التعبير البروتين المؤتلف لعلم الأحياء الهيكلي في HEK 293F خلايا نظام التعليق: رواية ويمكن الوصول إليه المنهج
Summary
The expression of recombinant proteins by mammalian systems is becoming an attractive method for producing protein complexes for structural biology. Here we present a simple yet highly efficient expression system using suspension grown mammalian cells to purify protein complexes for structural studies.
Abstract
The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two decades, prokaryotic expression systems such as E. coli have dominated the scientific literature over costly and less efficient eukaryotic cell lines. Despite the clear advantage in terms of yields and costs of expressing recombinant proteins in bacteria, the absence of specific co-factors, chaperones and post-translational modifications may cause loss of function, mis-folding and can disrupt protein-protein interactions of certain eukaryotic multi-subunit complexes, surface receptors and secreted proteins. The use of mammalian cell expression systems can address these drawbacks since they provide a eukaryotic expression environment. However, low protein yields and high costs of such methods have until recently limited their use for structural biology. Here we describe a simple and accessible method for expressing and purifying milligram quantities of protein by performing transient transfections of suspension grown HEK (Human Embryonic Kidney) 293F cells.
Introduction
وقد أدى التقدم السريع لبيولوجيا الخلية الجزيئية والحاجة المستمرة لتحسين العقاقير في الطب حاجة لعلماء الأحياء الهيكلية للنظر في الهياكل البروتين على نحو متزايد أكثر تعقيدا. يمكن لهذه غالبا ما تتطلب تعديلات خاصة بعد متعدية، المحرمين الجزيئية والعوامل المشتركة لدعم للطي من محكم والنشاط الأنزيمي. في حين أن الغالبية العظمى من الهياكل الحالية في بنك معلومات البروتين قد تم الحصول عليها باستخدام أنظمة التعبير البكتيرية، بدائيات النوى غير قادرة على تنفيذ عدد كبير من هذه التعديلات وتفتقر العديد من العوامل المشارك حقيقية النواة الأساسية. وهذا يمكن أن يكون مشكلة لدراسة المجمعات متعددة فرعية الكبيرة التي يتم تفعيلها من خلال جزيئات صغيرة مما يشير كذلك لالنووية وسطح الخلية والبروتينات يفرز التي تتطلب وضع آليات قابلة للطي. وهناك عدد من E. وقد تم تصميم سلالات القولونية للتغلب على بعض هذه القيود 1. في السنوات الأخيرة، ومع ذلك، فإن استخدام منظم التعبير ammalian قد تزايد لأنها تنتج موثوق البروتينات حقيقية النواة التي هي على خلاف ذلك للتعبير عن إشكالية في الأنظمة الأخرى 2. اليوم، فإنه من الممكن الحصول على خطوط الخلايا التعبير الثدييات مستقرة وعابرة من خلال مجموعة متنوعة من التقنيات التي تتراوح بين تنبيغ الفيروسية لترنسفكأيشن بوساطة الكيميائية والفيزيائية تحويل الجينات مثل Electroporation للوالحقن المباشر 3. في حين أن كل من هذه الأساليب لديها مجموعة من المزايا والعيوب، فقط عدد قليل منها هي مناسبة للدراسات الهيكلية أنها إما مكلفة للغاية و / أو وقتا طويلا.
نحن هنا وصف طريقة بسيطة جدا وسريعة، وغير مكلفة حتى الآن كفاءة عالية للتعبير عن مجمعات البروتين لعلم الأحياء الهيكلي في تعليق نمت خلايا الثدييات. يستخدم نهج عابر شارك في ترنسفكأيشن خط الجنينية البشرية الكلى (HEK) الخلايا (مثل خلايا حرة HEK 293F). وقد استمدت هذه الخلايا من 293 م HEKخط ليرة لبنانية، يتم تكييفها لتنمو في الثقافات تعليق، ووصلت كثافة عالية باستخدام المصل خالية سائل الإعلام (مثل حرة 293 التعبير المتوسطة). ثم و transfected خلايا عابر باستخدام نسخة من أفرع polyethylenimine (PEI)، وكاشف البوليمرية غير مكلفة التي ذكرت في العمل لمجموعة كبيرة من خلايا الثدييات 4 من خلال تشكيل الحمض النووي / المجمعات PEI التي تدخل الخلية المضيفة عن طريق الإلتقام 5. هذا الأسلوب هو مناسبة لكلا نطاق صغير (30 مل) وعلى نطاق واسع (ما يصل الى 300 مل) التجارب ويمكن أن تنتج مستويات عالية من المجمعات البروتين المنقى. انها مفيدة بشكل خاص لدراسة البروتينات التي تتطلب أجهزة معقدة للطي، والعوامل المشارك أو خاصة التعديلات بعد متعدية التي لا يمكن أن يقوم بها البكتيريا والخميرة وخلايا الحشرات.
في هذا البروتوكول نقدم التعبير وتنقية السقالة وسط ثلاثة البروتين من مجمع القمع النسخي Sin3A. هذا يتكون من هيستونDeacetylase 1 (HDAC1)، المكثف من المعيب إسكات 3 (SDS3) والتبديل مستقلة-3 (Sin3A). يتم استخدام مجمع النقي للمحاكمات تبلور عالية الإنتاجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
قمنا بتطوير طريقة فعالة واضحة وبكلفة (PEI تكاليف أقل بكثير من المتاحة تجاريا الكواشف ترنسفكأيشن محبة للدهون) للتعبير عن وتنقية كميات كبيرة من البروتينات المؤتلف والمجمعات متعددة فرعية من خلايا الثدييات. يمكن الوصول ترنسفكأيشن الأمثل والكفاءة التعبير إذا تم استخدام DNA البلازميد نقية للغاية (260/280 بين 1.8 و 2.0) في تركيبة مع PEI كما هو موضح في قسم البروتوكول. يجب أن يكون مثقف الخلايا في serum- وخالية من المضادات الحيوية وسائل الإعلام، وبالتالي، مطلوب تقنية معقمة بدقة عن الركض والخلايا transfecting من أجل تجنب العدوى مكلفة وتستغرق وقتا طويلا. وينبغي أن يكون بقاء الخلية 90٪ أو أعلى، وينبغي ألا نمت الثقافات إلى كثافة أكبر من 2.5 × 10 6 خلية / مل على الفور قبل ترنسفكأيشن، لأن ذلك سوف يقلل العائد البروتين. لترنسفكأيشن ناجحا، يجب الثقافات تحتوي فقط على الخلايا واحدة أو تقسيم. يمكن تقسيم المجموعات من قبل قوةvortexing لالأوس 20 الى 30 ثانية (الشكل 5). نسبة كل بلازميد المستخدمة في التعاون ترنسفكأيشن يمكن أن تختلف من قبل المستخدم وفقا لرياضيات الكيمياء للكائن معقد دراستها. يمكن تحسين كفاءة التعبير عن البروتين من الفائدة، بحيث يمكن إنشاء الوقت التعبير مناسب. يجب أن يتم تنفيذ تنقية حفظ البرد عينة البروتين في جميع الأوقات للحد من مخاطر تدهور بروتين غير المرغوب فيها. اختيار العلامات ومخازن تنقية أمر بالغ الأهمية، لأنها قد تتداخل مع العناصر الهيكلية أو المواقع المفعلة بعض البروتينات، مما أدى إلى انخفاض الذوبان و / أو فقدان النشاط الأنزيمي في كثير من الأحيان. transfections صغار مفيدة بشكل خاص لاختبار بنيات مختلفة لتنقية البروتين المجمعات الكبيرة.
اليوم، تتوفر للتعبير عن البروتينات المؤتلف حقيقية النواة (الجدول 2) مجموعة كبيرة ومتنوعة من منهجيات بديلة. على سبيل المثال، Baculoviويستخدم روس التعبير في خلايا الحشرات على نطاق واسع بسبب ارتفاع كفاءة ترنسدوكأيشن وافتقارها إلى سمية الخلايا بالمقارنة مع الأنواع الفيروسية الأخرى 6. ومع ذلك، فإن عملية جعل الفيروس تستغرق وقتا طويلا ولا يسمح عدم الاستقرار الفيروس ليتم تخزينها لفترات طويلة. من ناحية أخرى، نظم الخميرة التعبير توفر إمكانية خلايا الكثافة إلى عالية جدا متزايد في الثقافات تخمير، مما أدى إلى عوائد بروتين عالية 7. لكنها لا تزال تفتقر إلى مجموعة كاملة من التعديلات بعد متعدية المطلوبة للبروتينات حقيقية النواة لأضعاف بشكل صحيح والتفاعل مع الشركاء البروتين. HDAC3، على سبيل المثال، يتم التعبير لكن لا أضعاف في E. القولونية. ومع ذلك، عندما أعرب في 293F الخلايا، وتمكنا من تنقية انزيم نشط في مجمع مع الجهات المشاركة في كاظمة (SMRT) وجزيء من اينوزيتول tetraphosphate (IP4) 8، والتي لم يتم العثور في الخلايا أولية النواة. هذه الطريقة سمحت لنا أيضا لتنقية وحل الكريستال الحادي وructure من HDAC1 التفاعل مع MTA1 في مجمع NuRD، الذي ينشط مماثل IP4 9. من الناحية المثالية، نود دائما للتعبير عن البروتينات في حقيقية النواة الطبيعية وبيئتها الفسيولوجية. وقد وصفت النظم التعبير الثدييات التي تستخدم خلايا HEK 293-EBNA1 في المفاعلات الحيوية 10-12 وتسفر مستويات عالية جدا من البروتين، ولكن هذه يمكن أن تكون معقدة للاستخدام.
أسلوبنا هو بديل بسيط وفي متناول التعبير في أنظمة البكتيريا والخميرة ومفاعل حيوي. طريقة التعبير هو سريع ولا يتطلب استخدام معدات غالية الثمن، خاصة إذا تم استبدال الأسطوانة زجاجة أو قارورة الجو مع 5٪ CO 2 وتستخدم حاضنات تهز القياسية. وقد استخدمنا هذه البروتوكولات إلى المشاركة في البلازميدات بالنقل متعددة وتنقية المجمعات مع ما يصل الى خمسة البروتينات مع غلة> 1 ملغ / لتر من الثقافة. ومن المثير للاهتمام، ونظام يساعد على تحديد مستقرة المجمعات حسن تصرف. على سبيل المثال، السابقأعطى بريشن من مجمع ثنائي HDAC1 وSin3A عوائد محدودة من البروتين، ولكن أدت إضافة SDS3 في 5 أضعاف كميات أكبر، وبالتالي يوجه الأحياء الهيكلي في اختيار التركيبات المناسبة والمجمعات مستقرة للتبلور.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر الدكتور يانغ شياو ون (PROTEX خدمة الاستنساخ) لإعداد بنيات التعبير المستخدم لهذا العمل وجامعة ليستر الخدمات الأساسية الحيوية. وأيد هذا العمل من قبل studentship BBSRC، وبرنامج يلكوم ترست والمنح باحث العليا WT085408 وWT100237 وBBSRC منح RM31G0224.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| FreeStyle HEK 293F cells | LifeTechnologies | R790-07 | |
| FreeStyle 293 Expression Medium | LifeTechnologies | 12338-018 | |
| Anti-FLAG M2 Affinity Gel | SIGMA | A220 | |
| 250 ml Erlenmeyer Flask with Vented Cap | Corning | 431144 | |
| Roller bottles with vented caps | Corning | 01836-02 | |
| Polyethylinamine, 25 kDa, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | Make 0.5 mg/ml stocks in H2O, adjust pH to 7.0 with dilute HCl and store at -20 – 4ºC |
| Mammalian expression vector | – | – | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 0.22 µm Centrifugal Filter Units | Amicon | UFC30GV00 | |
| 15 ml Ultra centrifugal filters (10 kDa cut-off) | Amicon | UFC901008 | |
| Superdex 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17-5175-01 |
Riferimenti
- Baneyx, F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current opinion in biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).
- Aricescu, A. R., Owens, R. J. Expression of recombinant glycoproteins in mammalian cells: towards an integrative approach to structural biology. Current opinion in structural biology. 23 (3), 345-356 (2013).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and bioanalytical chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Boussif, O., Zanta, M. A., Behr, J. P. Optimized galenics improve in vitro gene transfer with cationic molecules up to 1000-fold. Gene therapy. 3 (12), 1074-1080 (1996).
- Godbey, W. T., Wu, K. K., Mikos, A. G. Poly (ethylenimine) and its role in gene delivery. Journal of Controlled Release. 60 ((2-3)), 149-160 (1999).
- Beljelarskaya, S. N. Baculovirus expression systems for production of recombinant proteins in insect and mammalian cells. Biologia Molecolare. 45 (1), 123-138 (2011).
- Cregg, J. M., Vedvick, T. S., Raschke, W. C. Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris. Nature Biotechnology. 11 (8), 905-910 (1993).
- Watson, P. J., Fairall, L., Santos, G. M., Schwabe, J. W. R. Structure of HDAC3 bound to co-repressor and inositol tetraphosphate. Nature. 481 (7381), 335-340 (2013).
- Millard, C. J., Watson, P. J., et al. Class I HDACs Share a Common Mechanism of Regulation by Inositol Phosphates. Molecular Cell. 51 (1), 57-67 (2013).
- Tom, R., Bisson, L., Durocher, Y. Transfection of HEK293-EBNA1 Cells in Suspension with Linear PEI for Production of Recombinant Proteins. CSH protocols. , pdb.prot4977 (2008).
- Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic Acids Research. 30 (2), (2002).
- Baldi, L., Muller, N., et al. Transient Gene Expression in Suspension HEK‐293 Cells: Application to Large‐Scale Protein Production. Biotechnology Progress. 21 (1), 148-153 (2005).
