Рекомбинантный белок Выражение для структурной биологии в НЕК 293F суспензии клеток: роман и доступного подхода,
Summary
The expression of recombinant proteins by mammalian systems is becoming an attractive method for producing protein complexes for structural biology. Here we present a simple yet highly efficient expression system using suspension grown mammalian cells to purify protein complexes for structural studies.
Abstract
The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two decades, prokaryotic expression systems such as E. coli have dominated the scientific literature over costly and less efficient eukaryotic cell lines. Despite the clear advantage in terms of yields and costs of expressing recombinant proteins in bacteria, the absence of specific co-factors, chaperones and post-translational modifications may cause loss of function, mis-folding and can disrupt protein-protein interactions of certain eukaryotic multi-subunit complexes, surface receptors and secreted proteins. The use of mammalian cell expression systems can address these drawbacks since they provide a eukaryotic expression environment. However, low protein yields and high costs of such methods have until recently limited their use for structural biology. Here we describe a simple and accessible method for expressing and purifying milligram quantities of protein by performing transient transfections of suspension grown HEK (Human Embryonic Kidney) 293F cells.
Introduction
Стремительный прогресс биологии молекулярной клеточной и постоянная потребность в улучшенных препаратов в медицине создал необходимость структурных биологи смотреть на все более сложных белковых структур. Они могут часто требуют особых пост-трансляционных модификаций, молекулярные сопровождающих и ко-факторов, чтобы поддержать их сложную укладку и ферментативную активность. В то время как подавляющее большинство структур, присутствующих в белке банка данных были получены с использованием бактериальных систем экспрессии, прокариоты не могут выполнять большое количество этих модификаций и имеют много существенных эукариотических ко-факторов. Это может быть проблемой для изучения крупных мульти-субъединицы комплексов, которые активируются малыми сигнальных молекул, а также для атомной, клеточной поверхности и секретируемых белков, которые требуют сложных складные механизмы. Ряд Е. штаммы кишечной палочки были разработаны с целью преодоления некоторых из этих ограничений 1. В последние годы, однако, использование мammalian системы экспрессии растет, потому что они надежно производить эукариотических белков, которые в противном случае проблематично выразить в других системах 2. В настоящее время можно получить стабильные и переходные млекопитающих экспрессию клеточных линий с помощью различных методов, которые варьируются от вирусной трансдукции к химическому-опосредованной трансфекции, физическое передачи генов, таких как электропорация и непосредственным впрыском 3. В то время как все эти методы имеют свой собственный набор преимуществ и недостатков, лишь немногие из них подходят для структурных исследований, являющихся либо слишком дорого, и / или времени.
Здесь мы опишем очень простой, быстрый, недорогой, но очень эффективный способ для выражения белковых комплексов для структурной биологии в подвесных выросли клетках млекопитающих. Подход использует переходный котрансфекции в эмбриональной почки человека (НЕК) клеточной линии (например, Freestyle НЕК 293F клеток). Эти клетки были получены из НЕК 293 CELL линия, приспособлены расти в суспензионных культур, достигнув высоких плотностей с помощью сыворотки среде (например, FreeStyle 293 Expression среды). Затем клетки трансфицированы с помощью разветвленной версию полиэтиленимином (PEI), недорогой полимерный реагент, который, как сообщается, работает для большого диапазона клетках млекопитающих 4 путем формирования ДНК / PEI комплексы, которые входят в клетку-хозяина эндоцитозом 5. Этот метод подходит как для малых масштабах (30 мл) и крупномасштабных (до 300 мл) эксперименты и может производить высокие уровни очищенных белковых комплексов. Это особенно полезно для изучения белков, которые требуют сложных механизмов складывания, ко-факторов или особых посттрансляционных модификаций, которые не могут быть выполнены с помощью бактерий, дрожжей и клеток насекомых.
В этом протоколе приведены экспрессию и очистку белка трех центральной строительные леса от Sin3A транскрипционной репрессии комплекса. Он состоит из гистоновДезацетилазы 1 (HDAC1), подавитель дефектных глушителей 3 (SDS3) и Switch-независимый 3 (Sin3A). Очищенный комплекс используется для испытаний кристаллизации с высокой пропускной способностью.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы разработали простой и экономически эффективный способ (ПЭИ стоит значительно меньше, чем коммерчески доступных реагентов трансфекции липофильных) для выражения и очистки больших количеств рекомбинантных белков и мульти-субъединицы комплексов из клеток млекопитающих. Оптимальное трансфекции и эффективность экспрессии могут быть достигнуты, если особо чистой плазмидной ДНК (260/280 между 1,8 и 2,0) используется в комбинации с ПЭИ, как описано в разделе протокола. Клетки должны быть культивированы в serum- и антибиотиков, свободной от средств массовой информации, таким образом, стерильных строго необходимое для пассирования и трансфекции клеток для того, чтобы избежать дорогостоящих и трудоемких инфекции. Жизнеспособность клеток должно быть 90% или выше и культуры не должны быть выращены в концентрации, превышающей 2,5 х 10 6 клеток / мл непосредственно перед трансфекции, так как это уменьшит выход белка. Для успешного трансфекции культуры должны содержать только один или делящиеся клетки. Кластеры могут быть разрушены силойПодразделения вихревание 20 до 30 сек (рисунок 5). Отношение каждой плазмиды, используемой в ко-трансфекции может быть изменена пользователем в соответствии с стехиометрии комплекса изучается. Эффективность экспрессии может быть оптимизирована для белка, представляющего интерес, так что подходящее время выражение может быть установлена. Очистка должна быть выполнена сохраняя образец белка холод в любой момент времени, чтобы снизить риск нежелательного протеолитической деградации. Выбор меток и буферов очистки имеет решающее значение, так как они могут мешать структурных элементов или активных центров некоторых белков, часто приводит к снижению растворимости и / или потере ферментативной активности. Масштабные трансфекции Небольшие особенно полезны для тестирования различных конструкций для очистки больших белковых комплексов.
В настоящее время большое разнообразие альтернативных методик доступны для экспрессии рекомбинантных белков эукариот (таблица 2). Например, Baculoviрус экспрессии в клетках насекомых широко используется благодаря своей высокой эффективности трансдукции и ее отсутствие цитотоксичности по сравнению с другими видами вирусных 6. Тем не менее, процесс создания вирус является трудоемким и его нестабильность не позволяет вирусу храниться в течение длительных периодов. С другой стороны, системы экспрессии дрожжей дают возможность выращивания клеток до очень высоких плотностей в ферментере культур, в результате чего с высокими выходами белковых 7. Но они все еще не имеют полный спектр посттрансляционных модификаций, необходимых для эукариотических белков правильно сложить и взаимодействовать с их партнерами белка. HDAC3, например, выражается, но не раза в E. палочка. Тем не менее, при экспрессии в клетках 293F, мы смогли очистить активный фермент в комплексе с его корепрессор (SMRT) и молекулы инозитол тетрафосфат (IP4) 8, который не нашел в прокариотических клетках. Этот метод также позволяет нам очистить и решить кристалл улructure из HDAC1 взаимодействуя с mta1 в NuRD комплекса, который аналогичным образом активируется IP4 9. В идеале, мы всегда хотели бы выразить эукариотических белков в их естественной, физиологической среде. Системы экспрессии млекопитающих, использующие НЕК 293-EBNA1 клеток в биореакторах 10-12 были описаны и дают очень высокие уровни белка, но они могут быть сложными в использовании.
Наш метод является простым и доступным альтернативой экспрессии в бактериях, дрожжах и биореактора систем. Способ выражение быстро и не требует использования дорогостоящего оборудования, в частности, если атмосфера роллер-флакон или колбу заменяется с 5% СО 2 и стандартные Автоклавы используются. Мы использовали эти протоколы со-трансфекции плазмиды несколько комплексов и очистить до пяти белков с выходами> 1 мг / л культуры. Интересно, что система помогает выявить устойчивые хорошо себя комплексов. Например, эксPression бинарного комплекса HDAC1 и Sin3A дали ограниченные выходы белка, но добавление SDS3 привело к 5-кратное увеличение количества и, следовательно, ведет структурную биолог в выборе подходящих конструкций и стабильных комплексов для кристаллизации.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Xiaowen Ян (PROTEX клонирование службы) за подготовку экспрессирующие конструкции, используемые для этой работы и Университета Лестера Основные биотехнологии служб. Эта работа была поддержана студенчества BBSRC, Целевой программы Wellcome и старших гранты Следователь WT085408 & WT100237 и BBSRC предоставить RM31G0224.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| FreeStyle HEK 293F cells | LifeTechnologies | R790-07 | |
| FreeStyle 293 Expression Medium | LifeTechnologies | 12338-018 | |
| Anti-FLAG M2 Affinity Gel | SIGMA | A220 | |
| 250 ml Erlenmeyer Flask with Vented Cap | Corning | 431144 | |
| Roller bottles with vented caps | Corning | 01836-02 | |
| Polyethylinamine, 25 kDa, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | Make 0.5 mg/ml stocks in H2O, adjust pH to 7.0 with dilute HCl and store at -20 – 4ºC |
| Mammalian expression vector | – | – | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 0.22 µm Centrifugal Filter Units | Amicon | UFC30GV00 | |
| 15 ml Ultra centrifugal filters (10 kDa cut-off) | Amicon | UFC901008 | |
| Superdex 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17-5175-01 |
Riferimenti
- Baneyx, F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current opinion in biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).
- Aricescu, A. R., Owens, R. J. Expression of recombinant glycoproteins in mammalian cells: towards an integrative approach to structural biology. Current opinion in structural biology. 23 (3), 345-356 (2013).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and bioanalytical chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Boussif, O., Zanta, M. A., Behr, J. P. Optimized galenics improve in vitro gene transfer with cationic molecules up to 1000-fold. Gene therapy. 3 (12), 1074-1080 (1996).
- Godbey, W. T., Wu, K. K., Mikos, A. G. Poly (ethylenimine) and its role in gene delivery. Journal of Controlled Release. 60 ((2-3)), 149-160 (1999).
- Beljelarskaya, S. N. Baculovirus expression systems for production of recombinant proteins in insect and mammalian cells. Biologia Molecolare. 45 (1), 123-138 (2011).
- Cregg, J. M., Vedvick, T. S., Raschke, W. C. Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris. Nature Biotechnology. 11 (8), 905-910 (1993).
- Watson, P. J., Fairall, L., Santos, G. M., Schwabe, J. W. R. Structure of HDAC3 bound to co-repressor and inositol tetraphosphate. Nature. 481 (7381), 335-340 (2013).
- Millard, C. J., Watson, P. J., et al. Class I HDACs Share a Common Mechanism of Regulation by Inositol Phosphates. Molecular Cell. 51 (1), 57-67 (2013).
- Tom, R., Bisson, L., Durocher, Y. Transfection of HEK293-EBNA1 Cells in Suspension with Linear PEI for Production of Recombinant Proteins. CSH protocols. , pdb.prot4977 (2008).
- Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic Acids Research. 30 (2), (2002).
- Baldi, L., Muller, N., et al. Transient Gene Expression in Suspension HEK‐293 Cells: Application to Large‐Scale Protein Production. Biotechnology Progress. 21 (1), 148-153 (2005).
