人間のてんかん術後皮質組織の多電極アレイ録音

注：ここに記載されているプロトコルは、フランスの「諮問委員会国立D'Ethique」のガイドラインに従っており、INSERMによる収集活動として宣言されています。 人間のてんかん組織の1切除患者難治性てんかんを患っている患者からの脳組織を得る。手術前に書面によるインフォームドコンセントを得る。 すべてのてんかん患者は神経学的検査、神経心理学的評価、表面EEG、および神経画像を含む広範囲な術前精密検査を行う操作し、切除した組織の手術後の組織学的検査に続いて（MRI、時には18 FDG-PETスキャン図1A）、（図1B） 。注：多様な探査は、同様に発作発症ゾーンをローカライズする際、その除去の利点は、手術のリスクを超えた場合に手術が示されている。 手術マイ手術前に抗てんかん薬をntain。全身麻酔下で手術を行う：静脈内フェンタニルとメンテナンスが続く吸入セボフルラン（6％納入比率とO 2 100％、吸入性画分）、静脈内フェンタニル（0.3μgの/ kg）及びantracurium（0.5 mg / kgを）による誘導を、 （0.5μgの/ kg /時間）および吸入セボフルラン（1 MAC）。 病変皮質（ 図1C）の正確な局在を可能にするためにニューロナビゲーションシステムを使用してください。皮膚切開した後、高いスピルドリルで開頭術に続いて骨にバーホールを行う。そっと骨弁を昇格し、ハサミ（ 図1D）で硬膜を開きます。 手術用顕微鏡下での異常な皮質の同定、および顕微楽器や超音波吸引を容易にするために、術中超音波を使用してください。 脳溝制限に従ってPIO-くも膜面を凝固させるとカット。 rに軟膜下解剖を使用してくださいエリーズ病変領域の周りPIAから皮質。 血管系をできる限り温存、切除 "一括"ワンピースを実行するために異常な皮質下の白質をカットします。皮質の外傷性の操作は避けてください。 溝底と過渡的な皮質を含む軟膜表面に直交する方向に沿って切除組織の外に1cm厚のスライスをカット。 スライスの準備、インキュベーションおよび録音2.人工脳脊髄液（ACSF） スライス標本用ACSF （単位：mm）を含む、スクロースベースのACSF 7,8 1Lのを準備します：250スクロース、3のKCl、25のNaHCO 3、10 D-グルコース、1のCaCl 2、10のMgCl 2;脱イオン水中でこれらの塩を溶解し、少なくとも10分間、カルボゲン溶液に酸素。 （15〜20分間、または-150℃）で50〜60分間-80℃でスクロースACSFの〜700ミリリットルを入れてください。残りの部分を保つ氷で酸素下で溶液。 NOTE：スライスを調製するためのACSFを4℃で保存することができる。この場合には、これを冷却する前に、実験の日のCaCl 2およびMgCl 2を加える。 スライスインキュベーションおよび記録用ACSF （単位：mm）を含む、記録ACSF 7,8の少なくとも3リットルを準備します：124のNaCl、NaHCO 3で3のKCl、26、10 D-グルコース、1.6のCaCl 2、1.3のMgCl 2;脱イオン水中でこれらの塩を溶解し、カルボゲン溶液に酸素。のMgCl 2を追加する前に、0 Mg 2+を ACSFで録画を実行するために、いくつかのACSFを保つ。注：インキュベーション/記録ACSFは4℃で保存することができる。この場合には、CaCl 2およびMgCl 2を 、実験の日を追加。 スライスインキュベーションおよび録音3.機器スライスインキュベーションのためのインターフェース室スライスex vivoで生きて維持するために、脳切片室を使用してください<インタフェースモードで/ em>の。注チャンバは加熱及びセンサ素子とセラミックバブラーを含み、蒸留水で満たされている下側部分、及び上部から構成され、スライス内の平坦な領域に水晶体組織のシート上に載るチャンバの中心（ 図2A – B）。 preoxygenated ACSFがチャンバに入る介して2つの別々の細かいPTFEチューブを使用します。注意：チューブが加熱された水は渦巻きチャンバの上部に到達する。次いで溶液を、出口ウェルに溶液を搬送する水晶体組織との毛管作用によって出る。 インターフェース室のPTFEチューブはpreoxygenated媒体とスライスの連続灌流を可能にするために、蠕動ポンプに接続します。 セラミックバブラーにカルボゲン（95％O 2および5％CO 2）で酸素化することにより、高酸素圧を維持する。注：これは温め、加湿ガス混合物が到達する適切な穴を介してチャンバの上部にスライス。 チャンバの加熱素子と、一端に外部温度センサのためのコネクタを有する、特殊なダブルエンドケーブルを介して、温度制御、チャンバを接続することにより、チャンバの上部の温度を維持する。インキュベーション（ 図2C）全体の温度をチェックするために、スライスの近くにセンサーを配置します。 多重電極アレイ記録 200μmの中心間間隔を有する12×12マトリクス状に配置された窒化ケイ素及び内部参照電極と絶縁された120窒化チタン電極（直径30μm）を用いて平面マルチ電極アレイを使用する。注：異なる電極直径及び間隔を有する他の構成も可能である。具体的には、MEAチップは、人間の組織の大きなスライスをサンプリングするために広げることができる。 （前とFiのMEA2100-120システムを使用して10kHzで電気信号を取得する専用ソフト（MC_Rack）を介して統合されたデータ収集およびアナログデジタル変換器、16ビットのデータ分解能、ソフトウェアを介して調整可能な入力電圧範囲および帯域幅）とLTERアンプ。注：MEA2100ヘッドステージを連続的に記録セッションを通してスライスを灌流する、磁気ホルダーを通して加熱可能な灌流要素の固定のための金属板から恵まれている。 スライスと電極との間に良好な電気的結合を確実に小さな自家製プラチナアンカー、によってMEAに組織を押したままにします。 4.インターフェイス商工の調製と解剖とスライスするためのツールインターフェース室蒸留水でインターフェース室の下部を埋める。水のレベルは完全に発熱体を浸漬し、チャンバの下部と上部セクションとの間の接合部、下記2〜4ミリメートルであることを確認してください。毎日の加熱に切り替える前に、このレベルをチェックし、発熱体の損傷を回避するためである。 ガス圧の微調整のための二次流れのレギュレータに恵まれカルボゲン源にチャンバーを接続してください。 スライス室の平らな面積を合わせるためにレンズティッシュのシートをカットし、スライスに到達する前に、入力ラインから任意の気泡を逃がすために、入力されたソリューション管に近いそれを配置します。 レンズ組織片である限り本鎖木綿糸を2枚カットし、室内の平らな領域の主要な側面に沿ってそれらを配置します。注：これは、わずかにチャンバー内の灌流液レベルを上げるのに役立ちます。 1ml /分で蠕動ポンプの流量を設定し、ポンプを作動させる。 チャンバーの下部に水の酸素化を開始します。 37℃の温度コントローラの温度を設定し、それをオンに。パラフィルム片とのインターフェース室の上部を覆い、temperatために少なくとも30分待っUREが増加し、安定させる。 解剖とスライスするためのツール 2本の細いピンセット、へら、小さなスプーンとブレードからなる解剖キットを準備します。二枚のガラスペトリ皿、2つのブラシと同様にシアノアクリレート接着剤。 ビブラトームのパラメータを設定します。厚さは、400μmである。周波数、70から90 Hzの。振幅は、0.9〜1ミリメートル、スピードさ0.1mm /秒。 5.人間の皮質スライスの準備 -80℃の冷凍庫からショ糖ベースのACSFを削除し、スラッシュのようなものを得るためにそれを混ぜる。組織を得るために、病院の手術室に通いながら、カルボゲンでそれに酸素をガラス瓶に〜250ミリリットルを入れて、氷で満たされたデュワー瓶に保管してください。一方、-20℃で休息を保つ。 注：手術中、神経外科医は、皮質組織の小さなブロックを解剖。直ちに研究室に転送するために、氷冷スクロースACSFでサンプルを置く。 30分を上限とする研究室への病院からの転送に必要な時間を保つ。研究室では、スラッシュを持っているためにそれを混ぜて、-20℃の冷凍庫からショ糖ベースの酸素ACSFを取るペトリ皿とビブラトームバッファトレイを記入し、カルボゲンで両方酸素化を開始。慎重にスプーンで瓶からヒト組織の一部を取り出し、ペトリ皿（ 図2D）に入れて。 鉗子を使用して、慎重にスライスする時の抵抗を避けるために、血液凝固、血管や髄膜を除去します。皮質表面を傷つけないよう注意を払って、組織ブロックの側面から開始し、PIA-問題で成る、髄膜を除去します。ブレードを用いて、ビブラトーム試料プレート上に接着される、平坦な表面を得るために、組織の側面を切断する。注：髄膜は、PIA-問題で成る、皮質表面を傷つけないよう注意を払って、組織ブロックの側面から始まる削除されます。 TIのブロックの場合ssueは、MEA室よりも大きい、試料プレート（ 図2E）上に接着する前に、適切な寸法の部分をカット。 横皮質スライスを得るために、組織を接着バッファトレイに入れ、低速（0.1ミリメートル/秒）（ 図2F）で厚さ400μmのスライスを切った。 スライス寸法のレンズ組織片をカット。へらやブラシで、これらのレンズの組織上のスライスを転送し、録音します（ 図2G – I）を開始する前に、少なくとも1時間、37℃でインターフェース室でそれらをインキュベートする。継続的に使用するまで同じ条件でスライスを格納します。 NOTE：レンズペーパー上のスライスを配置すると、スライスの下側の灌流及び記録前インターフェース室からスライスの除去の両方を容易にするために重要なステップである。 レンズ組織上のスライスを転送しながら、非常に慎重にそれらを管理する、と皮質層領域に触れることを避けブラシ。 スライスを一つずつ用意し、直ちに適切な酸素供給及び温度を確保するために、インターフェース室にそれらのそれぞれの転送。可能な限り迅速に切除した組織のブロックをスライスする。 録音用のMEAのセットアップ6.準備コンピュータへの蠕動ポンプと、MEAシステムに灌流システムを接続します。記録ACSFに酸素を。アンプ内部の空のMEAチップを置きます。 MEA室中で37℃に達する5-6 ml /分で灌流を開始するために加熱カニューレ要素のための温度コントローラを設定する。注：これは、室温及び流量に応じて、所望のものよりも3~4°Cより高い温度に設定することが通常必要である。 電極面積に触れることなく、中心に最も近い可能性、それを置くこと、細かい温度計をMEAチャンバー内の温度を確認してください。 softwarの記録を開始eとは、全てのMEA電極が十分に接続されていることを確認し、潅流に起因するノイズが存在しないこと。 カメラテーブルの機能をチェックするためにMEA_Monitorを起動します。 記録のためのMEAチップへのインターフェース室からスライス7.譲渡一部はガラスシャーレにACSFを記録温め注ぐ。鉗子で、水晶体組織を介してつかむことにより、インターフェース室からスライスを取り、ペトリ皿に入れる。慎重に組織からのスライスを切り離す。インターフェースチャンバー内の溶液のレベルは注意深くインキュベーション時間中に調整された場合、スライスは、溶液中に浸すことにより、水晶体組織から離脱する。それ以外の場合は、剥離を容易にするために、小さなブラシを使用しています。 いくつかのACSFで、MEAチップを記入し、スパチュラで、そこにスライスを移す。プラスチック製パスツールピペットを用いて、そっとスライスは電極面積に付着させると白金ANCHで適所にそれを維持する溶液を除去または。 、記録ACSFの1ミリリットルを追加し、アンプへのMEAチップを配置5-6 ml /分で灌流を開始します（ 図2J – L）。 MEA_Monitorを使用することにより、MEA記録領域上のスライス位置を確認し、必要であれば、皮質層から記録し、写真を撮るために、それを調整します。録音を開始します。