La bactérie Clostridium botulinum produit une neurotoxine botulique, l'une des toxines biologiques les plus puissants connus à l'homme ^1. Il ya 7 sérotypes distincts de neurotoxines botuliques (BoNT / AG). BoNT / A-Gall induire une paralysie à la jonction neuromusculaire due à la protéolyse complexe SNARE ^2,3. SNARE protéolyse empêche neurotransmetteur vésicule-membrane fusion et donc blocs neurotransmetteur exocytose ^4. La cible SNARE spécifique dépend du sérotype BoNT notamment impliqué dans le processus d'intoxication. BoNT / A et BoNT / E clivent la SNAP-25 alors que BoNT / C clive les deux SNAP-25 et syntaxine ^5. Le sérotypes restants synaptobrévine Cleave (appelé aussi associée à la vésicule protéine membranaire (VAMP). BoNT / A a été choisi pour le développement de tests car il est responsable d'une forte proportion de botulisme d'origine naturelle et a la plus longue durée d'action ^6. Développement de la petite molécule thérapeutique contre BoNT / A est un objectif majeur pournotre programme de découverte de médicaments et a utilisé des méthodes à base de cibles traditionnelles pour identifier des inhibiteurs place protéolytiques actives ^{7, 8-10.} Cependant, la création d'inhibiteurs de site actif avec une activité à large spectre contre plusieurs sérotypes et post-exposition efficacité sera probablement difficile.

Nous avons donc mis en place une approche novatrice, phénotypique découverte de médicaments qui utilise BoNT SNAP-25 clivage comme critère d'évaluation fonctionnelle pour identifier les petites molécules qui peuvent bloquer BoNT médiation intoxication des neurones moteurs. SNAP-25 est nécessaire pour la libération de neurotransmetteurs, comme la dégradation de SNAP-25 est un facteur prédictif de la paralysie et de la létalité in vivo. Par exemple, le criblage cellulaire pourrait conduire à la découverte de nouveaux modulateurs de facteurs cellulaires responsables de l'inactivation de la toxine ou l'inhibition des voies de toxines dans les cellules ciblées. Un facteur important dans le développement de tests phénotypiques est la sélection de modèles biologiques physiologiquement pertinents. We et d'autres ont décrit la souris souches embryonnaires (ES) motoneurones dérivés de cellules qui récapitulent le caractère immunologique de neurones moteurs primaires, y compris l'expression de SNAP-25 ^{11- 13.} Fait important, ces systèmes cellulaires sont très sensibles à la BoNT / A et démontrent l'intoxication clivage dépendant de la dose de SNAP-25 en réponse à des concentrations de toxine ^11,12 croissant. Les neurones moteurs différenciés sont également produites en quantités suffisantes pour l'analyse comparative de la plaque à haut débit et a permis la conception d'un ensemble de tests cellulaires.

Le test phénotypique est une méthode d'immunofluorescence utilisant deux anticorps distincts à quantifier clivage de pleine longueur exprimé de manière endogène SNAP-25 au cours de la BoNT / A ivresse de la culture souris du motoneurone. Un terminal carboxyle de BoNT / A (BACS) de clivage anticorps qui reconnaît sensible seulement longueur SNAP-25 permet l'évaluation de la BoNT / A à médiation par protéolyse de SNAP-25expression dans le moteur de la souris ¹⁰ neurones. Un schéma de principe du dosage du HCl est représenté sur la figure 1.