متعدد القطب تسجيلات صفيف من داء الصرع بعد الجراحة القشرية الأنسجة البشرية
Summary
نحن هنا تصف كيفية إجراء التسجيلات مجموعة متعدد القطب الأنسجة القشرية صرع الإنسان. وأظهرت استئصال الأنسجة الصرع، إعداد شريحة ومجموعة متعدد القطب تسجيلات لأحداث النشبات ونشبي بالتفصيل.
Abstract
الصرع، مما يؤثر على حوالي 1٪ من السكان، وتضم مجموعة من الاضطرابات العصبية التي تتميز بحدوث نوبات من الدوري، والتي تعرقل وظيفة المخ المعتادة. على الرغم من العلاج بالأدوية المضادة للصرع المتوفرة حاليا تستهدف الوظائف العصبية، وثلث المرضى الذين يعانون من الصرع pharmacoresistant. في هذه الحالة، استئصال الجراحي للمنطقة الدماغ توليد النوبات يبقى العلاج البديل الوحيد. ساهم دراسة الأنسجة صرع الإنسان لفهم الآليات المولدة للصرع جديدة خلال السنوات ال 10 الماضية. في الواقع، هذه الأنسجة ينتج الصرع النشبات التصريف عفوية وكذلك الأحداث نشبي التي يسببها دواء التي يمكن تسجيلها مع تقنيات الكهربية الكلاسيكية. بشكل ملحوظ، صفائف متعدد القطب (الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف)، والتي هي أجهزة microfabricated تضمين مجموعة من الميكروية ترتيب مكانيا، توفر فرصة فريدة لتحفيز في وقت واحد وتسجيل بوتيه الحقلntials، فضلا عن إمكانات العمل من الخلايا العصبية متعددة من مناطق مختلفة من الأنسجة. هكذا الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف التسجيلات توفر نهجا ممتازا لدراسة الأنماط المكانية والزمانية لالنشبات عفوية وأحداث تشبه أثار استيلاء ومصادرة الآليات الكامنة وراء ظهور والانتشار. نحن هنا تصف كيفية تحضير شرائح القشرية الإنسان من الأنسجة مقطوعة جراحيا وتسجيل مع الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف النشبات وتشبه نشبي أحداث خارج الحي.
Introduction
الصرع هو اضطراب مزمن في ونوبات الصرع، والتي هي منقوشة التصريف متقطعة استمرت عدة ثوان لعشرات ثانية على الكهربي (EEG) التسجيلات المرتبطة المظاهر السريرية، يقطع دولة النشبات، والتي تتميز بوجود التصريف العصبية المتزامنة عشرات الالف دائم ودعا أحداث النشبات 1. أنه يؤثر على السكان حوالي 1٪ العالم، وعلى الرغم من أن يتم التحكم في نوبات لغالبية المرضى، ما يقرب من ثلث المصابين بالصرع لا تظهر استجابة كافية للأدوية المضادة للصرع 2. في هذه الحالة، يسمى الصرع pharmacoresistant والآليات التي لا يزال يتعين تحديدها بوضوح، والاستئصال الجراحي لجزء محدد من الدماغ يدعى منطقة للمصادرة يصيب يبقى العلاج البديل الوحيد إعطاء نتائج إيجابية للمرضى. وبالتالي، فإن العينات مقطوعة من جراحة تسفر عن opportunity لدراسة آليات التصريف النشبات وتوليد الحجز ونشر، وكذلك pharmacoresistance على النسيج العصبي المركزي البشرية قابلة للحياة خارج الحي.
متعدد القطب صفائف (الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف)، تتكون من ترتيب الميكروية موزعة مكانيا، والسماح التحفيز في وقت واحد وتسجيل النشاط الكهربية من عدة مواقع من الأنسجة، مما يوفر طريقة ممتازة لدراسة الأنماط المكانية والزمانية من النشاط العفوي ومنبهات المسموعة . هذه التقنية، أول تطبيق لرصد التغيرات التنموية للنشاط زراعة الخلايا العصبية 3 ثم تكييفها لالدماغ الحاد وعضوي النمط وشرائح الحبل الشوكي 6 – 4، وتعتبر في الوقت الحاضر أداة الكهربية قيمة.
يصف البروتوكول الحالي كيفية تحضير شرائح القشرية الإنسان من الأنسجة مقطوعة جراحيا وتسجيل مع الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف السادس موثوق السابقفو النشبات وأحداث تشبه مصادرة من هذه الشرائح. وبالتالي هذا الأسلوب يوفر وسيلة لمعالجة الآليات الأساسية الكامنة وراء الصرع بدء الأنشطة، ونشر آثار العقاقير المضادة للصرع على المستويين الخلوي والشبكة. ويتم هنا وصف كافة الإجراءات المتبعة للحصول على وإعداد وصيانة وتسجيل شرائح الإنسان في التفاصيل.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pharmacoresistant الصرع هو حالة نادرة، والتي يمكن استكشافها في الأنسجة البشرية في المختبر. وهذا يسمح بدراسة القشرة الإنسان الصرع، والذي يعرض العيوب المحددة التي استنسخت جزئيا فقط في النماذج الحيوانية. طريقة وصفها هنا يسمح بإعداد وتسجيل الأنسجة البشرية ما بعد الجراحة المجراة سابقا مع الحفاظ على سلامة والشبكات بحيث تنتج بشكل عفوي الصرع الأنشطة الخلوية. الاحتفاظ بأنشطة مماثلة من تلك المسجلة في الجسم الحي لا بد من دراسة آليات نشأة الأنشطة المرضية. وعلاوة على ذلك، تسمح هذه الطرق استكشاف الأنسجة البشرية والحيوانية تجنب نماذج مثالية غير المرض. ومع ذلك، ودراسة الأنسجة البشرية يتطلب التزامن بين جراحي الأعصاب والمختبر التجريبي. يتطلب نقل الأنسجة الرعاية الخاصة لا تكون مؤلمة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن كلا من كمية العينات والأنسجة محدودة. أخيرا، والوصول إلى الأنسجة الرقابة السليمة هي ماين القلق. مع هذا المستحضر، الأنسجة بعد العملية تنتج بشكل عفوي التصريف مثل النشبات في العادي ACSF 7،8. كما يمكن استخلاصها أحداث شبيهة نشبي في تعديلها، ACSF proconvulsive بحيث يمكن التحقيق في آليات بدء الحجز والانتقال من دولة إلى النشبات المضبوطات.
الأنسجة البشرية يمكن أن تظل قابلة للحياة لمدة تصل إلى 10 ساعة في ظروف واجهة. واعتبرت شرائح قابلة للحياة عندما لوحظ نشاط أو مجال وحدة متعددة الإمكانات بشكل عفوي وعندما أثار هذه الأنشطة عن طريق زيادة استثارة من خلال زيادة البوتاسيوم خارج الخلية و / أو نقص المغنيسيوم. على الرغم من التقلبات في النشاط ويحدث، من المرجح أن تعكس الاختلافات في الأمراض والمناطق القشرية، اكتشفنا خصائص المولدة للصرع من الأنسجة فقط في شرائح صحية تظهر عفوية وأثار النشبات التصريف نشبي. من أجل الحفاظ على حيوية الأنسجة والنشاط، يتم استخدام واجهة غرفة لتخزين ركان شرائح في 36-37 درجة مئوية لمدة التعافي قبل التسجيل مع نظام MEA. في الواقع، العديد من الجماعات قد أظهرت بوضوح مزايا نظام التخزين القائمة على واجهة مقابل تخزين دورق قياسي وأهمية درجة الحرارة للحفاظ على نشاط الشبكة مثل عفوية حادة موجة التموجات أو الذبذبات التي يسببها الكوليني 9،10. تخزين واجهة من شرائح تم استخدامها سابقا لتسجيل النشاط الصرع من قرن آمون البشري وشرائح مرفدي 1،11. مع تقنية MEA الحالية، بعد فترة النقاهة تشريح في ظروف من واجهة، يتم تسجيل نشاط الشبكة في ظروف المغمورة، في حضور ارتفاع معدل التدفق (5-6 مل / دقيقة) عند 37 درجة مئوية، مع نظام MEA. انخفاض قطرها (1.8 سم) من رقاقة MEA، ما يخفف من حجم غرفة صغيرة (<1.5 مل)، مع زيادة معدل التدفق، ويعزز امدادات الاوكسجين للشريحة التي ثبت أن تكون عاملا حاسما لعفوية وفاrmacologically الناجم عن أنشطة الشبكة 9،10. وعلاوة على ذلك، فإن المبلغ المخفض تعميم ACSF يسهل الاختبار الدوائي.
إجراء تشريح هو إلا وصدمة للأنسجة 12. ويبدو أن كلا العمارة العصبية وكلوريد التوازن أن مضطرب على سطح الأنسجة (50 ميكرون). أصل الأنشطة التي سجلتها رقائق MEA، الذي عينة الأنسجة في معظمها سطحية دون اختراق عميق، قد تنشأ من المناطق المصابة. ومع ذلك، تظهر بياناتنا أن إمكانات حقل خارج الخلية المكتشفة محليا يتم تسجيلها في معظم أقطاب الشرق الأوسط وأفريقيا وإظهار الأعمال السابقة التي تتكامل أنهم على مسافة من 100 الى 200 ميكرون من موقع تسجيل 13، مما يشير إلى أن المضبوطات المسجلة في إعداد دينا من غير المرجح أن يكون التي تنتجها المناطق المصابة. وعلاوة على ذلك، في الدراسات التي أجريت مع أقطاب التنغستن تمكين اختراق عميق، والأنشطة الصرع المسجلة في الأنسجة البشرية متشابهةلتلك التي لوحظت في مرضى الصرع 1،7،8.
حد آخر من خارج الحي تسجيل الأنسجة هو تعطيل الاتصالات بين مناطق الدماغ المختلفة، وبالتالي تقييد neuromodulations ديناميكية. هذا قد يفسر لماذا في مثل هذه الأنسجة يتم تسجيلها بشكل عفوي أي حال من تشبه نشبي، ولكن يتطلب أن يكون سببها التلاعب الأيونية أو الدوائية تحفيز تعزيز استثارة. وفقا لذلك، في هذا البروتوكول، وبفعل أحداث مثل الاستيلاء من خلال الجمع بين التغير في K + خارج الخلية من 3 إلى 6 ملم والحد من المغنيسيوم 2+ الخارجي من 1.3 ملم إلى المغنيسيوم 2+ خالية ACSF، من أجل زيادة استثارة الأنسجة وإزالة المغنيسيوم 2+ NMDA معتمد على كتلة المستقبلة. في الواقع، قد سبق تبين أن نشاط صرعي يتسبب في شرائح القشرة المخية الحديثة وقرن آمون الإنسان باستخدام المغنيسيوم 2+ خالية ACSF يشبه المضبوطات electrographic المسجلة في الجسم الحي 14. الى جانب ذلك،وقد تبين أن عمليات التصريف صرعي حصلت في شرائح الفص الصدغي تصبح مقاومة للمضادات المستخدمة سريريا بعد التعرض لفترات طويلة للالمغنيسيوم 2+ خالية ACSF 15،16، وبالتالي تقديم نموذج للتحقيق في أحداث pharmacoresistant مثل الاستيلاء في المختبر.
الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف تتيح تسجيل على حد سواء، امكانات الحقل وأنشطة متعددة الوحدات التي تتكون في الخلايا العصبية إمكانات العمل خارج الحي. وبالتالي، الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف هي أداة قوية الكهربية مقابل رسم المخ، مما استكشاف امكانات الحقل الناتجة عن أنشطة وقت واحد من الفرق العصبية في الجسم الحي، ولكن لا تعطي الوصول إلى الخلايا العصبية واحدة السلوكيات 17. على الرغم من أن أكثر الميكروية الأخيرة يمكن تسجيل أنشطة متعددة الوحدات التي تتكون في الجسم الحي في إمكانات العمل العصبية، فهي الغازية، بحيث يقتصر استخدامها في الغالب لغرض الأبحاث خلال التسجيلات داخل الجمجمة. على وجه الخصوص، والتسجيلات الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف تمثل الأسلوب المفضللدراسة الأنماط المكانية والزمانية لأحداث الصرع، وآليات الضبط والسيطرة على بداية انتشار والعمل من العقاقير المضادة للصرع الكلاسيكية والجديدة. بشكل ملحوظ، لكشف أنواع الخلايا وأساس إشارات من التصريفات الصرع، ارتفاع تقنيات الفرز ويجب الجمع بين التجارب الدوائية مع تقنيات الشرق الأوسط وأفريقيا. على الرغم من الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف يمكن أن تعطي الوصول إلى طفرات فردية، فإنها لا توفر معلومات حول الخصائص الفيزيائية الحيوية ومتشابك. في المستقبل، يجب أن يقترن تقنيات أخرى لتسجيلات الشرق الأوسط وأفريقيا من أجل تحسين السلوك الخلوي عينة، وأنشطة الشبكة وإشارات متشابك. على سبيل المثال، والتصوير مضان لكشف الخلايا العصبية أو سلوك الخلايا الدبقية، وكذلك ديناميات أيون، يمكن الجمع بين الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف التسجيلات. يمكن للمزيد من التحليل اللاحق النسيجي تكشف أيضا عن تغييرات محددة من أنواع الخلايا والبروتينات أو مستقبلات بحيث يمكن ربط موقع الصرع مع إعادة ترتيب الأنشطة المحددة للهيكل العصبي. ويمكن أيضا أن تكون جزءا لا يتجزأ نظام الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف في التصحيح، المشبك انشاء لربط الخلايا واحد أو المواصلة مع الأنشطة السكانية. في المستقبل، ويمكن أيضا أن تستخدم أدوات optogenetic، شريطة أن شرائح الإنسان يمكن تربيتها في المدى الطويل، كما أجريت لشرائح عضوي النمط، بحيث ترنسفكأيشن أو العدوى من أنواع معينة من الخلايا لا يمكن أن يؤديها.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من وكالة الاستخبارات الوطنية (بلان برنامج العلوم العصبية)، FRC (الاتحاد من أجل لا بحوث SUR LE Cerveau)، مدينة باريس (ظهور البرنامج)، INSERM ومستشفى لا بيتييه Salpêtrière (عقد الأبحاث المترجمة) إلى NR، من Neuropôle دي بحوث Francilien ([نرف]) إلى الضعف الجنسي، من جامعة بيير وماري كوري UPMC (التقارب برنامج) ومن معهد دو Cerveau آخرون البريد لا Moelle epiniere (باريس) إلى GH
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Brain Slice Chamber-2: Interface | AutoMate Scientific, Inc. | S-BSC2 | It requires separate temperature controller |
| 2-channel Temperature Controller | Multichannel Systems, Germany | TC02 | It allows to plug in and use 2 interface chambers. |
| Special cable for connection of TC01 to S-BSC2 with external reference PT100 | Multichannel Systems, Germany | CA3 | The reference PT100 is placed near the slices |
| 6pin plug-connector with PT100 | Multichannel Systems, Germany | TS-PT100 | External reference for CA3 cable |
| MEA workstation for recording data from 120-electrode MEAs | Multichannel Systems, Germany | MEA2100-120 | It includes MEA2100-120 headstage and MEA2100 interface board. www.multichannelsystems.com |
| Microelectrode array for MEA2100-120 | Multichannel Systems, Germany | 120MEA200/30 | Electrode spacing: 200 µm; electrode diameter: 30 µm; glass ring: 6 mm high. Different configurations (spacing, diameter, ring) possible. |
| Video Microscope Table | Multichannel Systems, Germany | MEA-VMT-1 | Table with a video microscope underneath to image the electrode field of the MEAs in an amplifier placed on top of the table and transfer the image to a computer. |
| Perfusion cannula | Multichannel Systems, Germany | PH01 | Heatable perfusion cannula with temperature sensor; temperature can be programmed with TC02 controller |
| MC_Rack | Multichannel Systems, Germany | Software for data acquisition and recordings | |
| Magnetic Perfusion Holder | Multichannel Systems, Germany | MPH | Magnetic perfusion holder for PH01 element to fix the perfusion cannula and connect the perfusion system to the amplifier's ground |
| Neuroexplorer | Nex Technologies | Software for data analysis; info@neuroexplorer.com | |
| Peristaltic pump (drive unit) | Gilson | F155001 | 0,01 to 48 rp |
| Peristaltic pump (pump head) | Gilson | F117800 | R2 two channel |
| Ultrasonic aspirator | Integra Life sciences, USA | Cusa Excel + | It allows blunt subpial dissection of the cortex |
| Neuronavigation | Isis Solutions, France | Surgiscope | It allows real time identification of the brain structure on the preoperative MRI |
| Vibratome HM 650 V | Microm | Block slicing into 400 μm thick slices |
Riferimenti
- Huberfeld, G., et al. Glutamatergic pre-ictal discharges emerge at the transition to seizure in human epilepsy. Nature Neuroscience. 14 (5), 627-634 (2011).
- Kwan, P., Brodie, M. J. Early identification of refractory epilepsy. New England Journal of Medicine. 342 (5), 314-319 (2000).
- Van Pelt, J., Corner, M. A., Wolters, P. S., Rutten, W. L. C., Ramakers, G. J. A. Longterm stability and developmental changes in spontaneous network burst firing patterns in dissociated rat cerebral cortex cell cultures on multielectrode arrays. Neuroscience Letters. 361 (1-3), 86-89 (2004).
- Sun, J. -. J., Luhmann, H. J. Spatio-temporal dynamics of oscillatory network activity in the neonatal mouse cerebral cortex: Network oscillations in neonatal cerebral cortex. European Journal of Neuroscience. 26 (7), 1995-2004 (2007).
- Dossi, E., et al. Functional Regeneration of the ex-vivo Reconstructed Mesocorticolimbic Dopaminergic System. Cerebral cortex. 23 (12), 2905-2922 (1991).
- Darbon, P., Scicluna, L., Tscherter, A., Streit, J. Mechanisms controlling bursting activity induced by disinhibition in spinal cord networks. The European journal of neuroscience. 15 (4), 671-683 (2002).
- Cohen, I., et al. On the Origin of Interictal Activity in Human Temporal Lobe Epilepsy in Vitro. Science. 298 (5597), 1418-1421 (1126).
- Huberfeld, G., et al. Perturbed chloride homeostasis and GABAergic signaling in human temporal lobe epilepsy. The Journal of neuroscience. 27 (37), 9866-9873 (2007).
- Maier, N., Morris, G., Johenning, F. W., Schmitz, D. An Approach for Reliably Investigating Hippocampal Sharp Wave-Ripples In Vitro. PLoS ONE. 4 (9), (2009).
- Hájos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. European Journal of Neuroscience. 29 (2), 319-327 (2009).
- Wittner, L., et al. The epileptic human hippocampal cornu ammonis 2 region generates spontaneous interictal-like activity in vitro. Brain. 132 (11), 3032-3046 (2009).
- Dzhala, V., Valeeva, G., Glykys, J., Khazipov, R., Staley, K. Traumatic alterations in GABA signaling disrupt hippocampal network activity in the developing brain. The Journal of neuroscience. 32 (12), 4017-4031 (2012).
- Menendezdela de la Prida, L., Huberfeld, G., Cohen, I., Miles, R. Threshold Behavior in the Initiation of Hippocampal Population Bursts. Neuron. 49 (1), 131-142 (2006).
- Avoli, M., Drapeau, C., Louvel, J., Pumain, R., Olivier, A., Villemure, J. -. G. Epileptiform activity induced by low extracellular magnesium in the human cortex maintained in vitro. Annals of neurology. 30 (4), 589-596 (1991).
- Heinemann, U., Dreier, J., Leschinger, A., Stabel, J., Draguhn, A., Zhang, C. Effects of anticonvulsant drugs on hippocampal neurons. Hippocampus. 4 (3), 291-296 (1994).
- Li Zhang, C., Dreier, J. P., Heinemann, U. Paroxysmal epileptiform discharges in temporal lobe slices after prolonged exposure to low magnesium are resistant to clinically used anticonvulsants. Epilepsy research. 20 (2), 105-111 (1995).
- Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents – EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature Reviews Neuroscience. 13 (6), 407-420 (2012).
