Une teneur élevée test d'imagerie pour l'identification des inhibiteurs de la neurotoxine botulique
Summary
Botulinum neurotoxin is one of the most potent toxins among Category-A biothreat agents, yet a post-exposure therapeutic is not available. The high content imaging approach is a powerful methodology for identifying novel inhibitors as it enables multiparameter screening using biologically relevant motor neurons, the primary target of this toxin.
Abstract
Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic neurotransmitter release. Botulinum neurotoxin serotype A (BoNT/A) is a zinc metalloprotease that blocks exocytosis of neurotransmitter by cleaving the SNAP-25 component of the SNARE complex. Currently there are no licensed medicines to treat BoNT/A poisoning after internalization of the toxin by motor neurons. The development of effective therapeutic measures to counter BoNT/A intoxication has been limited, due in part to the lack of robust high-throughput assays for screening small molecule libraries. Here we describe a high content imaging (HCI) assay with utility for identification of BoNT/A inhibitors. Initial optimization efforts focused on improving the reproducibility of inter-plate results across multiple, independent experiments. Automation of immunostaining, image acquisition, and image analysis were found to increase assay consistency and minimize variability while enabling the multiparameter evaluation of experimental compounds in a murine motor neuron system.
Introduction
La bactérie Clostridium botulinum produit une neurotoxine botulique, l'une des toxines biologiques les plus puissants connus à l'homme 1. Il ya 7 sérotypes distincts de neurotoxines botuliques (BoNT / AG). BoNT / A-Gall induire une paralysie à la jonction neuromusculaire due à la protéolyse complexe SNARE 2,3. SNARE protéolyse empêche neurotransmetteur vésicule-membrane fusion et donc blocs neurotransmetteur exocytose 4. La cible SNARE spécifique dépend du sérotype BoNT notamment impliqué dans le processus d'intoxication. BoNT / A et BoNT / E clivent la SNAP-25 alors que BoNT / C clive les deux SNAP-25 et syntaxine 5. Le sérotypes restants synaptobrévine Cleave (appelé aussi associée à la vésicule protéine membranaire (VAMP). BoNT / A a été choisi pour le développement de tests car il est responsable d'une forte proportion de botulisme d'origine naturelle et a la plus longue durée d'action 6. Développement de la petite molécule thérapeutique contre BoNT / A est un objectif majeur pournotre programme de découverte de médicaments et a utilisé des méthodes à base de cibles traditionnelles pour identifier des inhibiteurs place protéolytiques actives 7, 8-10. Cependant, la création d'inhibiteurs de site actif avec une activité à large spectre contre plusieurs sérotypes et post-exposition efficacité sera probablement difficile.
Nous avons donc mis en place une approche novatrice, phénotypique découverte de médicaments qui utilise BoNT SNAP-25 clivage comme critère d'évaluation fonctionnelle pour identifier les petites molécules qui peuvent bloquer BoNT médiation intoxication des neurones moteurs. SNAP-25 est nécessaire pour la libération de neurotransmetteurs, comme la dégradation de SNAP-25 est un facteur prédictif de la paralysie et de la létalité in vivo. Par exemple, le criblage cellulaire pourrait conduire à la découverte de nouveaux modulateurs de facteurs cellulaires responsables de l'inactivation de la toxine ou l'inhibition des voies de toxines dans les cellules ciblées. Un facteur important dans le développement de tests phénotypiques est la sélection de modèles biologiques physiologiquement pertinents. We et d'autres ont décrit la souris souches embryonnaires (ES) motoneurones dérivés de cellules qui récapitulent le caractère immunologique de neurones moteurs primaires, y compris l'expression de SNAP-25 11- 13. Fait important, ces systèmes cellulaires sont très sensibles à la BoNT / A et démontrent l'intoxication clivage dépendant de la dose de SNAP-25 en réponse à des concentrations de toxine 11,12 croissant. Les neurones moteurs différenciés sont également produites en quantités suffisantes pour l'analyse comparative de la plaque à haut débit et a permis la conception d'un ensemble de tests cellulaires.
Le test phénotypique est une méthode d'immunofluorescence utilisant deux anticorps distincts à quantifier clivage de pleine longueur exprimé de manière endogène SNAP-25 au cours de la BoNT / A ivresse de la culture souris du motoneurone. Un terminal carboxyle de BoNT / A (BACS) de clivage anticorps qui reconnaît sensible seulement longueur SNAP-25 permet l'évaluation de la BoNT / A à médiation par protéolyse de SNAP-25expression dans le moteur de la souris 10 neurones. Un schéma de principe du dosage du HCl est représenté sur la figure 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
La puissance élevée de neurotoxines botuliques et la facilité relative de leur armement a abouti à leur classification dans la catégorie A (priorité) les agents de bioterrorisme par les US Centers for Disease Control and Prevention. Malheureusement, il n'y a pas approuvé par la FDA thérapeutiques pour contrer BoNT intoxication après la toxine a été intériorisée par les neurones moteurs. Tout mécanisme druggable qui favorise la récupération neuronale de BoNT intoxication pourrait conduire à l'él…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding was provided by the Joint Science and Technology Office – Chemical Biological Defense (JSTO-CBD) Defense Threat Reduction Agency (DTRA) under sponsor project number CCAR# CB3675 and National Institutes of Health (1 R21 AI101387-01 and 5 U01AI082051-05).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Botulinum neurotoxin A | Metabiologics | NA | No catalog number |
| Microtitre plates | Greiner | 655946 | Poly-D-Lysine 96-well plates |
| BACs antibody | Lampire Biological | NA | |
| Microchem | National | 0255 | |
| Methanol | Thermo Scientific | A412-20 | |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050 | |
| PE JANUS MDT Mini Automated Workstation | Perkin Elmer | AJMDT01 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Triton X 100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| BIII tubulin antibody | R&D Systems | BAM1195 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379-1L | |
| Hoechst 33342dye | Invitrogen | 3570 | |
| Antimouse IgG | Invitrogen | A21236 | |
| Anti rabbit IgG | Invitrogen | A10042 | |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.4 | |
| Spotfire | Perkin Elmer | Ver 5.5 | |
| Clorox bleach | Fisher Scientific | 18-861-284 | |
| PlateStack |
Riferimenti
- Lamanna, C. The most poisonous poison. Science. 130, 763-772 (1959).
- Dover, N., Barash, J. R., Hill, K. K., Xie, G., Arnon, S. S. Molecular Characterization of a Novel Botulinum Neurotoxin Type H Gene. J. Infect. Dis. , (2013).
- Hakami, R. M., Ruthel, G., Stahl, A. M., Bavari, S. Gaining ground: assays for therapeutics against botulinum neurotoxin. Trends in microbiology. 18, 164-172 (2010).
- Yersin, A., et al. Interactions between synaptic vesicle fusion proteins explored by atomic force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 8736-8741 (2003).
- Dong, M., Tepp, W. H., Johnson, E. A., Chapman, E. R. Using fluorescent sensors to detect botulinum neurotoxin activity in vitro and in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 14701-14706 (2004).
- Stahl, A. M., Adler, M., and, C. B. M., Gilfillan, L. Accelerating botulism therapeutic product development in the Department of Defense. Drug Development Research. 70, 303-326 (2009).
- Nuss, J. E., et al. Development of cell-based assays to measure botulinum neurotoxin serotype A activity using cleavage-sensitive antibodies. Journal of biomolecular screening. 15, 42-51 (2010).
- Opsenica, I., et al. A chemotype that inhibits three unrelated pathogenic targets: the botulinum neurotoxin serotype A light chain, P. falciparum malaria, and the Ebola filovirus. Journal of medicinal chemistry. 54, 1157-1169 (2011).
- Opsenica, I., et al. The synthesis of 2,5-bis(4-amidinophenyl)thiophene derivatives providing submicromolar-range inhibition of the botulinum neurotoxin serotype A metalloprotease. European journal of medicinal chemistry. 53, 374-379 (2012).
- Nuss, J. E., et al. Pharmacophore Refinement Guides the Rational Design of Nanomolar-Range Inhibitors of the Botulinum Neurotoxin Serotype A Metalloprotease. ACS medicinal chemistry letters. 1, 301-305 (2010).
- Kiris, E., et al. Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery. Stem cell research. 6, 195-205 (2011).
- Pellett, S., et al. Neuronal targeting, internalization, and biological activity of a recombinant atoxic derivative of botulinum neurotoxin A. Biochemical and biophysical research communications. 405, 673-677 (2011).
- McNutt, P., Celver, J., Hamilton, T., Mesngon, M. Embryonic stem cell-derived neurons are a novel, highly sensitive tissue culture platform for botulinum research. Biochemical and biophysical research communications. 405, 85-90 (2011).
- Fischer, A., et al. Bimodal modulation of the botulinum neurotoxin protein-conducting channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 1330-1335 (2009).
