JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicina

İnsan Epileptik Ameliyat sonrası Kortikal Doku Çok elektrot Dizi Kayıtlar

Published: October 26, 2014
doi:
10.3791/51870
, , , ,
1Neuroglial Interactions in Cerebral Physiopathology, Center for Interdisciplinary Research in Biology,CNRS UMR 7241, INSERM U1050, Collège de France, 2Infantile Epilepsies & Brain Plasticity, INSERM U1129, PRES,Paris Descartes University, Sorbonne Paris Cité, CEA, 3Neurosurgery Department, Necker Hospital, AP-HP,Paris Descartes University, 4Rare Epilepsies Reference Center, Necker Hospital, AP-HP,Paris Descartes University, 5Neurophysiology Department,La Pitié-Salpêtrière Hospital, AP-HP, Sorbonne and Pierre and Marie Curie University

Summary

Biz burada insan epileptik kortikal doku çoklu elektrot dizisi kayıtları nasıl gerçekleştirileceğini açıklar. Interiktal ve iktal olayların epileptik doku rezeksiyonu, dilim hazırlık ve multi-elektrot dizisi kayıtları ayrıntılı olarak gösterilmiştir.

Abstract

Epilepsi, nüfusun yaklaşık% 1'inde, normal beyin fonksiyonunu bozan nöbetlerin periyodik oluşumu ile karakterize edilen nörolojik bozukluklar, bir grup ihtiva eder. Mevcut antiepileptik ilaçlar, nöronal fonksiyonları hedefleme ile tedaviye rağmen, epilepsi hastalarının üçte biri, farmakolojik vardır. Bu durumda, nöbetler üreten beyin bölgesinin cerrahi rezeksiyon tek alternatif tedavi kalır. Insan epileptik dokuları inceleyerek son 10 yılda yeni Epileptojenik mekanizmaları anlamak için katkıda bulunmuştur. Nitekim, bu dokular spontan interiktal epileptik deşarjların yanı sıra klasik elektrofizyoloji teknikleri ile kaydedilebilir farmakolojik kaynaklı iktal olayları oluşturabilir. Dikkate değer, mekansal düzenlenmiş Mikroelektronlar bir dizi gömme microfabricated cihazlar multi-elektrot dizileri (MEA'lar), aynı anda uyarmak için benzersiz bir fırsat ve kayıt alan POTE sağlamakntials yanı sıra, doku farklı alanlarından birden fazla nöron aksiyon potansiyeli. Böylece ÇÇA'lar kayıtlar kendiliğinden interiktal ve uzay-zamansal desenleri ve uyarılmış nöbet benzeri olaylar ve nöbet başlangıcı ve yayılmasının altında yatan mekanizmaları incelemek için mükemmel bir yaklaşım sunmak. Burada cerrahi rezeksiyon dokusundaki insan kortikal dilimleri hazırlamak ve ÇÇA'lar interiktal ve iktal-benzeri olaylar ile ex vivo kayıt nasıl açıklar.

Introduction

Epilepsi milisaniye onlarca kalıcı senkron nöronal deşarjların varlığı ile karakterize klinik bulgularla birlikte elektroensefalografi (EEG) kayıtları saniye onlarca birkaç saniye süren aralıklı desenli deşarjları ise epileptik nöbetler, bir interiktal devlet kesintiye kronik bir bozukluktur ve interiktal olaylar 1 çağırdı. Yaklaşık% 1 dünya nüfusunu etkiler ve nöbetler hastaların çoğunda kontrol rağmen, epilepsisi olan kişilerin yaklaşık üçte biri antiepileptik ilaçlara 2 yeterli yanıt görünmüyor. Bu durumda, kimin mekanizmalar hala açıkça tanımlanmalıdır, farmakolojik epilepsi ve nöbet başlangıçlı bölgesi olarak tanımlanan beynin belirli bir kısmının cerrahi rezeksiyon hastalara olumlu bir sonuç veren tek alternatif tedavi kalır denir. Böylece, ameliyat rezeke numuneler oppor verimolgunluk ex vivo olarak uygulanabilir insan merkezi sinir dokusu üzerindeki interiktal deşarjları ve nöbetlerin ve yayılma mekanizmaları, aynı zamanda, farmakolojik çalışma için.

Aralıklı olarak dağılmış mikroelektrot bir düzenleme oluşturduğu çoklu elektrot dizileri (MEA'lar), spontan ve uyarılmış aktivite uzay-zaman desen çalışması için böylece, mükemmel bir yaklaşım sağlamaktadır, bir dizi doku sitelerden elektrofizyolojik aktivite eş zamanlı olarak uyarılması ve kaydedilmesine . Bu teknik, ilk olarak nöronal hücre kültür aktivitesi 3 gelişimsel değişiklikleri izlemek için uygulanır ve daha sonra akut ve Organotipik bir beyin ve omurilik dilimleri 4 için uyarlanmış, 6 – halen değerli elektrofizyolojik bir araç olarak kabul edilir.

Geçerli protokol cerrahi rezeksiyon dokusundaki insan kortikal dilimleri hazırlamak ve ÇÇA'ları güvenilir eski vi ile kayıt açıklarvo interiktal ve bu kesitlerden nöbet benzeri olaylar. Bu teknik epileptik faaliyetleri başlatma, yayılma ve hem hücresel hem de network seviyelerinde antiepileptik ilaçların etkilerinin altında yatan temel mekanizmaları ele için bir yol sağlar. İnsan dilimleri elde hazırlanması, korunması ve kaydetmek için kullanılan tüm prosedürler, burada ayrıntılı olarak tarif edilmektedir.

Protocol

NOT: Burada açıklanan protokol Fransız "Comité consultatif National d'Ethique" yönergeleri takip ve INSERM'deki tarafından bir toplama faaliyeti olarak ilan edilir. İnsan Epileptik Doku 1. Rezeksiyonu Hastalar Dirençli epilepsi hastası hastaların beyin dokusunu edinin. Ameliyattan önce yazılı bilgilendirilmiş olurunu. Tüm epileptik hastalar nörolojik muayene, nöropsikolojik değerlendirme, yüzey EEG ve nörogörüntülemenin dahil olmak üzere geniş bir cerrahi öncesi ortamda tetkik işletilen; çıkarılan dokunun cerrahi sonrası histolojik inceleme ile takip (MRG ve bazen 18 FDG-PET taraması Şekil 1A), (Şekil 1B) . NOT: farklı keşifler benzer nöbet başlangıç ​​bölgesi ve zaman onun kaldırma yararı cerrahi riskleri aştığında lokalize zaman endikedir. Cerrahlık Maintain antiepileptik ilaçlar ameliyat öncesi. Genel anestezi altında ameliyat: indüksiyonu İntravenöz sufentanil sahip ile devam inhale sevofluran (% 6 teslim oranı ve O 2% 100 inhale fraksiyonu), içi venöz sufentanil (0.3 ug / kg) ve antracurium (0.5 mg / kg) ile (0.5 mg / kg / saat) ve sevofluran inhalasyon (1 MAC). Lezyonlu korteks (Şekil 1C) kesin bir lokalizasyon izin vermek için bir nöronavigasyon sistemi kullanın. Cilt kesisi sonra, yüksek bir dökülme matkap ile bir Kraniotomi ile takip kemikte bir çapak delik gerçekleştirin. Yavaşça kemik flep yükseltmek ve makas (Şekil 1D) ile dura açın. Işletme mikroskop altında anormal korteksin kimlik ve mikrocerrahi aletleri ve ultrasonik aspiratör kolaylaştırmak için intra-operatif ultra ses kullanın. Katılaştırır ve sulkal limitlerine uygun pio-araknoidal uçağı kesti. R subpial diseksiyon kullanıneLease lezyonlu alanı çevresinde pia gelen korteksi yer alır. Damar mümkün olduğunca tutumlu, rezeksiyon "en blok" tek parça gerçekleştirmek için anormal korteksin altında beyaz maddeyi kesti. Korteksin travmatik manipülasyon kaçının. Sulkus alt ve geçiş korteks de dahil olmak üzere, pial yüzeyine bir istikamet takip boyunca çıkarılan dokunun dışında bir 1 cm kalınlığında dilim kesti. 2. Yapay Beyin Omurilik Sıvısı Dilim Hazırlama, Kuluçka ve Kayıt için (ACSF) Dilim hazırlanması için ACSF (MM olarak), sakroz-esaslı ACSF 7,8 1 L 'nin Hazırlanması: 250 sükroz, 3 KCİ, 25 NaHCO3, 10 D-glikoz, 1 CaCl2, 10 MgCI2; iyonu giderilmiş su içinde, bu tuzlar eritildi ve en az 10 dakika karbojen ile çözüm oksijenize. 50-60 dakika boyunca (ya da 15-20 dakika -150 ° C) -80 ° C 'de sükroz ACSF ~ 700 ml koyun. Geri kalanı tutmakbuz oksijenasyon altında çözelti. Not: dilim hazırlanması için ACSF 4 ° C'de saklanabilir; Bu durumda, bu soğutulmadan önce, deney günü CaCl2 ve MgCI2 ekleyin. Dilim inkübasyon ve kayıt için ACSF (MM olarak), kayıt ACSF 7,8 arasında en az 3 L 'nin Hazırlanması: 124 NaCl, NaHCO3 3 KCİ, 26, 10 D-glikoz, 1.6 CaCl2, 1.3 MgCl2; iyonu giderilmiş su içinde, bu tuzlar eritildi ve karbojen ile çözüm oksijenize. MgCl2 eklemeden önce, 0 Mg 2+ ACSF kayıtları gerçekleştirmek için bazı ACSF tutmak. Not: İnkübasyon / kayıt ACSF 4 ° C'de saklanabilir; Bu durumda, CaCl2 ve MgCI2 deney günü ekleyin. Dilim İNKÜBASYONI ve Kayıt için 3. Ekipman Dilim inkübasyon için arabirim odası Dilimleri ex vivo yaşayan korumak için bir beyin dilim odasını kullanın </ Arayüz modunda em>. Not: Bölme dilimler düzlükteki mercek dokularından bir tabaka üzerine dayanmak ısıtma ve sensör elemanları ve seramik bubbler içerir ve damıtılmış su ile doldurulan bir alt bölüm, ve bir üst bölüm, oluşmaktadır odasının merkezi (Şekil 2A – B) gerçekleştirildi. Preoxygenated ACSF odasına girdiği aracılığıyla iki ayrı ince PTFE tüpleri kullanılmalıdır. Not: tüpler ısıtılmış su içinde sarmal ve bölmenin üst kısmı ulaşmak; daha sonra çözelti çıkış kuyu içine çözeltinin taşır mercek dokularından olan kılcal hareket yoluyla çıkar. Preoxygenated orta dilim sürekli perfüzyon izin vermek için, bir peristaltik pompa arayüzü odasının PTFE borularını. Seramik fokurdatıcısı aracılığıyla karbojen (% 95 O 2 ve% 5 CO 2) ile oksijenlendirilmesi tarafından yüksek oksijen gerilimi sürdürmek. NOT: Bu ısıtılır ve nemlendirilir gaz karışımı ulaşırUygun delikler vasıtasıyla, bölmenin üst kısmında dilimleri. Odası ısıtma elemanı için bir konektörü ve bir ucunda harici bir sıcaklık sensörü içeren, özel bir çift uçlu kablo, bir sıcaklık kontrol cihazına bölmeyi bağlanarak bölmenin üst kısmında sıcaklığı muhafaza edin. İnkübasyon (Şekil 2C) boyunca sıcaklığı kontrol etmek dilimleri yakın sensörü yerleştirin. Çok elektrot dizisi kayıtları 200 um merkez-merkez aralığında olan 12 x 12 matris içerisinde düzenienen silikon nitrid ve iç referans elektrodu ile izolasyonlu 120 titanyum nitrür elektrotlar (30 um çapında), düzlemsel çok-elektrot tertiplerinin kullanın. Not: farklı bir diğer elektrot çapında ve aralıkta bulunan diğer şekiller de mümkündür. Özellikle, MEA çip insan dokularının geniş dilim örnek için genişletilebilir. (Öncesi ve fi MEA2100-120 sistemini kullanarak 10 kHz elektrik sinyallerini Edinmeözel bir yazılım (MC_Rack) üzerinden entegre veri toplama ve analog-dijital dönüştürücü, 16 bit veri çözünürlüğü, giriş gerilimi aralığı ve bant genişliği yazılımı ile ayarlanabilir) ile FiltreLi amplifikatör. NOT: MEA2100 headstage sürekli kayıt oturum boyunca dilim serpmek, manyetik tutucu ile ısıtılabilir perfüzyon elemanının sabitlenmesi için bir metal plaka donatılmış. Dilim ve elektrotlar arasında iyi bir elektrik bağlantısını sağlayan küçük bir ev yapımı platin çapa ile MEA doku basılı tutun. 4. Arayüz Odası hazırlanması Dissekan ve Dilimle Araçları Arayüz odası Damıtılmış su ile arabirim odasının alt bölümüne doldurun. Su seviyesi tamamen ısıtma elemanını doya ve bölmenin alt ve üst bölüm arasındaki birleşme, aşağıda 2-4 mm olduğundan emin olun. Günlük ısıtma açmadan önce bu seviyesini kontrol edin,amacıyla, ısıtma elemanının zarar görmesini önlemek için. Gaz basıncı ince ayarlamalar için ikincil bir akış regülatörü ile donatılmış bir karbojen kaynağına odasına bağlayın. Dilim odasının düz alana sığdırmak için mercek dokusunun bir yaprak kesin ve dilimleri ulaşmadan önce giriş hattı herhangi bir kabarcık çıkmasını sağlamak için, giriş çözüm tüpe yakın konumlandırmak. Mercek dokularından parçasının sürece iplikçikli pamuk iplik iki adet kesin ve bölmenin düz alan ana tarafı boyunca pozisyon. Not: Bu hafif bölme içinde perfüzyon çözeltisi düzeyini yükseltmek için yardımcı olur. 1 ml / dakikada peristaltik pompa akış hızını ve pompayı çalıştırın. Bölmenin alt kısmında suyun oksijen başlatın. 37 ° C'de sıcaklık kontrolörünün sıcaklığını ayarlamak ve açın. Parafilm bir parça ile ara bölmenin üst kısmı kapatılır ve sıcaklığından en az 30 dakika beklemekobilyaları artırmak ve stabilize etmek. Diseksiyon ve dilimleme araçları İki ince forseps, bir spatula, bir küçük kaşık ve bıçak oluşan bir diseksiyon seti hazırlamak; iki cam petri, iki fırça yanı sıra siyanoakrilat tutkal. Vibratome parametrelerini ayarlayın: kalınlığında, 400 mm; Frekans, 70-90 Hz; genlik, 0,9-1 mm, hız: 0.1 mm / sn. 5. İnsan Kortikal Dilim Hazırlık -80 ° C derin dondurucuda gelen sakaroz tabanlı ACSF kaldırmak ve çalkalanma bir tür elde etmek için karıştırın. Hastanenin ameliyathane gidiyor doku almak için ise, bir cam şişe içinde ~ 250 ml koymak ve buz dolu bir Dewar şişesi içinde tutmak, karbojen ile oksijenize. Bu arada, -20 ° C 'de geri kalanı tutmak. NOT: Ameliyat sırasında, beyin cerrahı kortikal doku küçük bir blok inceliyor. Hemen laboratuara transferi için buz gibi soğuk sükroz ACSF numuneyi. 30 dakika maksimum laboratuara hastaneden transferi için gerekli zamanı tutmak. Laboratuarda, bir rüşvet var karıştırarak, -20 ° C derin dondurucuda dışarı sakaroz tabanlı oksijenli ACSF almak bir petri ve Vibratome tampon tepsiyi doldurun ve karbojen hem oksijenli başlar. Dikkatli bir kaşıkla şişeden insan dokusunda bir parça almak ve petri (Şekil 2D) koyun. Forseps kullanarak, dikkatli dilimleme sırasında direncini önlemek için, kan pıhtıları, damarları ve meninks çıkarın. Kortikal yüzeyine zarar vermemeye dikkat, doku bloğu tarafında başlayan, pia-konuda oluşan meninks çıkarın. Bir bıçak ile, vibratome numune plakası üzerinde yapıştırılmış olacak düz bir yüzey elde etmek için doku, bir tarafı kesin. NOT: pia-konuda oluşan beyin zarları, kortikal yüzeyine zarar vermemeye dikkat, doku bloğu tarafında başlayan çıkarılmış olduğu. Eğer ti blokssue MEA odasına daha büyük, örnek plaka (Şekil 2E) üzerine yapıştırma önce uygun boyutlarda bir parça kesti. Enine kortikal dilimler elde etmek için doku yapıştırıcısı tampon tepsisine koyun ve düşük hızda (0.1 mm / sn) (Şekil 2F), 400 mikron kalınlığında dilimler kesilmiştir. Dilim boyutları ile objektif doku parçalarını kesmek; Bir spatula ve bir fırça ile, bu tür mercek dokularda dilimleri transferi ve kayıt (Şekil 2G – I) 'başlamadan önce en az 1 saat süre ile 37 ° C' de arayüz odasında inkübe. Sürekli kullanılana kadar aynı koşullarda dilimleri saklayın. NOT: lens kağıda dilimleri yerleştirmek dilimler alt tarafının perfüzyon ve kaydetmeden önce arayüzü odasından dilim çıkarılmasını hem kolaylaştırmak için önemli bir adımdır. Objektif doku üzerinde dilimleri transfer ederken, ile kortikal tabaka alana dokunmak kaçınarak, çok dikkatli bir şekilde yönetmekfırça. Bir seferde dilimleri birini hazırlayın ve hemen uygun oksijen kaynağı ve sıcaklığı sağlamak amacıyla, arayüz odasına her biri aktarmak; mümkün olduğunca çabuk çıkarılan dokunun blok dilim. Kayıtlar için MEA Kur 6. hazırlanması Bir bilgisayara bir peristaltik pompa ve MEA sisteme perfüzyon sistemi takın. Kayıt ACSF oksijenize. Amplifikatör içinde boş MEA çipi yerleştirin. Isıtma kanül elemanı MEA bölmesi içinde 37 ° C'ye ulaştığı ve 5-6 mL / dakika ile perfüzyon başlatmak için ısı kontrol ayarlayın. NOT: Bu sıcaklığını ayarlamak için genellikle gerekli olan 3-4 ° C oda sıcaklığı ve akış hızına bağlı olarak, arzu edilen bir daha yüksek olur. Elektrot alanının dokunmadan, bu merkezine en yakın yerleştirilmesi, ince bir termometre ile MEA, fırın sıcaklığının kontrol edin. Softwar Kayda başlayıne ve tüm MEA elektrotlar iyi bağlı olup olmadığını kontrol edin ve perfüzyon nedeniyle gürültü olduğunu. Kamera tablonun işleyişini kontrol etmek MEA_Monitor başlayın. Kayıt için MEA Chip Arayüz Odası From Dilim 7. Transferi Bazı, cam bir Petri tabağına ACSF kayıt ısıtıldı dökün; bir forseps ile, objektif doku aracılığıyla kapma, arabirim odasından bir dilim almak ve petri koydu. Dikkatle doku dilim ayırın. Arabirim odasındaki çözeltinin seviyesi dikkatlice kuluçkalama süresi esnasında ayarlanır, dilim yalnızca çözelti içinde daldırarak mercek dokularından ayırır; aksi halde, ayrılmasını kolaylaştırmak için küçük bir fırça kullanılır. Bazı ACSF bir MEA çip doldurun ve bir spatula ile, içine dilim aktarın. Plastik bir Pasteur pipeti ile hafifçe dilim elektrot alanı yapışması ve bir platinyum Anch ile yerinde tutmak için çözeltinin ayrılmasıveya. Kayıt ACSF 1 ml ilave edilir, amplifikatöre MEA çip yerleştirin ve 5-6 ml / dak perfüzyon başlar (Şekil 2J – l). , MEA_Monitor kullanarak MEA kayıt alanında dilim pozisyonunu kontrol edin, gerekirse kortikal katmanları kayıt ve bir resim çekmek için ayarlayın. Kaydı başlatın.

Representative Results

(Daha önce tarif edildiği gibi) normal kayıt ACSF ile doku 7,8 perfüze ise insan kortikal dilim aktivitesinin kaydı başlar. Doku iyi hastane ve dilim hazırlanması doku nakil sırasında daha sonra ameliyat süresince korunur ve, bu durumda, içinde, tek bir MEA elektrotların küçük kümelerden tespit küçük İnteriktal benzeri olayların şeklinde, spontan gözlemleyebiliriz. Interiktal gibi boşalmalar milisaniye onlarca süren uzun bir ters dalga izledi mikrovoltluk onlarca ulaşan, ilk keskin negatif sapmayı içeren bir alan potansiyeli, genellikle bifazik oluşuyordu. Hızlı çoklu ünite faaliyetleri genellikle esas olarak ilk kısmında potansiyel alanı içinde yer almaktadır. İnteriktal benzeri etkinliği temsili bir örneği, bir MEA elektrot tarafından kaydedilen iz gösterilir Şekil 3Aii, görüntülenmiştir. Içinde epileptik nöbetler kaydetmek içinİnsan kortikal dilimleri nitro, bu bir "epileptik" ACSF ile perfüze edilmesi için gerekli olduğu Mg + 2, mevcut değildir ve K + 'doku uyarılabilirliğini 1 (K + 3-6 mM artışı artırmak için, 6 mm' ye yükseltilir Tek başına nöbet meydana gelmesi için yeterli değildir; veriler gösterilmemiştir). 0 Mg + 2, 6 mM K + ACSF ile perfüzyon başladıktan sonra, 5 hastadan, kortikal dilimlerin aktivitesi giderek artar ve ilk nöbet, 20 dakika (15.4 ± 1.7 dakika için 15 içinde görünen, n = 10; Şekil 3, Ai ). Test edilen hastaların% 75 ve her kaydedilen dilimleri% 66.7 ', Şekil 3'te görüldüğü gibi, İktal benzeri aktiviteye uyarılmış. Epileptik faaliyetleri MEA çipin komşu elektrotlar kaydedilir ve saha potansiyel olayların başlangıcı dinamikleri karşılaştırılması doğuşu ve yayılması kendi sitesini inceleyerek sağlar. Uğultu bir dilim kaydedilmiş bir temsilci nöbetMEA sistemi ile bir serebral korteks (Şekil 3 Aiii yüksek zamansal çözünürlükte, tek bir MEA elektrot ile kaydedilen bir nöbet temsil eden bir iz) Şekil 3B'de gösterilmiştir. Nöbet bu nedenle geniş bir kortikal alanı yaymak mümkün olduğunu gösteren, MEA çip hemen hemen tüm elektrodlardan kaydedilir unutmayın. Ayrıca, her elektrot kaydedilen tek izlerini bakarak, o doku boyunca nöbet ilerici yayılmasını gözlemlemek mümkün: aslında, elektrot dizisinin sağ yarısını kaplayan kortikal alanda ilk başlar ve yavaş yavaş yayılır sol yarısını kapsayan alanı (.. yani, elektrot L6 ve B6 izleri karşılaştırın, Şekil 3B). Şekil 1: Bir kortikal displazi bir. Bir sol frontal lob sulkusta gömülü d onun cerrahi olarak çıkarılması bir Taylor tipi fokal kortikal displazi (beyaz ok) preoperatif MR (A) görüntülendi ve daha sonra histolojik inceleme (B) MAP kinaz etiketlemesi ile teyit edilir; Ölçek çubuğu: 200 mikron) alt beyaz madde bir eksik göç ile nöronlar üzerinde bir kortikal dyslamination, anormal nöronlar ve bir parça gösteren. Ameliyat sırasında, displazi nöronavigasyon sistemi (C) ile MR verilerine göre lokalize olur. Cerrahi (D) sırasında displazi içeren girus görselleştirme. Şekil 2:. Insan kortikal dilim hazırlanması için donatım ve prosedür bir arayüz kamara insan kortikal dilimleri korumak için kullanılan ex vivo (A); Bir sıcaklık sensörü (sol C) bir çiftli aracılığıyla bir ısı kontrol cihazı (kadar Cı, sağa) bağlı bölme (B), bir üst kısmında düz bir alan mercek dokularından bir tabaka üzerine dilimler kalanı uçlu kablo (C, sağa, aşağı), dilim inkübasyon süresi boyunca 37 ° C korumak için yerleştirilir. Bir kez buz gibi soğuk sükroz bazlı ACSF (D) ile doldurulmuş bir petri kabına doku rezeke blok yerleştirmek ve dilimleme kolaylaştırmak için, kan pıhtılaşması, damarları ve meninks kaldırmak elde edilmiştir. Doku bloğu MEA haznelerine göre daha büyük olması durumunda, bir kanadın (E) uygun boyutlarda bir parça izole etmek ve vibratome numune plakasına (F) tutkal. 400 um kalınlığında dilimler kesme ve bir spatula (G) yardımı ile mercek dokularından (H) parçaları üzerine aktarmak ve ara-yüz bölmesine (I) 'de inkübe. Kayıt, remo önceACSF ile dolu bir petri dilim daldırarak mercek doku ettik ve bir spatula (J) ile bir ACSF dolu MEA çipi aktarmak. Dilim MEA (K) üzerine yapışır ve bir platin çapa kullanarak pozisyonda tutmak izin çözüm çıkarın. Amplifikatör (L) olarak MEA yerleştirin, perfüzyon ve kaydetmeye başlayın. Şekil 3: insan kortikal dilimleri epileptik nöbetler MEA kayıtları (A) MEA elektrot tarafından kaydedilen insan kortikal dilim aktivitesinin bir temsilcisi iz panelinde i gösterilir.. Normal ACSF varlığında, (panelde ii uzaklaştırdınız küçük gri dikdörtgen) interiktal gibi spontan aktivitesini gözlemlemek mümkündür; daha sonra, 0, Mg + 2, 6 mM K + ACSF ile perfüzyon başlamıştır, birinci seizuyeniden bir ~ 15 dakika bekledikten sonra görünür ve 2-3 dakika aralığında diğer olaylar tarafından takip edilmektedir. Panel iii Zumlu ölçeğine panelinde i büyük gri dikdörtgenin içinde nöbet gösterir. Mavi çizgi ve oklarla gösterildiği gibi mavi iz, bir faaliyet zoom göstermektedir. Panel iv) (mavi iz) uzaklaştırdınız zaman çoklu-ünite aktivitesini ortaya 250 Hz süzülmüş panelinde iii gösterilen verileri) yüksek geçiren gösterir. (B) 0 varlığında Mg 2 + 6 mM K bir nöbet Temsilcisi kayıt + tüm MEA elektrotlar ACSF. Her kare 12 x 12 MEA dizinin bir elektrot temsil eder ve 80 sn zaman penceresi gösterir; kesikli çizgi nispeten MEA dizisine kortikal yüzeyinin konumunu gösterir.

Discussion

İLACA epilepsi in vitro insan dokusunda keşfedilmeyi nadir görülen bir durumdur. Bu sadece kısmen hayvan modellerinde çoğaltılamaz spesifik kusurları görüntüler epileptik insan korteks, eğitim verir. Burada anlatılan yöntemi hazırlanması ve insan postoperatif dokuları kayıt sağlayan ex vivo korunmuş hücresel canlılığı ve ağları kendiliğinden epileptik faaliyetleri üretmek ve böylece ile. In vivo kaydedilenler dışındaki benzer faaliyetleri İstinat patolojik faaliyetlerin oluşum mekanizmaları incelemek için çok önemlidir. Bundan başka, bu gibi yöntemler, insan dokusu keşfetmek ve hastalığın olmayan mükemmel bir hayvan modelleri önlemek izin verir. Ancak, insan dokusu okuyan beyin cerrahları ve deneysel laboratuar arasındaki senkronizasyonu gerektirir. Doku taşıma travmatik olmamak için özel dikkat gerektirir. Buna ek olarak, numune miktarı ve doku hem de sınırlıdır. Son olarak, uygun kontrol dokularında erişim mai olduğunun endişe. Bu hazırlık, operasyon sonrası dokular kendiliğinden, normal ACSF 7,8 interiktal benzeri deşarjlar üretirler. Nöbetlere interiktal devletten nöbet başlatılması ve geçiş mekanizmaları araştırılmaktadır böylece İktal-benzeri olaylar da modifiye, proconvulsive ACSF elde edebilir.

İnsan dokusu girişim koşullarında kadar 10 saat boyunca canlı tutulabilir. Çok birim faaliyet veya alan potansiyelleri kendiliğinden gözlendi zaman ve bu tür faaliyetlerin dışı potasyum artar ve / veya magnezyum azaltılması yoluyla heyecanlanma artırarak uyarılmış zaman dilimleri geçerli kabul edildi. Aktivitesinde değişkenlik olasılıkla patolojileri ve kortikal alanlarda farklılıkları yansıtan, meydana gelmesine rağmen, biz sadece spontan interiktal gösteren sağlıklı dilimleri içinde bir doku Epileptojenik özelliklerini araştırdı ve iktal deşarjların uyarılmış. Doku canlılığını ve aktivitesini korumak için, bir ara-yüz odası T saklamak için kullanılano MEA sistemi ile kayıt önce kurtarma için 36-37 ° C'de dilimler. Nitekim, çeşitli gruplar açıkça bu tür kendiliğinden keskin dalga-dalgaların veya kolinerjik kaynaklı salınımların 9,10 standart olarak beher depolama ve ağ etkinliğinin korunması için sıcaklık önemine göre arayüzü tabanlı depolama sisteminin avantajlarını göstermiştir. Dilimleri Arayüz depolama önce insan hipokampus ve subiküler dilimleri 1,11 epileptik aktiviteyi kaydetmek için kullanılır olmuştur. Mevcut MEA tekniği ile, girişim koşullarında dilimleme iyileşme süresinden sonra, ağ etkinliği MEA sistemi ile birlikte, 37 ° C'de yüksek bir akış hızı (5-6 ml / dak) varlığında, daldırılmış koşullar kaydedilir. Birlikte, daha yüksek akış hızı ile küçük hacimli bir gözü (<1.5 mi) sınırlandırması MEA yongası, indirgenmiş çapı (1.8 cm), spontan ve PHA için kritik bir faktör olduğu gösterilmiştir dilim, oksijen kaynağı artırırağ faaliyetleri 9,10 rmacologically kaynaklı. Dahası, dolaşımdaki ACSF miktarda bulunması farmakolojik test kolaylaştırır.

Dilimleme prosedürünün, dokular 12 bir travmatizm olup. Nöronal mimarisi ve klorür homeostazisinde Hem doku yüzeyi (50 mikron) de tedirgin görünmektedir. Çoğunlukla yüzeysel derin penetrasyon olmadan doku, travmatize alanlarda oluşabilecek örnek MEA cips, tarafından kaydedilen faaliyetlerin kökeni. Ancak, bizim veri bizim hazırlık kayıtlı nöbetler olması muhtemel olduğunu öne sürerek, hücre dışı alan potansiyelleri yerel olarak en MEA elektrotlar ve kayıt sitesinden 13 bir 100 ile 200 mikron mesafe üzerinden entegre önceki iş gösterisinde kaydedilir detected olduğunu göstermektedir travma alanlar ile üretilir. Ayrıca, derin penetrasyon sağlayan tungsten elektrotlar ile yapılan çalışmalarda, insan dokularında kaydedilen epileptik faaliyetleri benzerEpileptik hastalarda 1,7,8 gözlenen olanlar.

Ex vivo doku kayıt diğer bir limiti böylece dinamik neuromodulations kısıtlayan, farklı beyin bölgeleri arasındaki bağlantıların bozulmasıdır. Böyle dokusunda hiçbir iktal-benzeri olay kendiliğinden kaydedildi, ancak iyonik manipülasyon ya da farmakolojik stimülasyon geliştirerek uyarılabilirliğindeki tarafından tetiklenen gerektirir neden açıklayabilir. Bu duruma göre, bu protokolde, nöbet benzeri olaylar doku uyarılabilirliğini artırmak için, hücre dışı bir K + 3'den 6 mM arasında bir değişim ve -serbest ACSF 2+ 1,3 mM ila Mg dış Mg + 2 bir azalma birleştirerek uyarılmaktadır ve Mg 2 + bağımlı NMDA reseptör bloğu kaldırmak. Aslında, bir önceki epileptiform aktivite -serbest ACSF vivo 14 kaydedilen elektrografik nöbetlerin benzer Mg + 2 kullanılarak insan neokortikal ve hipokampal dilimlerde neden olduğu gösterilmiştir. Yanı sıra,Bu temporal lob dilimleri elde edilen epileptiform deşarjların böylece in vitro, farmakolojik nöbet benzeri olayları araştırmak için bir model sağlayan, Mg 2+ -ücretsiz ACSF 15,16 uzun süre maruz kaldıktan sonra klinik olarak kullanılan antikonvülsanlara dirençli hale gösterilmiştir.

ÇÇA'lar nöronal aksiyon potansiyellerinin ex vivo oluşan alan potansiyelleri ve multi-unit faaliyetler hem kayıt sağlar. Böylece, ÇÇA'lar in vivo nöronal topluluklarından senkron faaliyetlerinden oluşturulan alan potansiyellerini keşfetmek, ama tek bir nöron erişim 17 davranışları vermeyin EEG ile karşılaştırıldığında güçlü bir elektrofizyolojik araçtır. Daha yeni Mikroelektronlar nöronal aksiyon potansiyelleri oluşan in vivo çoklu birim faaliyetleri kaydedebilirsiniz rağmen bunların kullanımı çoğunlukla intrakranial kayıtları sırasında araştırma yapmak amacıyla sınırlıdır, bu yüzden onlar, invaziv. Özellikle, ÇÇA'lar kayıtları seçtiğiniz bir tekniği temsilEpileptik olayların uzay-zamansal desen çalışması için, nöbet başlangıcı ve yayılmasının ve klasik ve yeni antiepileptik ilaçların etkisini kontrol mekanizmaları. Dikkate değer, hücre tiplerini ve epileptik deşarjların sinyal temelini çözülmeye sıralama teknikleri başak ve farmakolojik test MEA teknikleri ile kombine edilmelidir üzere. ÇÇA'lar bireysel sivri erişim verebilir rağmen, sinaptik ve biyofizik özellikleri hakkında bilgi vermemektedir. Gelecekte, diğer teknikler iyi örnek hücresel davranış, ağ etkinlikler ve sinaptik işaret verme amacıyla MEA kayıtları birleştirilmelidir. Örneğin, flüoresan görüntüleme ÇÇA'lar kayıtları ile kombine edilebilir, nöronlar ya da glial hücreleri davranışı, hem de iyon dinamikleri çözülmeye. Epileptik faaliyetlerinin yeri belirli düzenlemeler ile korele edilebilir, böylece daha fazla ve post hoc histolojik analizi hücre tipleri, protein veya reseptörlere özel değişiklikler ortaya çıkarabilirsinir yapısı. ÇÇA'lar sistemi de nüfus faaliyetleri ile tek hücreler veya iletkenliklerin ilişkilendirmek için bir yama-kelepçe set-up gömülü olabilir. Gelecekte, Optogenetic araçları da kullanılabilir Organotipik dilim için gerçekleştirilen gibi özel hücre tiplerinin transfeksiyon ya da enjeksiyon yapılabilir, böylece, insan dilimler, uzun vadede kültive edilebilir sağlanabilir.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma ANR (Program Blanc Nörobilim), FRC (la Recherche sur le Cerveau dökmek Federasyonu) hibe tarafından desteklenmiştir, Paris (Program Doğuşu) Şehir, INSERM ve Neuropôle DE NR La Pitié Salpêtrière Hastanesi (Translational araştırma sözleşme), Université Pierre et Marie Curie UPMC (Program Yakınsama) ve Institut du Cerveau ve e la Moelle epiniere (Paris) GH için ED Recherche Francilien (nerf),

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Brain Slice Chamber-2: Interface AutoMate Scientific, Inc. S-BSC2 It requires separate temperature controller
2-channel Temperature Controller Multichannel Systems, Germany TC02 It allows to plug in and use 2 interface chambers. 
Special cable for connection of TC01 to S-BSC2 with external reference PT100 Multichannel Systems, Germany CA3 The reference PT100 is placed near the slices 
6pin plug-connector with PT100 Multichannel Systems, Germany TS-PT100 External reference for CA3 cable
MEA workstation for recording data from 120-electrode MEAs Multichannel Systems, Germany MEA2100-120 It includes MEA2100-120 headstage and MEA2100 interface board. www.multichannelsystems.com
Microelectrode array for MEA2100-120 Multichannel Systems, Germany 120MEA200/30 Electrode spacing: 200 µm; electrode diameter: 30 µm; glass ring: 6 mm high. Different configurations (spacing, diameter, ring) possible. 
Video Microscope Table Multichannel Systems, Germany MEA-VMT-1 Table with a video microscope underneath to image the electrode field of the MEAs in an amplifier placed on top of the table and transfer the image to a computer.
Perfusion cannula Multichannel Systems, Germany PH01 Heatable perfusion cannula with temperature sensor; temperature can be programmed with TC02 controller
MC_Rack Multichannel Systems, Germany Software for data acquisition and recordings
Magnetic Perfusion Holder Multichannel Systems, Germany MPH Magnetic perfusion holder for PH01 element to fix the perfusion cannula and connect the perfusion system to the amplifier's ground
Neuroexplorer Nex Technologies Software for data analysis; info@neuroexplorer.com
Peristaltic pump (drive unit) Gilson F155001 0,01 to 48 rp
Peristaltic pump (pump head) Gilson F117800 R2 two channel
Ultrasonic aspirator Integra Life sciences, USA Cusa Excel + It allows blunt subpial dissection of the cortex
Neuronavigation Isis Solutions, France Surgiscope It allows real time identification of the brain structure on the preoperative MRI
Vibratome HM 650 V Microm Block slicing into 400 μm thick slices
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Huberfeld, G., et al. Glutamatergic pre-ictal discharges emerge at the transition to seizure in human epilepsy. Nature Neuroscience. 14 (5), 627-634 (2011).
  2. Kwan, P., Brodie, M. J. Early identification of refractory epilepsy. New England Journal of Medicine. 342 (5), 314-319 (2000).
  3. Van Pelt, J., Corner, M. A., Wolters, P. S., Rutten, W. L. C., Ramakers, G. J. A. Longterm stability and developmental changes in spontaneous network burst firing patterns in dissociated rat cerebral cortex cell cultures on multielectrode arrays. Neuroscience Letters. 361 (1-3), 86-89 (2004).
  4. Sun, J. -. J., Luhmann, H. J. Spatio-temporal dynamics of oscillatory network activity in the neonatal mouse cerebral cortex: Network oscillations in neonatal cerebral cortex. European Journal of Neuroscience. 26 (7), 1995-2004 (2007).
  5. Dossi, E., et al. Functional Regeneration of the ex-vivo Reconstructed Mesocorticolimbic Dopaminergic System. Cerebral cortex. 23 (12), 2905-2922 (1991).
  6. Darbon, P., Scicluna, L., Tscherter, A., Streit, J. Mechanisms controlling bursting activity induced by disinhibition in spinal cord networks. The European journal of neuroscience. 15 (4), 671-683 (2002).
  7. Cohen, I., et al. On the Origin of Interictal Activity in Human Temporal Lobe Epilepsy in Vitro. Science. 298 (5597), 1418-1421 (1126).
  8. Huberfeld, G., et al. Perturbed chloride homeostasis and GABAergic signaling in human temporal lobe epilepsy. The Journal of neuroscience. 27 (37), 9866-9873 (2007).
  9. Maier, N., Morris, G., Johenning, F. W., Schmitz, D. An Approach for Reliably Investigating Hippocampal Sharp Wave-Ripples In Vitro. PLoS ONE. 4 (9), (2009).
  10. Hájos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. European Journal of Neuroscience. 29 (2), 319-327 (2009).
  11. Wittner, L., et al. The epileptic human hippocampal cornu ammonis 2 region generates spontaneous interictal-like activity in vitro. Brain. 132 (11), 3032-3046 (2009).
  12. Dzhala, V., Valeeva, G., Glykys, J., Khazipov, R., Staley, K. Traumatic alterations in GABA signaling disrupt hippocampal network activity in the developing brain. The Journal of neuroscience. 32 (12), 4017-4031 (2012).
  13. Menendezdela de la Prida, L., Huberfeld, G., Cohen, I., Miles, R. Threshold Behavior in the Initiation of Hippocampal Population Bursts. Neuron. 49 (1), 131-142 (2006).
  14. Avoli, M., Drapeau, C., Louvel, J., Pumain, R., Olivier, A., Villemure, J. -. G. Epileptiform activity induced by low extracellular magnesium in the human cortex maintained in vitro. Annals of neurology. 30 (4), 589-596 (1991).
  15. Heinemann, U., Dreier, J., Leschinger, A., Stabel, J., Draguhn, A., Zhang, C. Effects of anticonvulsant drugs on hippocampal neurons. Hippocampus. 4 (3), 291-296 (1994).
  16. Li Zhang, C., Dreier, J. P., Heinemann, U. Paroxysmal epileptiform discharges in temporal lobe slices after prolonged exposure to low magnesium are resistant to clinically used anticonvulsants. Epilepsy research. 20 (2), 105-111 (1995).
  17. Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents – EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature Reviews Neuroscience. 13 (6), 407-420 (2012).

Tags

EpilepsyMulti-electrode ArrayCortical SliceInterictalIctalSeizureNeuronal ActivityElectrophysiology

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Dossi, E., Blauwblomme, T., Nabbout, R., Huberfeld, G., Rouach, N. Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue. J. Vis. Exp. (92), e51870, doi:10.3791/51870 (2014).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image