JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicina

Многоэлектродной массива Записи человека эпилептические Послеоперационный корковой ткани

Published: October 26, 2014
doi:
10.3791/51870
, , , ,
1Neuroglial Interactions in Cerebral Physiopathology, Center for Interdisciplinary Research in Biology,CNRS UMR 7241, INSERM U1050, Collège de France, 2Infantile Epilepsies & Brain Plasticity, INSERM U1129, PRES,Paris Descartes University, Sorbonne Paris Cité, CEA, 3Neurosurgery Department, Necker Hospital, AP-HP,Paris Descartes University, 4Rare Epilepsies Reference Center, Necker Hospital, AP-HP,Paris Descartes University, 5Neurophysiology Department,La Pitié-Salpêtrière Hospital, AP-HP, Sorbonne and Pierre and Marie Curie University

Summary

Мы здесь описывать, как выполнять многоэлектродной массива записей человеческого эпилептического корковой ткани. Эпилептические ткани резекция, подготовка ломтик и массив многоэлектродный записи интериктальных и иктальных событий показал подробно.

Abstract

Эпилепсия, влияя около 1% населения, включает в себя группу неврологических расстройств, характеризующихся периодической возникновения припадков, которые нарушают нормальную функцию мозга. Несмотря на лечение, доступные в настоящее время противоэпилептических препаратов ориентации нервных функций, одна треть пациентов с эпилепсией pharmacoresistant. В этом состоянии, хирургическое удаление области головного мозга, генерирующего припадки остается только альтернативное лечение. Изучение эпилептические тканей человека способствовало понять новые эпилептогенных механизмов в течение последних 10 лет. В самом деле, эти ткани генерировать спонтанные интериктальных эпилептические разряды, а также фармакологически вызванной иктальная события, которые могут быть записаны с классическими методами электрофизиологии. Примечательно, мульти-электродные массивы (МПС), которые микротехнологий устройства вложения массив пространственно расположенных микроэлектродов, обеспечивают уникальную возможность одновременно стимулировать и полевого Potentials, а также потенциалы действия из нескольких нейронов из разных областей ткани. Таким образом МПС записи предлагают превосходный подход к изучению пространственно-временных закономерностей спонтанного интериктальных и вызвал припадок, как события и механизмы, лежащие в основе захват начало и распространение. Здесь мы опишем, как подготовить корковых ломтики человека от хирургически удаленных тканей и записывать с МПС интериктальных и иктальных-как событий бывших естественных условиях.

Introduction

Эпилепсия является хроническим расстройством, в которой эпилептические припадки, которые являются периодические узорчатые разряды продолжительностью от нескольких секунд до десятков секунд на электроэнцефалографическими (ЭЭГ) записей, связанных с клиническими проявлениями, прервать интериктальных состояние, характеризуется наличием синхронных нейронных разрядов, длящихся десятки миллисекунд и называется интериктальных события 1. Это влияет на население примерно 1% в мире и, хотя приступы находятся под контролем в большинстве пациентов, примерно треть людей, страдающих эпилепсией не показывают адекватный ответ на АЭП 2. В этом состоянии, называется pharmacoresistant эпилепсия и чьи механизмы еще должны быть четко определены, хирургическое удаление определенной части мозга, указанной в качестве захват началом зоны остается единственной альтернативой лечения дает положительный результат для пациентов. Таким образом, резекция образцы из хирургии дают возможность изучить механизмы интериктальных вод и образовании захват и распространения, а также фармакорезистентности на жизнеспособного человека центральной нервной ткани экс естественных.

Multi-электрод массивов (МПС), состоящий из расположения пространственно распределенных микроэлектродов, обеспечить одновременное стимулирование и запись электрофизиологических деятельности от нескольких участках ткани, обеспечивая тем самым отличную подход к изучению пространственно-временных закономерностей спонтанного и вызванной активности , Эта техника, впервые применил для мониторинга изменений в развитии деятельности нейронов клеток культуры 3, а затем адаптированы для острого и органотипической головного и спинного ломтиками мозга 4 – 6, в настоящее время считается ценным электрофизиологические инструмент.

Нынешний протокол описывает, как подготовить корковых ломтики человека от хирургически удаленных тканей и записывать с МПС надежным экс VIво- интериктальный и изъятие, как события из этих кусочков. Эта техника обеспечивает, таким образом путь для удовлетворения основных механизмов, лежащих в основе эпилептических деятельности инициирования, роста и последствий противоэпилептических препаратов на обоих клеточных и сетевых уровнях. Все процедуры, используемые для получения подготовить поддерживать и записывать человека ломтики будут здесь описаны подробно.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол здесь описано следующим рекомендациям французского "Национальный консультативный комитет по d'Ethique" и объявлен как коллекторской деятельности по INSERM. 1. Резекция человека эпилептические ткани Пациенты Получение ткани мозга от пациентов, страдающих от резистентной эпилепсией. Получить письменное информированное согласие перед операцией. Для всех оперированных больных эпилепсией выполнить обширную предоперационного проработки в том числе неврологического обследования, нейропсихологической оценки, поверхностных ЭЭГ и нейровизуализации (МРТ, а иногда 18 ФДГ-ПЭТ; Рисунок 1А), с последующим послеоперационным гистологическим исследованием удаленной ткани (рис 1В) , ПРИМЕЧАНИЕ: Операция показана, когда различные изыскания локализовать же на захват начала зоны и когда польза от его удаления превышает хирургические риски. Хирургия Майntain противоэпилептических препаратов до операции. Выполнение операции под общим наркозом: индукцию с вдыхаемым севофлурана (6% поставляемого соотношении и 100% вдыхаемого фракции O 2), внутри венозной суфентанил (0,3 мкг / кг) и antracurium (0,5 мг / кг), за которым следует обслуживания с интра венозной суфентанил (0,5 мкг / кг / ч) и вдыхании севофлурана (1 MAC). С помощью системы нейронавигации, чтобы позволить точную локализацию поврежденного мозга (рис 1С). После рассечения кожи, выполнить заусенцев отверстие в кости с последующим трепанации черепа с высоким разлива дрель. Аккуратно поднять костный лоскут, и открыть твердую мозговую оболочку с ножницами (рис 1D). Используйте интраоперационного ультразвука для облегчения идентификации аномального коры и микрохирургических инструментов и ультразвукового аспиратора под операционным микроскопом. Коагуляции и сократить Пио-арахноидальных самолет в соответствии с sulcal пределах. Используйте subpial рассечение на рelease кора с Пиа вокруг поврежденного области. Разрежьте белое вещество под ненормального мозга выполнять одну часть "единым блоком" резекции, щадя как можно больше сосудистую. Избегайте травматического манипуляции коры. Вырезать толщиной 1 см кусочек из удаленной ткани вдоль направлении, ортогональном к пиальных поверхности, включая дно борозды и переходного коры. 2. Искусственный спинномозговой жидкости (ACSF) для Slice подготовки, инкубации и записи ACSF для подготовки ломтик Подготовьте 1 л сахарозы на основе ACSF 7,8, содержащий (в мМ): 250 сахарозы, 3 KCl, 25 NaHCO 3, 10 D-Глюкоза, 1 CaCl 2, MgCl 2 10; растворить эти соли в деионизированной воде и кислородом раствор с карбогена в течение по крайней мере 10 мин. Поместите ~ 700 мл сахарозы ACSF при -80 ° С в течение 50-60 мин (или -150 ° С в течение 15-20 мин). Держите остальную частьРешение под оксигенации в лед. ПРИМЕЧАНИЕ: ACSF для подготовки среза можно хранить при температуре 4 ° С; В этом случае, добавление CaCl 2 и MgCl 2 сутки эксперимента, перед его охлаждением. ACSF для среза инкубации и записи Подготовьте по крайней мере, 3 л записи ACSF 7,8, содержащий (в мМ): NaCl 124, KCl 3, NaHCO 3, 26, 10 D-Глюкоза, 1,6 CaCl 2, MgCl 2 1,3; растворить эти соли в деионизированной воде и кислородом раствор с карбогена. Перед добавлением MgCl 2, сохранить некоторые ACSF выполнять запись в 0 Mg 2+ ACSF. ПРИМЕЧАНИЕ: инкубация / записи ACSF можно хранить при температуре 4 ° С; в этом случае, добавьте CaCl 2 и MgCl 2 день эксперимента. 3. Оборудование для Slice инкубации и записи Интерфейс камеры для среза инкубации Используйте мозг ломтик камеру для поддержания живых срезов Экс естественных </ EM> в режиме интерфейса. Примечание: камера состоит из нижней секции, которая содержит нагревание и чувствительными элементами и керамический барботер и заполнен дистиллированной водой, и верхней части, где ломтики отдыхать на листе ткани хрусталика в плоской области в центре камеры (Фигура 2А – B). Используйте два отдельных мелких трубок из политетрафторэтилена, через которую preoxygenated ACSF поступает в камеру. ПРИМЕЧАНИЕ: Трубы спирально в нагретой воде и достичь верхней части камеры; то решение выходит с помощью капиллярного действия с ткани хрусталика, который передает решение в выездных скважин. Соединить PTFE трубок интерфейса камеры, чтобы перистальтического насоса, чтобы обеспечить непрерывную перфузию ломтиков с preoxygenated среды. Поддерживайте высокую напряженность кислорода путем кислородом с карбогена (95% O 2 и 5% CO 2) через керамический барботером. Примечание: Этот нагревают и увлажняют газовой смеси достигаетломтики в верхней части камеры через соответствующие отверстия. Поддержание температуры в верхней части камеры, подключив камеру к контроллеру температуры, с помощью специального двойного состава кабель, имеющий разъем для камеры нагревательного элемента и внешнего датчика температуры на одном конце. Установите датчик рядом ломтики, чтобы проверить температуру по всей инкубации (рис 2С). Многоэлектродной массив записей Используйте плоские многоэлектродной массивов с 120 нитрида титана электродами (диаметр 30 мкм) с изоляцией из нитрида кремния и внутреннего электрода, расположенных в 12 х 12 матрицы с центра до центра шагом 200 мкм. ПРИМЕЧАНИЕ: Другие конфигурации с различным диаметром электрода и расстояния возможны. В частности, чип MEA может быть расширен, чтобы попробовать более крупные кусочки тканей человека. Приобретать электрические сигналы в 10 кГц с использованием системы MEA2100-120 (до и фантастическиефильтр усилитель со встроенным сбора данных и аналого-цифрового преобразователя, 16-битным разрешением данных, диапазон входного напряжения и пропускной способности регулируемой с помощью программного обеспечения) через специализированного программного обеспечения (MC_Rack). ПРИМЕЧАНИЕ: MEA2100 headstage наделен из металлической пластины для фиксации нагреваемого элемента перфузии через магнитные держатели, чтобы непрерывно заливать ломтики на протяжении всей сессии записи. Удерживая ткани вниз на MEA по маленькой домашней платины якорь, который обеспечивает хорошую электрическую связь между среза и электродами. 4. Подготовка интерфейса палаты и инструменты для вскрытия и нарезки Камера Интерфейс Заполните нижнюю часть интерфейсной камере с дистиллированной водой. Убедитесь, что уровень воды полностью погружает нагревательный элемент и составляет от 2 до 4 мм ниже соединения между нижней и верхней части камеры. Проверьте этот уровень ежедневно перед включением отопления,для того, чтобы избежать повреждения нагревательного элемента. Подключите камеру к источнику карбогена, наделенного вторичного регулятора расхода для точной настройки давления газа. Вырежьте лист ткани хрусталика, чтобы соответствовать плоскую область среза камеры, и расположить его рядом с входной решений труб, чтобы любой пузырь побег из строки ввода до достижения ломтики. Вырезать два куска мулине тех пор, пока кусок ткани хрусталика, и расположить их вдоль главных сторонах плоской области камеры. ПРИМЕЧАНИЕ: Это помогает немного поднять уровень раствора перфузии в камере. Установка скорости потока перистальтического насоса со скоростью 1 мл / мин и включить насос. Начало оксигенацию воды в нижней части камеры. Установите температуру терморегулятора при 37 ° С и включите его. Накройте верхнюю часть интерфейса камеры с куском парафильмом и подождите не менее 30 минут для TEMPERATЮр, чтобы увеличить и стабилизировать. Инструменты для вскрытия и нарезки Подготовьте рассечение комплект, состоящий из двух тонких щипцов, шпателем, небольшой ложкой и ножом; две стеклянные чашки Петри, две щетки, а также цианакрилат клей. Установите параметры vibratome: толщины, 400 мкм; Частота, 70 – 90 Гц; Амплитуда, 0,9 – 1 мм, скорость: 0,1 мм / сек. 5. Человеческий Кортикальная Slice Подготовка Извлеките сахарозы на основе ACSF от -80 ° C морозильнике и смешать его с целью получения своего рода каше. Ее кислородом с карбогена, положить ~ 250 мл в стеклянной бутылке и держать его в бутылке Дьюара, заполненный льдом, в то время как происходит в комнату хирургии больницы, чтобы получить ткани. В то же время, сохранить остальную при -20 ° С. ПРИМЕЧАНИЕ: Во время операции, нейрохирург рассекает небольшой блок корковой ткани. Сразу же место образца в ледяной сахарозы ACSF для передачи в лабораторию. Держите время, необходимое для перевода из больницы в лабораторию, но не более 30 мин. В лаборатории, взять сахарозы на основе кислородом ACSF из -20 ° C морозильник, смешать его иметь слякоть, заполнить чашку Петри и буферную лоток vibratome и начать кислородом и с карбогена. Осторожно вынуть кусок ткани человека из бутылки с ложкой и положить его в чашку Петри (рис 2D). Использование пинцета, аккуратно удалите сгустки крови, сосудов и мозговых оболочек, чтобы избежать сопротивления во время нарезки. Удалите мозговые оболочки, состоящая в мягкой материи, начиная с боков блока ткани, обращая внимание, чтобы не повредить поверхности коры. С лезвием, вырезать часть ткани, чтобы получить плоскую поверхность, которая будет приклеен на тарелке vibratome образца. ПРИМЕЧАНИЕ: мозговые оболочки, состоящие в мягкой материи, удаляются начиная с боков блока ткани, обращая внимание, чтобы не повредить поверхности коры. Если блок тиСГУП больше, чем MEA камеры, вырезать кусок соответствующих размеров перед склеиванием его на образце пластины (рис 2Е). Клей ткани, чтобы получить поперечные срезы коры, поместить его в буфер лотка и сократить 400 мкм срезы на низкой скорости (0.1 мм / сек) (рис 2F). Вырезать куски ткани хрусталика с размерами срезов; с помощью шпателя и щеткой, передавать ломтики на этих линз тканей и инкубировать их в интерфейсной камере при 37 ° С в течение по крайней мере 1 часа перед началом записи (рис 2G – I). Непрерывно не хранить ломтики в тех же условиях до использования. ПРИМЕЧАНИЕ: Размещение ломтики на объективов является важным шагом для облегчения как кровоснабжение нижней части ломтиками и удаление кусочков из интерфейса камеры до начала записи. Во время передачи ломтики на ткани хрусталика, управлять ими очень осторожно, избегая касаться области коры слой скисть. Подготовьте ломтики по одному за раз и сразу же передавать каждый из них к интерфейсной камере, с тем чтобы обеспечить надлежащую подачу кислорода и температуры; нарезать блок удаленной ткани как можно быстрее. 6. Подготовка MEA установки для Recordings Включите систему перфузии с использованием перистальтического насоса и системы MEA к компьютеру. Кислородсодержащих записи ACSF. Поместите пустой чип MEA внутри усилителя. Установите регулятор температуры для отопления канюли элемент для достижения 37 ° C в МЭС камеры и начать перфузии в 5-6 мл / мин. Примечание: Как правило, необходимо, чтобы установить температуру 3-4 ° С выше, чем тот, требуемой в зависимости от температуры в помещении и скорости потока. Проверьте температуру в МЭС камеры с тонкой термометра, поместив его ближайший можно ближе к центру, не касаясь площадь электродов. Начало записи Softwarе и проверить, что все МПС электроды хорошо связан и что нет никакого шума из-за перфузии. Начните MEA_Monitor проверить функционирование таблицы камеры. 7. Передача Slice Из интерфейса палаты MEA Chip для записи Налейте некоторые нагревали записи ACSF в стеклянную чашку Петри; с пинцетом, взять кусочек от интерфейса камеры, захватывая его через ткани хрусталика, и положить его в чашку Петри. Осторожно снимите кусочек от ткани. Если уровень раствора в интерфейсе камеры тщательно регулировать во время инкубации, срез будет отделить от ткани хрусталика только путем погружения его в растворе; в противном случае, используйте маленькую кисть, чтобы облегчить отряд. Заполните чип МПС с некоторым ACSF и с помощью шпателя, передать кусочек в него. С пластиковой пипетки Пастера, аккуратно удалите решение сделать срез придерживаться на площади электродов и держать его на месте с платиновым Anchили. Добавить 1 мл записи ACSF, поместите чип МПС в усилитель и начать перфузии в 5-6 мл / мин (рис 2J – L). Проверьте положение среза в области записи MEA с помощью MEA_Monitor, при необходимости отрегулируйте его для записи из слоев коры и сфотографироваться. Начните запись.

Representative Results

Запись кортикальной среза активности человеческого начинается в то время перфузии ткани с нормальной ACSF записи (как описано ранее) 7,8. В этом состоянии, когда ткань хорошо сохранившийся во время операции и в дальнейшем во время передачи ткани из больницы и ломтик подготовки, можно наблюдать спонтанную активность, в виде небольших интериктальных-как событий, обнаруженных с малых кластеров МПС электродов. Интериктальных-как разряды состояла в поле потенциала, как правило, двухфазной, включающий начальную резкую негативную отклонение, достигая десятков микровольт, сопровождаемые больше противоположной волны прочного несколько десятков миллисекунд. Быстрые действия многоквартирных обычно встраиваются в поле потенциала, главным образом, в начальной части. Типичный пример межприступном-активности, как проиллюстрировано на Рисунке 3Aii, где след записаны на MEA электрода, показанного. Для записи эпилептические припадки с вVitro корковых ломтики человека, необходимо, чтобы заливать их с "эпилептогенной" ACSF, в котором Mg 2+ отсутствует и К + повышается до 6 мм, чтобы повысить возбудимость ткани 1 (увеличение K + от 3 ​​до 6 мм не достаточно, чтобы индуцировать судороги; данные не показаны). После перфузии с 0 Mg 2+ 6 мМ K + ACSF начала, активность кортикальных срезов постепенно увеличивается, и первый захват появляется в пределах от 15 до 20 мин (15,4 ± 1,7 мин, N = 10, из 5 пациентов; фиг.3 Ай ). Мы вызывали иктальная-подобную активность, как показано на рисунке 3, в 75% обследованных больных и в 66,7% от всех зарегистрированных ломтиками. Эпилептические деятельности отражаются от соседних электродов чип MEA, и сравнение динамики наступления полевых возможных событий позволяет изучать их сайт генезиса и распространения. Представитель захват записаны с ломтиком гулКора головного мозга с системой MEA показано на фигуре 3В (представительного след захвата, записанной с помощью одного электрода MEA показан на более высоком временном разрешении на рисунке 3 AIII). Обратите внимание, что захват записывается практически от всех электродов чипа MEA, таким образом, указывая, что он способен распространяться в значительной области коры. Кроме того, глядя на одиночных следов записанных от каждого электрода, можно наблюдать постепенное распространение захвата по всей ткани: на самом деле, он начинает сначала в кортикальной области, охватывающей правую половину электродной решетки, и она постепенно распространяется к Площадь покрытия левую половину (.. я е, сравнить следы от электрода L6 и В6; рис 3B). Рисунок 1: корковых дисплазия. d ее хирургическое удаление тип Тейлор фокусное корковых дисплазия (белая стрелка), погруженные в левой лобной доли борозды визуализируется на предоперационной МРТ (A), а позднее подтвержден гистологическое исследование (B) MAP киназы маркировки; Масштабная линейка: 200 мкм), показывающий корковой dyslamination, аномальные нейроны и дорожки на нейроны с неполным миграции в нижней белого вещества. Во время операции, дисплазия локализован по данным МРТ с системой нейронавигационной (C). Визуализация извилины, содержащих дисплазии во время операции (D). На рисунке 2:. Оборудование и процедура кортикального препарата человеческого среза интерфейс камеры используется для поддержания корковых ломтики человека экс виво (А); Остальные ломтики на листе ткани хрусталика в плоской области в верхней части камеры (B), где датчик температуры (С, слева), подключенного к контроллеру температуры (C, вправо, вверх) через двух- состава кабель (C, вправо, вниз), помещается поддерживать 37 ° C в течение времени ломтик инкубации. После того, как получены, разместить резекции блок ткани в чашке Петри, наполненную ледяной сахарозы на основе ACSF (D) и удалить сгустки крови, сосуды и мозговые оболочки, для облегчения нарезки. Если блок ткани больше, чем МЭС камер, изолировать кусок соответствующих размеров с лезвием (E) и приклеить ее на vibratome образца пластины (F). Вырезать 400 мкм ломтиками и с помощью шпателя (G) перевести их на куски ткани хрусталика (H) и инкубировать их в интерфейс камеры (I). Перед записью Ремове объектива ткани, погрузив кусочек в чашке Петри, наполненную ACSF и передать его в ACSF заполнено MEA чипа с помощью шпателя (J). Снимите решение позволить кусочек придерживаться на МЭС (K) и держите его в этом положении с помощью платинового якорь. Поместите МЭС в усилителе (L), начать перфузии и запись. Рисунок 3: МЭС записи эпилептических припадков в корковых ломтиками человека (А) представитель след корковой среза деятельности человека, записанного с помощью MEA электрода показана на панели ввода.. В присутствии нормального ACSF, можно наблюдать, как интериктальных-спонтанную активность (маленький серый прямоугольник, увеличенное в панели II); Затем, когда перфузии с 0 Mg 2+ 6 мМ K + ACSF начала, первым seizuповторно появляется с задержкой ~ 15 мин и сопровождается другими событиями на 2-3-минутного интервала. Панель III показывает захват в большой серый прямоугольник в панели ввода с увеличенном масштабе. Синий след иллюстрирует масштаб активности, как обозначено синей линии и стрелки. Секция IV) приведены данные, показанные на панели III) высокочастотную фильтрацию на 250 Гц, раскрывающие-блок мульти активность при увеличении (синий след). (B) представитель записи об изъятии в присутствии 0 Mg 2+ 6 ммоль K + ACSF из всех МПС электродов. Каждый квадрат представляет собой электрод 12 х 12 MEA массива и показывает окно времени 80 сек; пунктирная линия указывает на положение поверхности коры относительно MEA массива.

Discussion

Pharmacoresistant эпилепсия это редкое состояние, которое может быть установлено в тканях человека в пробирке. Это позволяет исследовать эпилептический коры головного мозга человека, который отображает конкретные дефекты, которые лишь частично воспроизведенные на животных моделях. Метод здесь описано позволяет подготовке и записи послеоперационных тканей человека экс естественных с сохраненной жизнеспособности клеток и сетей, чтобы они спонтанно производят эпилептические деятельности. Сохраняя подобные мероприятия, чем те, которые записаны в естественных условиях имеет решающее значение для изучения механизмов генезиса патологических деятельности. Кроме того, такие методы позволяют исследовать ткани человека и недопущении идеальные животные модели болезни. Однако, изучая человеческую ткань требует синхронизации между нейрохирургов и экспериментальной лаборатории. Ткань перевозки требуется специальное осторожность, чтобы не травмировать. Кроме того, как количество образца и ткани ограничена. Наконец, доступ к надлежащим тканей контроля является майн беспокойство. С этой подготовки, послеоперационный ткани самопроизвольно интериктальных-как сбросы в нормальном ACSF 7,8. Иктальная-как события могут быть выявлены в модифицированном, proconvulsive ACSF так что механизмы изъятия инициации и перехода от межприступном состоянии до судорог могут быть исследованы.

Человек ткань может быть жизнеспособными в течение до 10 ч в условиях интерфейса. Ломтики считались жизнеспособными при многоквартирных деятельности или потенциалы поля наблюдались спонтанно и, когда такие действия были вызванный увеличением возбудимости через внеклеточного возрастает калия и / или снижения магния. Хотя различия в активности происходит, вероятно, отражает различия в патологии и областях коры, мы исследовали эпилептогенных характеристики ткани только у здоровых ломтиками спонтанно- интериктальных и вызвала иктальная разрядов. В целях сохранения тканей жизнеспособность и активность, интерфейс камеры будет использоваться для хранения тон нарезает на 36-37 ° С в течение восстановления перед записью в системе MEA. Действительно, несколько групп наглядно продемонстрировали преимущества на основе системы хранения интерфейса по сравнению с стандартной хранения стакан и важности температуры для сохранения сетевой активности, такие как спонтанных острых волн ряби или холинергических вызванной колебаниями 9,10. Хранения Интерфейс ломтиками ранее использовался для записи эпилептической активности от человека гиппокампа и subicular ломтиками 1,11. При существующей технике MEA, после восстановительного периода от нарезки в условиях интерфейса, сетевую активность записывается в погруженных условиях, в присутствии высокой скорости потока (5-6 мл / мин) при 37 ° С, с системой MEA. Уменьшенный диаметр (1,8 см) из MEA чипа, который ограничивает небольшой объем камеры (<1,5 мл), вместе с повышенным расходом, улучшает снабжение кислородом из среза, которая была продемонстрирована критическим фактором для спонтанной и ФГАrmacologically вызванной сетевые мероприятия 9,10. Кроме того, уменьшается количество циркулирующей ACSF облегчает тестирование фармакологическую.

Процедура нарезки, однако травматизм на тканях 12. Оба нейронов архитектура и хлорид гомеостаз как представляется, возмущенного на поверхности ткани (50 мкм). Происхождение деятельности, зарегистрированных МЭС чипов, которые образец ткани в основном поверхностно, без глубокого проникновения, могут возникнуть из травмированных участков. Тем не менее, наши данные показывают, что внеклеточные потенциалы поля, регистрируемой локально записываются в большинстве МЭС электродов и предыдущей работы показывают, что они интегрированы в течение 100 до 200 мкм расстоянии от места записи 13, предполагая, что припадки, записанные в нашей подготовке, вряд ли будут производится травмированных участков. Кроме того, в исследованиях, проведенных с вольфрамовыми электродами, позволяющих глубокое проникновение, что эпилептические деятельности, записанные в тканях человека похожидля тех, наблюдаемых у больных эпилепсией 1,7,8.

Другой предел экс ись ткани является нарушение связей между различными областями мозга, тем самым ограничивая динамические neuromodulations. Это может объяснить, почему в таком ткани не иктальная-как событие не спонтанно записал, но требуется, чтобы быть вызваны ионной манипуляции или фармакологической стимуляции повышения возбудимости. Соответственно, в данном протоколе, захват типа события индуцируются путем объединения изменение внеклеточного К + от 3 ​​до 6 мм и снижение внешнего Mg 2+ от 1,3 мМ до Mg 2+ -Безплатная ACSF, с целью повышения тканей возбудимость и удалить Mg 2+ блок рецепторов -зависимой NMDA. В самом деле, это ранее было показано, что активность индуцированной эпилептиформный в неокортикальными и срезах гиппокампа с использованием Mg 2+ -бесплатно ACSF напоминает электрографической припадки, записанных в естественных условиях 14. Кроме того,было показано, что эпилептиформных разрядов, полученные в временных слоев лепестков приобретают устойчивость к клинически используемых противосудорожных после длительного воздействия Mg 2+ -Безплатная ACSF 15,16, обеспечивая тем самым модель для исследования pharmacoresistant припадок, как события в пробирке.

МЭС позволяют записывать до двух, полевых потенциалов и многоквартирных деятельности, состоящих в нейронных потенциалов действия бывших естественных условиях. Таким образом, МПС являются мощным электрофизиологические инструмент по сравнению с ЭЭГ, которые исследуют полевые потенциалы, генерируемые синхронных деятельности нейронных ансамблей в естественных условиях, но не дают доступа к одного нейрона поведения 17. Хотя более поздние микроэлектродов может записывать многоквартирных деятельности в естественных условиях, состоящие в нейронных потенциалов действия, они являются инвазивными, поэтому их применение в основном ограничивается научно-исследовательских целей в течение внутричерепных записей. В частности, МПС записи представляют собой технику выбораизучать пространственно-временные закономерности эпилептических событий, механизмы, контролирующие захват начало и распространение и действие классических и новых противоэпилептических препаратов. Примечательно, разгадать типы клеток и сигнализации основу эпилептических разрядов, шип методов сортировки и фармакологическое тестирование должно быть в сочетании с методами МПС. Хотя МПС может дать доступ к отдельным шипами, они не предоставляют информацию о синаптических и биофизических свойств. В будущем, другие методы должны быть соединены с МПС записей для того, чтобы лучше сотовой поведения образца, сетевой активности и синаптической передачи сигналов. Например, изображения флуоресценции распутать нейронов или глиальных клеток поведение, а также динамику ионов, могут быть объединены с МПС записей. Кроме того апостериорный гистологический анализ также может выявить таких специфических повреждений клеточных типов, белками или рецепторами, так что расположение эпилептических деятельности могут быть соотнесены с конкретным перегруппировокнервная структура. Система МПС также может быть встроен в патч-зажим настройке соотнести отдельные клетки или проводимости с деятельности в области народонаселения. В будущем, optogenetic инструменты также могут быть использованы при условии, что человека ломтики можно культивировать в долгосрочной перспективе, как выполняется для органотипических ломтиками, так что трансфекции или инфекции специфические типы клеток могут быть выполнены.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантами от НРУ (Программа Блан нейронаук), FRC (Федерация пур ля Recherche сюр-ле-Cerveau), Город Париж (Программа всходов), INSERM и Ла Питье Сальпетриер больница (Поступательное контрактная исследовательская) для NR, от Neuropôle де Recherche Франсильен (Nerf) для ЭД, из Университета Пьера и Мари Кюри UPMC (Программа конвергенции) и от института дю Cerveau др электронной ла Moelle epiniere (Париж) в GH

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Brain Slice Chamber-2: Interface AutoMate Scientific, Inc. S-BSC2 It requires separate temperature controller
2-channel Temperature Controller Multichannel Systems, Germany TC02 It allows to plug in and use 2 interface chambers. 
Special cable for connection of TC01 to S-BSC2 with external reference PT100 Multichannel Systems, Germany CA3 The reference PT100 is placed near the slices 
6pin plug-connector with PT100 Multichannel Systems, Germany TS-PT100 External reference for CA3 cable
MEA workstation for recording data from 120-electrode MEAs Multichannel Systems, Germany MEA2100-120 It includes MEA2100-120 headstage and MEA2100 interface board. www.multichannelsystems.com
Microelectrode array for MEA2100-120 Multichannel Systems, Germany 120MEA200/30 Electrode spacing: 200 µm; electrode diameter: 30 µm; glass ring: 6 mm high. Different configurations (spacing, diameter, ring) possible. 
Video Microscope Table Multichannel Systems, Germany MEA-VMT-1 Table with a video microscope underneath to image the electrode field of the MEAs in an amplifier placed on top of the table and transfer the image to a computer.
Perfusion cannula Multichannel Systems, Germany PH01 Heatable perfusion cannula with temperature sensor; temperature can be programmed with TC02 controller
MC_Rack Multichannel Systems, Germany Software for data acquisition and recordings
Magnetic Perfusion Holder Multichannel Systems, Germany MPH Magnetic perfusion holder for PH01 element to fix the perfusion cannula and connect the perfusion system to the amplifier's ground
Neuroexplorer Nex Technologies Software for data analysis; info@neuroexplorer.com
Peristaltic pump (drive unit) Gilson F155001 0,01 to 48 rp
Peristaltic pump (pump head) Gilson F117800 R2 two channel
Ultrasonic aspirator Integra Life sciences, USA Cusa Excel + It allows blunt subpial dissection of the cortex
Neuronavigation Isis Solutions, France Surgiscope It allows real time identification of the brain structure on the preoperative MRI
Vibratome HM 650 V Microm Block slicing into 400 μm thick slices
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Huberfeld, G., et al. Glutamatergic pre-ictal discharges emerge at the transition to seizure in human epilepsy. Nature Neuroscience. 14 (5), 627-634 (2011).
  2. Kwan, P., Brodie, M. J. Early identification of refractory epilepsy. New England Journal of Medicine. 342 (5), 314-319 (2000).
  3. Van Pelt, J., Corner, M. A., Wolters, P. S., Rutten, W. L. C., Ramakers, G. J. A. Longterm stability and developmental changes in spontaneous network burst firing patterns in dissociated rat cerebral cortex cell cultures on multielectrode arrays. Neuroscience Letters. 361 (1-3), 86-89 (2004).
  4. Sun, J. -. J., Luhmann, H. J. Spatio-temporal dynamics of oscillatory network activity in the neonatal mouse cerebral cortex: Network oscillations in neonatal cerebral cortex. European Journal of Neuroscience. 26 (7), 1995-2004 (2007).
  5. Dossi, E., et al. Functional Regeneration of the ex-vivo Reconstructed Mesocorticolimbic Dopaminergic System. Cerebral cortex. 23 (12), 2905-2922 (1991).
  6. Darbon, P., Scicluna, L., Tscherter, A., Streit, J. Mechanisms controlling bursting activity induced by disinhibition in spinal cord networks. The European journal of neuroscience. 15 (4), 671-683 (2002).
  7. Cohen, I., et al. On the Origin of Interictal Activity in Human Temporal Lobe Epilepsy in Vitro. Science. 298 (5597), 1418-1421 (1126).
  8. Huberfeld, G., et al. Perturbed chloride homeostasis and GABAergic signaling in human temporal lobe epilepsy. The Journal of neuroscience. 27 (37), 9866-9873 (2007).
  9. Maier, N., Morris, G., Johenning, F. W., Schmitz, D. An Approach for Reliably Investigating Hippocampal Sharp Wave-Ripples In Vitro. PLoS ONE. 4 (9), (2009).
  10. Hájos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. European Journal of Neuroscience. 29 (2), 319-327 (2009).
  11. Wittner, L., et al. The epileptic human hippocampal cornu ammonis 2 region generates spontaneous interictal-like activity in vitro. Brain. 132 (11), 3032-3046 (2009).
  12. Dzhala, V., Valeeva, G., Glykys, J., Khazipov, R., Staley, K. Traumatic alterations in GABA signaling disrupt hippocampal network activity in the developing brain. The Journal of neuroscience. 32 (12), 4017-4031 (2012).
  13. Menendezdela de la Prida, L., Huberfeld, G., Cohen, I., Miles, R. Threshold Behavior in the Initiation of Hippocampal Population Bursts. Neuron. 49 (1), 131-142 (2006).
  14. Avoli, M., Drapeau, C., Louvel, J., Pumain, R., Olivier, A., Villemure, J. -. G. Epileptiform activity induced by low extracellular magnesium in the human cortex maintained in vitro. Annals of neurology. 30 (4), 589-596 (1991).
  15. Heinemann, U., Dreier, J., Leschinger, A., Stabel, J., Draguhn, A., Zhang, C. Effects of anticonvulsant drugs on hippocampal neurons. Hippocampus. 4 (3), 291-296 (1994).
  16. Li Zhang, C., Dreier, J. P., Heinemann, U. Paroxysmal epileptiform discharges in temporal lobe slices after prolonged exposure to low magnesium are resistant to clinically used anticonvulsants. Epilepsy research. 20 (2), 105-111 (1995).
  17. Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents – EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature Reviews Neuroscience. 13 (6), 407-420 (2012).

Tags

EpilepsyMulti-electrode ArrayCortical SliceInterictalIctalSeizureNeuronal ActivityElectrophysiology

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Dossi, E., Blauwblomme, T., Nabbout, R., Huberfeld, G., Rouach, N. Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue. J. Vis. Exp. (92), e51870, doi:10.3791/51870 (2014).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image