinformationen für einen Screenshot des Skripts und Anweisungen, wie man die Strecken gegeben anpassen). Anlegerampen-Halte-Abschnitte von 4 Sekunden bei Dehnungslängen von 2,5%, 5% und 7,5% L o und Dehnungsgeschwindigkeiten von 20, 40 oder 60% L o / s 15. HINWEIS: Siehe Bedienungsanleitung für spezifische Kraft und Länge Controller für notwendig Spannungs-Millimeter-Umrechnungsfaktor. Am Ende des Experiments bestimmen Muskel Gesundheit bei 24 ° C mit maximalen isometrischen tetanischen Kontraktionen (500 ms Zug, Zug 120 Hz-Frequenz, 0,5 ms Pulsbreite, supraSpannung). Vergleichen Sie die Spitzenkontraktionskraft zu früher berichteten Werten (~ 24 N / cm 2 9,20).