JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Экс естественных Культура Drosophila куколки яичка и одного мужчины зародышевой линии кисты: Вскрытие, Imaging, и фармакологическому лечению

Published: September 11, 2014
doi:
10.3791/51868
, , ,
1Fachbereich Biologie, Entwicklungsbiologie,Philipps-Universität Marburg, 2Institut für Molekularbiologie und Tumorforschung,Philipps-Universität Marburg

Summary

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

Abstract

Во время сперматогенеза у млекопитающих и в дрозофилы, мужские половые клетки развиваются в серии основных процессов развития. Это включает в себя дифференциацию от популяции стволовых клеток, митотический усиления и мейоза. Кроме того, после мейоза половых клеток пройти драматический морфологический процесс изменения формы, а также глобальный эпигенетическую реконфигурации хроматина-переключателя зародышевой линии гистона-к-протамин.

Изучение роли белка в пост-мейоза сперматогенеза, используя мутагенеза или другие генетические инструменты зачастую препятствуют существенному эмбриональные, предварительно мейотическое, или мейоза функций белка под следствием. После мейоза фенотип мутанта такого белка может быть не видны через более ранней блока развития, или интерпретация фенотипа может быть сложным. Модель организм дрозофилы предлагает байпас этой проблемы: неповрежденные яички идаже кисты половых клеток расчлененный с раннего куколок в состоянии развить экс естественных в культуральной среде. Используя таких культур позволяет микроскопических изображений живых половых клеток в яичках и зародышевой линии кист. Важно отметить, что культивируемые яички и половые клетки также становятся доступными для фармакологических ингибиторов, позволяя тем самым манипулирование ферментативных функций во время сперматогенеза, в том числе пост-мейотических стадиях.

Протокол, представленные описывает, как препарировать и культивировать куколки яички и зародышевой линии кисты. Информация о развитии куколки яичек и условий культивирования предоставляются наряду изображений микроскоп данным живых яичек и зародышевой линии кист в культуре. Мы также описания фармакологической анализа для изучения пост-мейотическому сперматогенез, примером чего анализе таргетирования переключатель гистона-к-протамин помощью гистонов ацетилтрансферазы ингибитор anacardic кислоту. В принципе, этот способ культивирования могут быть адаптированы для решения многих летчие вопросы исследования в пред-и пост-мейоза сперматогенеза.

Introduction

Развитие мужских половых клеток многих видов это последовательный процесс. Он характеризуется рядом важнейших событий, кульминацией в формировании морфологически и эпигенетически узкоспециализированных сперматозоидов. В дрозофилы, зародышевой линии стволовых клеток на кончике яичка делятся асимметрично, чтобы дать начало новому стволовой клетки и сперматогоний, т.е., дочерняя клетка, которая стремится к дифференциации (смотри рисунок 1 для обзора) 1,2 . Сперматогоний подвергается четыре раунда митотических делений и, с наступлением мейоза, фаза впечатляющий рост и транскрипционной активности называется этап сперматоцит. Клетки, происходящие от одного сперматогоний остаются соединенными друг с другом и развиваться как синхронизированного пучка, обернутой двумя соматических клеток-структуры называют кисты. После завершения мейоза, морфология из мужских половых клеток полностьюпреобразован (схематично показано на фиг.1). Изначально, круглые сперматид удлиненные сформировать структуру гидродинамического головы, и жгутик развивается. В конце концов, клетки спермы отделены друг от друга с помощью сложной, связанных с апоптозом механизма, называемого индивидуализации 3 – 5.

У многих видов, в том числе дрозофилы и млекопитающих, морфологические изменения в половых клетках сопровождаются замечательной эпигенетической перестройкой гаплоидного мужского хроматина зародышевой линии, называется переключатель гистона-к-протамин (HP переключатель) 6 – 9. Возможно, почти все канонические гистонов и многие молекулы гистона-вариант удаляются из ДНК и заменяются небольшими основных белков, в протамины, в результате исключительно компактным nucleoprotamine структуры, характерные для хроматина зрелого сперматозоида. Общая характеристика переключателя HP являются тон замена канонических гистонов сначала вариантов гистонов, то переходными белков, и, наконец, по протамины. Все это сопровождается некоторыми изменениями к эпигенетических марок, таких как всплеску уровня ацетилирования гистона Н4 только до удаления гистонов 7,10 – 12.

Большинство, если не все, из вышеупомянутых процессов необходимы для развития зрелой, полностью плодородной спермы. Это верно не только у дрозофилы, но и в организме человека, как млекопитающих акций сперматогенеза значительное количество сходства с беспозвоночными системы 1,8,9. Изучение развития мужских половых клеток значительно облегчается в модельной системе Drosophila. Мухи генетически очень доступна. Поколение мутантов, а также создание штаммов лету выражая генов синтеза или РНК-интерференции конструкций занимает немного усилий. Тем не менее, в исследовании после мейоза сперматогенеза, использование мутантовд простые генетические инструменты могли дойти до предела. В Drosophila сперматогенеза, транскрипция прекращается почти полностью с вступления в делений мейоза. Таким образом, после мейоза сперматогенез в основном базируется на поступательно репрессированных и хранящихся мРНК, синтезируемых в расширенном мейоза профазы 13 – 16. Поэтому, такие инструменты, как РНК-интерференции или использованием не-условных мутантов не подходят для исследования именно после мейоза роли генных продуктов, что также выполняют важные функции в развитии предварительно мейоза или мейоза половых клеток.

Одним из преимуществ Drosophila, которые могут быть использованы в таких случаях является способность рассеченных интактных яичек и даже кист зародышевых клеток в разработке экс виво в культуральной среде, 4,12,17 – 20. Рассечение и выращивание семенников или зародышевой линии кист позволяет не только микроскопические наблюдения развития зародышевых клеток в живых клетках, ноРБП использование фармакологических анализов с, например, ингибиторы ферментных комплексов, таких как гистонов ацетилтрансферазы (головные уборы), гистондезацетилаз (HDACs), топоизомераз или протеасоме. Таким образом, можно манипулировать ферментативные функции во время пост-мейоза сперматогенеза и для отслеживания результатов развития независимо от эмбриональных, предварительно мейотических, или мейоза функций 4,12.

В фармакологических анализов, мы ранее проанализировали ацетилирования зависит от локализации белка bromodomain во мейоза профазы, а также актуальность уровней ацетилирования гистонов для эпигенетической переключателя HP в пост-мейоза сперматогенеза, используя специфические ингибиторы, направленных шляпы и HDACs 12,21. Ориентация переключатель HP в этих анализах стало возможным с помощью лету штамм, который выражает слитых генов histone2AvD-RFP и protamineB-EGFP 12,22 в эндогенных моделей, и наблюдение, чтопервые сперматид в куколки яичек пройти через коммутатор HP между 24 и 48 ч НПФ 12.

Протокол, представленные описывает рассечение яичек и кисты из Drosophila куколок, условий культивирования, и фармакологического анализа с неповрежденными куколки яичек. Для этого, куколок яички на уровне около 24 ч после образования пупария (НПФ) расчленены (см рис 1 и 2). В это время, яички не сделали соединения с другими тканями и окружены только тонкой внешней оболочкой, которая позволяет лучшее проникновение ингибитором соединений 23,24. Яички bean- или грушевидные органы, которые могут быть легко приняты во культуры. Эти яички расчленены, культивируют и обрабатывают специфических ингибиторов. Впоследствии, эффекты ингибиторов контролируются с помощью иммунофлюоресценции анализа и флуоресцентной микроскопии экспрессии слитого белка, и путем сравнения ядерного морфолинлогия обработанных зародышевых клеток в том, что необработанных зародышевых клеток. Условия, представленные в этом протоколе также позволяют живого изображения разработки яички и зародышевой линии кисты в культуре.

Protocol

Этика заявление: Экспериментальные методики, описанные в данном протоколе включают исключительно работать с дрозофилы и не подлежат законов по защите животных в Германии. 1 Подготовка СМИ, инструменты и мух Подготовьте модифицированный коммерчески доступный пудру питательную среду M3 без бикарбоната калия 17. ВНИМАНИЕ: Раздражает глаза и кожу. Дополнение среду с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 100 Е / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина. Используйте инактивированной нагреванием и насекомых-культуры проверенные эмбриональной бычьей сыворотки для достижения наилучших результатов. Фильтр полную среду (далее именуемых среды) через блок бутылей фильтра 0,2 мкм и хранить в виде аликвот при -20 ° C. Перед использованием фильтр (наконечник шприца 0,2 мкм фильтр) среда снова, чтобы удалить осадок. Подготовьте ингибитор растворы для фармакологических анализов. Dissolве этих химических веществ в соответствующем растворителе и хранить в аликвоты. Например, подготовить исходный раствор 28,69 мМ anacardic кислоты (ВНИМАНИЕ: Раздражает глаза и кожу) в диметилсульфоксиде. Подготовьте инструменты для разрушения расчлененный куколки яичек и рассечения одиночных кист. Используйте два острых и жестких игл, а не пару щипцов. Капиллярная сила, которая возникает между двумя рукавами парой щипцов делает вскрытие отдельных кист в небольших количествах среде очень сложно. Например, используйте конец нержавеющей стали насекомых штифта, вставленного в держатель прививка петли. Для того чтобы получить соответствующим образом в возрасте куколок, семена около 10 крупных культуры флаконы (трубки с диаметром 4 см) с достаточным количеством взрослых мух (около 40-60 мухи). Для анализа переключатель HP, использовать мух, выражающие H2AvD-RFP и ProtamineB-EGFP в их эндогенного рисунком 12,16,22. Выдержите флаконов в стандартных условиях при 25; ° С в течение примерно 4-5 дней до третьей возрастной стадии личинки ползти вверх и начать окукливание на стенах флаконах 25. 2 Маркировка или Сбор белого устанавливается куколки загрузить 24-ч-старый Куколки для вскрытия Чтобы проверить влияние некоторых химических веществ на коммутаторе HP, препарировать куколки яички в ок 24 час НПФ 12. Для получения постановке куколок, принять подготовленные муха культуры флаконы с окукливаются личинки (см раздел 1.4) и определить, как много белого предварительный куколки, как это возможно. Предварительно куколки во время самого первого шага в окукливания появляются как неподвижного, не-кормления, а укороченным личинок с вывернутых дыхальцами и белого цвета пупария. Пупария становится желто-коричневый в 30 до 60 минут, что свидетельствует очередной этап развития куколки 26. Отметьте позиции предварительной куколок с постоянным маркером на внешней поверхности пузырьков. Инкубируйте пробирки при 25 ° С в течение приблизительно 24 часов. С другой стороны,выбрать пре-куколки со стороны флаконов с небольшой кистью, смоченной в PBS буфере. Затем передать пре-куколки в сторону свежий 50 мл реакционной трубы и инкубируют при 25 ° С в течение приблизительно 24 часов. 3 Рассечение куколки яичек в ок 24 часа после Пупарий формирования Распределите несколько капель (около 80 мкл каждая) среды на 10 см культуры пластик клеток или чашки Петри. Используя широкий пару щипцов или кистью, смоченной среде, выбрать куколки в 24 час этапе НПФ от инкубируемой флаконах (раздел 2). Трансфер один куколки в каждую каплю среды на блюдо. Для вскрытия, использовать стерео-микроскопа, снабженного волоконно-оптический осветитель. Не нагревайте выше РТ яички во время вскрытия, так как это может мешать нормальному развитию в культуре. Проанализируйте куколки с двумя парами № 5 щипцов. С одной парой, захватить куколки на ее большей заднейчасть (задние дыхальца) и удерживайте его в этом положении. Захватите передние дыхальца с другой парой щипцов и открыть куколки крышечку на ее переднем конце. Слезьте куколки дело до по крайней мере часть грудной клетки не подвергается. Продолжайте удерживать куколки в положении его наиболее заднему концу. Чтобы освободить внутреннее давление куколки, вставить обе руки из парой щипцов в области головы куколки. Рип куколки открытый открыв щипцы и перемещение щипцы в передней направлении. Убедитесь, что открытие генерируется с этого движения как можно больше в первой попытке. Избегайте повреждения куколку на ее заднем конце перед давление был освобожден, так как это может привести к яички толкают непосредственно через небольшое отверстие и чаще всего в настоящее время нарушен. Заметим, что, как только куколки открыт, выпущенный внутреннее давление в куколку выдавливает агломераты жировых клеток и тканей организма через LAОткрытие RGE в области головы. Проверьте куколочные яички уже вытеснены из куколки с этим материалом; это происходит в некоторых случаях. Яички не подключены к любой другой ткани на 24 ч НПФ и, следовательно, может быть легко исключен из куколки 23. Не следует помещать куколки с пинцетом, так как это может привести к повреждению яички, если они остаются в куколки. Увеличение размера отверстия с использованием одной пары щипцов. Затем, удерживая куколку на ее наиболее заднему концу. Закройте другую пару щипцов и аккуратно подряд выход содержимого куколки от задней к передней выпустить яички из куколки. Соберите яички, потянув их в предварительно вырезать кончиком пипетки 200 мкл. Попробуйте передать только очень небольшое количество среды, чтобы уменьшить количество жировых клеток тела, переданных с яичками. Поместите яички в среду в свежем блюдо культуры. Промыть яичек несколько раз среды пока только немногие жира тела клеткис оставаться. Для живого изображения, передать яички к стеклянным дном блюдо культуры со средой и использовать инвертированный микроскоп изображений. Для фармакологических анализов, перейдите к шагу 5. 4 Рассечение Мужской кисты зародышевой линии и живых изображений Трансфер один или больше куколки яичка к стеклянным дном блюдо культуры. Используйте стерео-микроскоп с волоконно-оптической подсветкой и двумя из нержавеющей стали иглы (см раздел 1.3) для рассечения мужчин кисты зародышевой линии. С одной иглы, тщательно пытаются придавить один яичка на ее передней или задней конца. Держите его в этом положении. Вставьте другой иглу в яичках и нарушить яичка оболочку, перемещая иглу боком. Многие из кист выйдет из яичка этим движением. Продолжайте удерживать яичка в положении с одной иглой. Аккуратно серия из оставшихся кист из яичка с другой иглы. Отдельные агрегированные кисты либо джентльменалы перемещения иглы в сторону через кластера кист или путем перечисления кисты в свежую культуральную чашку со средой с помощью пипетки 200 мкл. Перемещение культуры блюдо с инвертированным микроскопом изображений для живого изображения единичных кист. Дисперсные кисты снова с иглой в случае необходимости. Определите стадию цисты с помощью фазового контраста и флуоресцентной микроскопии. Сосредоточьтесь на кисты желаемого этапе. Подтверждение фокус и положение кисты часто в течение более длительных экспериментов визуализации, как цисты не прилипают к нижней части чашки для культивирования и, следовательно, имеют тенденцию плавать в фокусе. ПРИМЕЧАНИЕ: Покрытие блюдо с поли-L-лизина для иммобилизации вредно для развития ранних кист зародышевой линии. Вместо этого, отдельные кисты могут быть выделены. С некоторой практики, можно выделить особую киста очень осторожно нажимая на него иглу. Это позволит передачу одиночных кист в отдельном культаURE блюда с бокалом пипетки Пастера с затяжной наконечника, который вставляется в поле зрения микроскопа. Выделенные кисты могут быть легко перемещены в культуральные чашки, даже после долговременного инкубации. 5 Фармакологическое Проба с малонарушенных куколки яичек Заполните каждую лунку для культивирования клеток пластины 24-луночный с 500 мкл среды в течение одного эксперимента 12 повторах. Передача одной куколки яичка в каждую лунку, используя заранее сократить пипетки 200 мкл. Проверьте на наличие протамины в изолированных яичек с помощью перевернутой флуоресцентного микроскопа. Яички должны быть свободны от сигнала ProtamineB-EGFP, что свидетельствует о том, что переключатель HP не произошло ни в одном из кисты. Заменить яички, что уже сегодня составляют ProtamineB-EGFP-положительные кисты. Для первых 12 скважин, добавьте 500 мкл среды, содержащей ингибитор разбавленный соединение (anacardic кислота), чтобы достичь желаемой конечной концентрации(150 мкМ) в 1 мл среды на лунку. Используйте оставшиеся лунки как необработанных контрольных; добавить 500 мкл среды с таким же количеством растворителя, используемого как с ингибитором соединений. Примечание: Если много различных соединений и растворители, было бы более эффективно использовать среду как единолично, контроля и проверки влияния повышения концентрации растворителей в отдельных экспериментах. Инкубируйте планшет при 25 ° С в течение 24 ч в темноте. Проверьте еще раз на наличие протаминов в инкубированных семенников, как описано выше. Теперь Контрольные яички должны показать один или несколько ProtamineB-EGFP-положительные кисты, что свидетельствует переход через коммутатор HP. С помощью пипетки с наконечником 200 мкл, передать яички в поли-L-лизин покрытием слайды, готовиться сквош и пятно с соответствующими флуоресцентными антителами, как описано в другом месте 12,27,28.

Representative Results

Яичка в Drosophila мужчин уже формируется у эмбриона и сохраняется в полости тела во время личиночной стадии. Третий возрастной стадии личинки показать маленькие, круглые яички, окруженные слоем будущих пигментных клеток и встроенные в жировой ткани тела (Рисунок 2A). Семенники у взрослых самцов мух длинные, спиральные трубки, на которые распространяется слоем мышечных клеток, происходящих из половых диска и красочному слою 24. Интересно, что личинки яички не содержат только клетки зародышевой линии предварительно мейотических и мейоза стадиях, пока на начальной стадии сперматоцитов, что соответствует мейоза профазе (смотри также рисунок 1) 23. Первые когорты из мужских половых клеток проходят через мейоза при формировании пупария. В ок 24 час НПФ, после мейоза ступени с удлиненной жгутиков уже разработали, и все ядра содержат гистонов H2AvD-RFP (рисунки 1 и 2В). Ни один из сперматидах не претерпели тПереключатель он л.с. как отсутствие сигнала ProtamineB-EGFP могут быть обнаружены с помощью флуоресцентной микроскопии (фиг.2С). Часто, яички рассеченные на этой стадии содержит самофлюоресцирующими структуру переменного размера, напоминающей агломерата жировых клеток организма или от одного до нескольких капель масла (фиг.2С, стрелка). Эта структура в яичках также видна с фазово-контрастной микроскопии. На сегодняшний день, мы не нашли никаких описание своей природе в литературе. Семенники расчлененный на 36 ч НПФ выглядят удлиненными и в некоторых случаях уже начинают виться (рисунок 2D). Они уже прикреплен к тканям половых путей растущей из половых имагинального диска 23,24. Кроме того, они часто содержат первые сперматид за пределы коммутатора HP, как указано в ProtamineB-EGFP сигнала (фиг.1 и 2D, стрелка). В 48 час НПФ, яички имеют дополнительно удлиненные и четко начать керлинг наБлижний конец. Несколько кисты зародышевой линии протамином-положительных ядер становятся видимыми (Рисунок 2E, стрелка). Когда яички расчлененный на 24 ч АПФ хранятся в культуре в течение 24 ч, они не удлиненные, как и в интактной лету (сравните рисунок 2D и 2E с фиг.6А '). Возможно, это связано с отсутствием позиционных и роста сигналов обычно отправленных из развивающихся половых путей, контактирующей яичка на ее заднем конце 23,29. Кроме того, мышцы слой яичка оболочки не развивается, потому зарождающиеся мышечные трубки не могут мигрировать из половых диска в яички 24. Яичко оболочка в этой ситуации исключительно тонкий слой пигмента-видимому, не растут достаточно в культуре в конверт все большее число развивающихся половых клеток в. Тем не менее, зародышевые клетки растут, делятся и дифференцируются независимо от яичка оболочкой. Следовательно, после более чем 36 часовг в культуре, ранние яички будут часто распахнулась, и дальнейшее развитие не наблюдается. Тем не менее, в течение более короткого периода времени, можно записать покадровой бывших естественных условиях живые образы целых яичек развивающихся в культуре, о чем свидетельствует фиг.3А -3 C (см также Дополнительного 1 видео). Куколки яичка, расчлененный на ок 45 час НПФ, инкубировали в среде в течение 6 часов и отображаемого каждые 5 мин. В этот период времени, несколько кисты сперматидах выйти из переключателя этапе HP и показать яркие сигнальные ProtamineB-EGFP (3А "-3 С, открытые стрелки). Как упоминалось выше, мужских половых клеток в семенниках Drosophila развиваться как синхронизированные пучков взаимосвязанных клеток, названных кисты 1. Фиг.4А показан общий вид кист рассеченных из куколки яичка около 24 ч АПФ. Предварительно мейотические этапы, Мейотические этапы, ранние после мейоза этапы, а также кисты на ранней стадии каноэ с удлиненными ядрами до переключения HP можно найти (рисунки 1 и 4B -4 E). Выделенные кисты очень хрупкие и нужно обращаться осторожно. Два соматические клетки, которые образуют оболочку кисты можно легко разрушается механически. Зародышевой линии стволовых клеток есть способность к выживанию и продолжать деления после генетической абляции соматических кисты клеток в естественных условиях 30. Сообщалось, что в пробирке, зародышевые клетки 16-клеточной стадии отделены от их соматического оболочки дальнейшее развитие и дифференцировать 19. В самом деле, мы заметили в нашей системе культуры, что, предположительно конца сперматоциты завершенного мейоза дивизий с разрушенными кисты клеток, хотя и очень редко. Наиболее часто эти разрушенные кисты прекратили развитие. После представленного протокола, неповрежденные кисты в некоторых случаях может DevЭлоп экс естественных в культуральной среде в течение максимум 72 часов. Тем не менее, мы обнаружили, что разумное количество цист выживать до 48 ч инкубации. В этот период времени, культивируемые кисты могут не развиваться с начальной стадии сперматоцитов пока делений мейоза, а также от круглого стадии ядер с гистона основе хроматина, пока последняя стадия каноэ за HP не перейти 12. Это позволяет Живая съемка жизненных процессов в сперматогенеза, как, например, сперматоциты ввода мейоза подразделения (рисунок 5 и Справочная видео 2). Для этого эксперимента, ЗП-меченый вариант гистона H2AvD был использован в качестве маркера хромосом. Первичная стадия сперматоцит распространяется в течение примерно 3-х дней в естественных условиях 31. Поэтому, для того чтобы записать мейотических делени, мы выбрали кисты с сперматоцитах, которые заметно начали конденсации хроматина (фиг.5А, область 2). Деления мейоза начинается в сперматоцитахна одной стороне кисты, а затем следует в волне в остальных сперматоцитах (на рисунке 5а от области 2 к области 1, также см Дополнительное видео 2). Конденсация хроматина вскоре приводит к быстродвижущихся хромосом, которые в виде ярких пятен (Рисунок 5А, область 2). Через 30 мин первые сперматоциты этой области уже в телофазе (5В, стрелки). Хромосомы молодого области 1 устроить на метафазной пластина 20 мин позже (Рисунок 5C). Они полностью телофазе и готовы пройти цитокинез около 15 мин позже (Рисунок 5D). Анафаза, телофаза, и цитокинез длился около 10 минут в этой записи (Supplemental видео 2). У млекопитающих, а также у дрозофилы, выраженное повышение гистона Н4 ацетилирования отмечает начало удаления гистонов и коммутатором HP при пост-мейозасперматогенез 6,11. Было предложено, что это эпигенетические модификации является важным компонентом или даже триггер программы развития в HP переключения 10,32. Ранее мы рассматривали дрозофилы куколки яички в культуре с ингибиторами ориентации шляпы и HDACs повлиять на уровень ацетилирования гистона H4 во время пост-мейотических этапов 12. В этих фармакологических анализов, мы обнаружили, что ацетилирование гистонов имеет важное значение для прогрессирования сперматогенеза от этапов с гистона основе хроматина к стадии с протамина основе хроматина. 6 и 7 показывают репрезентативные результаты фармакологического анализа с использованием anacardic кислоту целевой шляпы в куколки яичек. Семенники в 24 час НПФ рассекали от летучей деформации, выражающей H2AvD-RFP и ProtamineB-EGFP. ProtamineB-EGFP белок отсутствовал в этих ранних куколок семенников (фиг.6а и В). Через 24 чг в культуре, контрольные яички показали сигналы ProtamineB-EGFP, в которых указывается, что первые кисты разработали за переключателем HP (Рисунок 6A ', открытые наконечники стрел). Это было не так с яичками, получавших 150 мкМ anacardic кислоты (Рисунок 6B '). Препараты для сквоша яичка и иммунофлуоресцентные анализы предлагают более подробную информацию (рисунок 7). В необработанного контроля, ядра относительно крупных первичных сперматоцитах можно узнать по их характерной картины трех регионах богато окрашенных ДНК, которые соответствуют основным хромосом (уровень 4C) дрозофилы (7А, столбец 1). Ацетилирование гистона Н4, очевидно, обнаруживается на этой стадии (фиг.7В, столбец 1). Первый этап после делений мейоза известен как стадии Nebenkern и характеризуется достаточно большим круглым ядер (рис 4C; не показано на рисунке 7). Следующим этапом показано на рисунке 7 идентифицируется флагеллярной роста и круглой формы из зародышевых клеток ядер, которые уже намного меньше, чем на более ранних стадиях (рис 7А, колонка 2) и показывают очень низкий до почти незаметного уровня гистонацетилтрансферазы H4 ацетилирования (7В, колонка 2). Круглой формы, то удлиняется (7А, колонка 3), и ацетилирование гистона Н4 снова четко обнаружить (7В, колонка 3). Сперматид затем достичь стадии формы каноэ, в котором переключатель HP происходит и гистоны заменен протамины (фиг.7А – 7 С, колонках 4 и 5). После на сцену каноэ, в protaminated ядра затем дополнительно удлиненные в очень тонкой форме иглы в зрелом спермы (не показано на рисунке). Яичко сквош препараты яичек, получавших anacardic кислоты показали разные результаты (рисунки 7D </ STRONG> – 7 F). Хроматина в зародышевых клетках, обработанных anacardic кислоты появились более сжатым, чем у необработанного контроля (сравните рис 7D, лечение и 7А, управления). Анализ Иммунофлуоресцентное показал, что ацетилирование H4 был значительно уменьшилась или даже отсутствует в ядрах половых клеток, обработанных anacardic кислоты (Рисунок 7E). Известно, что сильно ацетилированные гистоны, связанные с областями открытого хроматина, в то время как хроматина области, которые не имеют ацетилирование гистонов часто показывают репрессивный структуру 33. Таким образом, нет ничего удивительного в том, что лечение с помощью anacardic кислоты влияние на структуру хроматина обработанных ядер зародышевых клеток. Важно отметить, что не протамин-положительных ядер поздней стадии каноэ или за пределами не были определены в обработанных семенников (Рисунок 7F). Таким образом, наши данные согласуются с идеей, что HAT активность необходима для спермиогенез приступить сюдам гистонов основе хроматин к протамина основе этапов хроматина. Рис.1 Обзор Drosophila сперматогенеза. Левая панель отображает последовательность этапов в развитии зародышевых клеток из стволовых клеток к индивидуализированной спермы. Схематичное изображение показать характерную ядерной морфологию половых клеток. Один сперматогоний делит производить 16 взаимосвязанных сперматоциты в одном кисты. На этом этапе большинство транскриптов, необходимых для пост-мейоза развитие получают, поступательно подавляется, и сохраняется. Основная часть транскрипционной активности заканчивается вступлением в делений мейоза. Переключатель гистонов к протамина в хроматина происходит между ранней и поздней стадии каноэ. Этапы с гистона основе хроматина высокиосвещенный красным; этапы с протамина основе хроматина, выделены зеленым цветом. Бары в правой панели показывают этапы зародышевых клеток, которые могут, как правило, найденных в развивающихся яичка у личинок, куколок на примерно 24 и 36 ч после образования пупария (НПФ) и взрослых мух. Рисунок 2. Drosophila яички на разных стадиях развития. () Фазового контраста изображение слегка раздавленный целом монтажа яичка третьего взрослой личинки (L3). Только предварительно мейотические и мейотические этапы можно найти. Сперматогонии ограничены переднем конце под регионе ступицы (звездочка). Остальные яичка наполнен сперматоцитах (открыт стрелки). (B) фазового контраста изображения из слегка раздавленного яичка в ок 24 часа в сутки, после образования пупария (ФПА). В дополнение к сперматоцитах (открыт стрелка), яичко содержит сперматид в Nebenkern этапе (открытые наконечники стрел), с круглыми ядрами и сперматидах в удлиняя этапы с растущей жгутиков (двойной открытый стрелки) (C – E). Всего монтажа куколки яички выражая H2AvD-RFP и ProtamineB-EGFP (накладки фазе контраста и EGFP и флуоресценции RFP изображений). (C) куколки яичка рассекают на ок 24 час НПФ. Arrowhead отмечает авто-флуоресценции предполагаемых клеток жира тела. D) куколки яичка расчлененный на ок 36 час НПФ отображает первую ProtamineB-EGFP-положительный киста (стрелка). (E) куколки яичка в ок 48 час НПФ с группой ProtamineB-EGFP-положительные кисты (стрелка). Во всех фигурных частей, звездочки указывают регион ступицы. Шкала баров: 100 мкм.АНК "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рис.3 Живая съемка переключателя гистона-к-протамин в куколки яичка растущей экс естественных. () Фазового контраста образ куколки яичка, выражающей H2AvD-RFP и ProtamineB-EGFP приняты во культуры в ок 45 час после образования пупария (ФПА). Семенных пузырьков указывает заполненной стрелкой. Paragonium (двойная стрелка) остается в яичках. (') EGFP и RFP флуоресценции яичка, показанной в (А). Открытая стрелка указывает на ProtamineB-EGFP-положительные киста. Шкала бар:. 100 мкм (Б) Через 2 часа 30 мин в культуре, еще несколько кисты (открыт стрелкой) возникают птом переход. (C) После дополнительного ок гистонов к протамин 3 ч в культуре, т.е. в общей сложности 5 ч 29 мин в культуре, группа кист (открыта стрелка), с сильным сигналом ProtamineB-EGFP видно на проксимальном конце яичка. Смотрите также Дополнительного видео 1. Во всех фигурных частей, звездочки указывают регион ступицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 4. Изолированные кисты половых клеток на разных стадиях развития. (A) Кисты расчлененный из яичка в ок 24 ч после образования пупария (ФПА). Наложение фазе контраста и H2AvD-RFP флуоресценции (красный) изображений. Шкала бар: 100 мкм.(B – E) Увеличения одиночных кист разных этапах. Наложение дифференциального интерференционного контраста (DIC) и флуоресценции изображений H2AvD-RFP. Шкала бар:. 20 мкм (B) Киста 16 сперматоцитах (C) Киста 64 круглых сперматидах на Nebenkern этапе.. Nebenkern структура развивается из конденсированных митохондрий и видна в ОПК изображений рядом с ядром (открыт стрелки). (D) Киста сперматидах с круглым H2AvD-RFP-положительных ядер и удлиняющейся жгутиков (открыт стрелка указывает удлиняя Nebenkern структуру, которая сопровождает растет аксонема). (E) Apical верхушка кисты сперматидах на ранней стадии каноэ показывая удлиненную ядерной форму. Широко удлиненные жгутики, лишь частично видимым. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фigure. Рисунок 5 живого изображения из одного 16-сперматоцитов кисты переживает мейоза я экс естественных условиях. Флуоресцентные изображения кисты в области культуры, выражающие H2AvD-RFP. Изображенные характерные этапы мейоза I. сперматоцитах в кисты проходят через делений мейоза в волнообразно. Конденсации (А) Хромосома начинается ядер на одной стороне кисты (2) и проходит через кисты (направлении, указанном стрелкой ). Ядра в противоположной области (1) представляют собой раннюю стадию конденсации хроматина, где гистонов-плотная регионы маркировки три основных хромосомы еще можно различить. Сперматоциты в регионе (2) содержит полностью конденсированных хромосом, видно, как ярко флуоресцирующих пятен. (B) После 300; мин, первые сперматоциты в регионе (2) находятся в телофазе (открытые наконечники стрел), в то время как конденсат хромосома продолжает в регионе (1) (C) В последние сперматоцитах области (1), хромосомы (стрелки) расположены. в метафазной пластина 20 мин позже. (D) В пределах следующих 15 мин, последние сперматоциты по всей видимости, завершили телофазе и теперь готовы пройти цитокинеза (открытые наконечники стрел). Смотрите также Дополнительного видео 2 Scale бар:.. 50 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 6 Anacardic кислота подавляет переключатель гистона-к-протамин в культивируемых куколки яичек. Куколки яичек Expressi нг H2AvD-RFP и ProtamineB-EGFP и расчлененный на 24 часов после образования пупария (НПФ) инкубировали в течение 24 ч в среде без ингибитора (управления, А, А '; ДМСО, диметилсульфоксид) или в среде с добавлением 150 мкМ anacardic кислоты ( В, В '). Регионы Hub указанные звездочками. (A, B) Нет ProtamineB-EGFP-положительные кисты не могут наблюдаться после вскрытия. (') Через 24 часа после инкубации, некоторые кисты прошли гистоноподобных к-протамина выключателем и ProtamineB-EGFP-позитивных кисты (открытые стрелки) можно наблюдать. (B ') Семенники обработанные anacardic кислоты не развиваются ProtamineB-EGFP-положительные кисты. Шкала бар:. 100 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. 68 / 51868fig7highres.jpg "ширина =" 500 "/> Рисунок 7 Anacardic кислота влияет гистонов H4 ацетилирование и структуру хроматина сперматид Сквош препараты сперматид ядер из куколки яичек (24 часа в сутки APF) выражая ProtamineB-EGFP инкубировали в течение 24 часов без ингибитора (A – C). Или с 150 мкМ anacardic кислоты (D – F). ДНК окрашивали Hoechst красителя (А и D). H4 ацетилирование проанализированы immunofluorescently (В и Е). Наличие протамины проверены с помощью сигнала ProtamineB-EGFP (C и F). После обработки anacardic кислоты, хроматин появляется сильно уплотнен (D), и сигнал Н4 ацетилирование полностью снижена во всех сперматид стадии (Е). Кроме того, anacardic-кислотной обработкеЯички не показывают кисты поздней стадии каноэ или дальше, и никакой сигнал ProtamineB-EGFP (F). Шкала бар:. 10 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Справочная Видео 1 живого изображения с помощью EGFP и RFP флуоресценции переключателя гистона-к-протамин в куколки яичка растет экс естественных условиях. Видео визуализации 6 ч время курса иллюстрирует переход гистона-к-протамин увеличением распространенности ProtamineB- EGFP-положительные кисты. Изображения были получены каждые 5 мин. Для получения дополнительной информации, смотрите Рисунок 3. (См "suppl_video_1.MOV" под Загрузки). Справочная Видео 2 Онлайн изображений из одного 16-сперматоциты кисты проходят мейоза я экс естественных. Покадровый флуоресцентной визуализациикисты в культуре выражения H2AvD-RFP в течение 80 мин. Это видео показывает характерные этапы мейоза I. Изображения были получены все 1 мин. Для получения дополнительной информации, смотрите Рисунок 5. (См "suppl_video_2.MOV" под Загрузки).

Discussion

Представленный протокол описывает два различных приложений, основанных как на способности разбираются Drosophila яички и один зародышевой линии кисты на данном этапе развития и на экс естественных развития этих клеток и тканей в культуральной чашке. Одно из приложений является фармакологическая манипуляция жизненных процессов во время развития сперматозоидов. Важно, что это позволяет получить доступ к пост-мейоза сперматогенеза, что не так легко, накопленного с помощью функциональный анализ, основанные на лету генетики. Другая заявка является микроскопическое наблюдение живут и развиваются зародышевые клетки и яички. Особенно данное приложение выгоды от способности клеток дрозофилы и органов в области культуры, чтобы выжить и развиваться при комнатной температуре и при нормальном атмосфере. Следовательно, инвертированный микроскоп изображений оборудована подогревом этапе (нагревании до стандартной температуре размножения 25 ° С) достаточно для получения значимых результатов в экспериментах живой визуализации. ДалееБолее того, многие трансгенные штаммы летать, выражающие флуоресцентный белок-меченных белков для живого изображения существуют или могут быть легко установлены.

Для получения куколки яички или зародышевой линии кисты определенной стадии развития, крайне важно, чтобы один знакомый со сроками развития Drosophila. Точные сроки для каждого этапа может меняться в зависимости от лаборатории, условиях культивирования, и летать штаммов и должны быть установлены эмпирически. Как отмечалось выше, это особенно важно для фармакологических анализов, которые, например, нацелены переключатель HP. Для таких экспериментов, желательно, чтобы всегда проверить сперматидах с сигналом ProtamineB-EGFP до фактического теста ингибитора, так как выбор времени может отличаться даже в пределах одной популяции.

После протокол выше, должны позволить экспериментатору рассекать яички из ранних куколки как интактных органов, свободных от прикрепленного жира ткани тела. Эти яички и, уж тем более, изолированные GERM-лайн кисты очень хрупкие. Следовательно, крайне важно развивать ловкость рук и опыт, необходимые для обработки и передачи яички и кисты с помощью щипцов, иглы, и пипетки. Особенно исследования, направленные на развитие мейотическому и раннего пост-мейотическое зародышевой клетки выиграют от этого. Хотя это сравнительно легко препарировать кисты конце сперматидах с длинными жгутиками из взрослых яичек, трудно получить более ранних стадиях. Пройдя эти кисты из ранних куколок яичек следующих этого протокола является гораздо более эффективным. Имейте в виду, что в обычной деформации золы, только около 50% из куколок будет мужчина. Поэтому, подготовить рассекать по крайней мере, в два раза больше куколок как количество яичек, необходимых. В качестве альтернативы, можно определить мужского L3 личинок с использованием стерео-микроскопа, как яички могут быть идентифицированы как полупрозрачные круглые органы, встроенные в боковых тканей жира тела интактного личинки 23,34, и собрать их в свежей культуральной флаконах, что можетбыть использованы для выбора предварительной куколки для постановки и вскрытий. Кроме того, можно определить мужского предварительной куколок 35.

Мы заметили, что как изолированные кисты зародышевой линии и неповрежденные куколок яички в культуре чувствительны к свету, как также сообщалось ранее 18. Это светочувствительность также могут провести для некоторых химических соединений, используемых в фармакологических анализов. Поэтому, лучше всего, чтобы сохранить культуру блюда анализе в темноте во время инкубации. Точно так же, при планировании покадровой эксперименты изображений с развивающимися яичек и, особенно, изолированные кисты, имейте в виду, что слишком длительное время воздействия и / или слишком высокие частоты дискретизации может ингибировать экс естественных развитие. Соответствующий частота дискретизации должна быть определена экспериментально.

Бактериальный и / или грибковая инфекция и над-рост в культуре блюда представляет серьезную проблему. Зараженные культуры блюда с слишком много бактерий не поддерживают Экс Vivo Деветию яичек и кист. Таким образом, описанные культуральная среда содержит пенициллин и стрептомицин (этап 1.1), но при длительном инкубации, эти антибиотики может быть снижено, а их активность может уменьшаться. Это может быть одной из причин ограниченного времени выживаемости (макс. 72 ч) культивируемых кист, наблюдаемых при использовании протокола выше. Тем не менее, этот срок не может быть продлен регулярной замены культуральной среды в блюдах. Мы пришли к выводу, что другие факторы могут влиять на выживание в культуре, таких, как отсутствие роста сигналов из других тканей половых путей. С другой стороны, после мейоза развитие происходит быстрее, чем у дрозофилы у млекопитающих. У дрозофилы спермиогенез занимает около 90 ч, а переключатель HP происходит между 50 и 60 ч после мейоза 9,12. Таким образом, в обычное время выживание около 48 часов, достигнутого с этим протоколом хорошо подходит следовать поворотные процессы развития в спеrmatogenesis, такие как делений мейоза или коммутатора HP. Хотя бактериальной или грибковой загрязнения можно избежать, используя чистые инструменты и средства массовой информации, представлены протокол не использовать строго стерильных условиях работать, потому что мухи и летать яички уже содержат бактерии, когда поднял в стандартных условиях. Тем не менее, некоторые приложения этой техники культуры могли бы извлечь выгоду от мух расчлененных или даже поднял в асептических условиях (для протоколов, увидеть 17,36,37).

Фармакологические тесты зависит от использования химических соединений, действующих как ингибиторы или активаторы различных ферментов. Соединения, обычно используемые в таких экспериментах часто сильно различаются по своей целевой специфики. В качестве преимущества, это дает возможность целевому целые классы ферментов, например, с anacardic кислоты, ингибирующих P300 / CBP, PCAF, и членов семьи MYST шляп 38. Недостатком этого может быть потенциал мимо цели или цитотоксических эффектов inducПод ред таких соединений. Поэтому, каждое соединение используется в анализе с куколки яичек или кисты должны быть проверены на его цитотоксичности и специфический эффект при различных концентрациях. Кроме того, небольшие изменения в условиях культуры, концентрационных соединение или деятельности, и вариации в клеточной проницаемости может привести к изменчивости индуцированных эффектов. Таким образом, необходимо контролировать успех лечения в каждом эксперименте. Например, когда мы использовали anacardic кислоты при 150 мкМ, мы наблюдали небольшое изменчивость прочности конденсации хроматина фенотипа между а иногда и в некоторых яичек, в то время как ацетилирование гистона Н4 последовательно уменьшается.

Фармакологические тесты с Drosophila семенников в культуре были использованы для анализа до и после мейоза механизмы сперматогенеза 4,12,14,21. Поскольку трудно получить доступ к пост-мейотическому сперматогенез с генетическими инструментов целевой игроков с эссенциял предварительно мейотические и мейотические функции, это экс естественных подход представляет собой альтернативу. Кроме того, в принципе, способ может быть адаптирован к импульсу-погони эксперименты, чтобы следить за развитием половых клеток, обработанных в течение долгого времени. Тем не менее, мы еще не проверили эту возможность. Используя ранней куколки семенников является преимуществом в фармакологических тестах. Во-первых, тонкая внешняя оболочка из молодых куколок яичек (около 24 часов НПФ) может привести к улучшенной проницаемости химических соединений. Во-вторых, при изучении после мейотическому переключатель HP, куколочные яички расчлененный на 24 ч НПФ с Протамина-GFP-экспрессирующих лету линии позволяют прямое считывание ли затронуты переключатель HP или нет.

На сегодняшний день известно несколько протоколов экс естественных выращивания дрозофилы органов и тканей, включая яичек и зародышевой линии кист были разработаны (например, видеть 4,14,17,20,39,40). Среда выращивание и общие условия, используемыев протоколе, представленной здесь были созданы в 1979 году 17. Система культура была позже адаптирована для визуализации в естественных механизма индивидуализации в конце пост-мейотических кист изолированных от взрослых яичек 4. Ранее мы уже сообщали, что эти условия также поддерживает выживание и дифференциацию мейоза и в начале пост-мейоза половых клеток в их цист в течение приблизительно 48 ч 12. В отличие от других культур систем 19 наблюдается времени развития в этих культурах было примерно соответствует срокам, определяемой из основных образцов (подробнее см 12). H2AvD-RFP и Протамина-GFP сигналы флуоресценции можно использовать для визуализации ядерной морфологии и хроматина состав зародышевых клеток в культуре. Мы обнаружили, что для четкой идентификации стадий развития в области культуры, это выгодный по сравнению с другими критериями, такими как наматывания кист. Важно отметить, что представлено протокол не предполагает добавление золы добRACT или другие факторы роста и другие, чем фетальной бычьей сыворотки. Кроме того, мы показываем, что условия совместимы с флуоресцентной микроскопии визуализации делений мейоза бывших естественных условиях в культуре. Изображения могут быть получены с достаточной резолюции в легкой в ​​использовании среды, поддерживающей долгосрочного развития. Это в отличие от протоколов, предусматривающих краткосрочные (около 3 ч) наблюдения в Voltalef нефти 41,42.

Процедуры, описанные выше для выращивания и фармакологического лечения куколки яичек и одиноких мужчин кисты зародышевой линии легко адаптируются к многих генетических, эпигенетических, клетки биологической, или вопросов развития, которые могут быть исследованы в Drosophila сперматогенеза. Это в частности, включает исследования с акцентом на зародышевой линии стволовых клеток. Было показано, что развитие стволовых клеток может быть затем живого изображения культивированных семенников взрослых 20,43. Тем не менее, перистальтический движение зрелого яичка сомч мешает получения изображений. Поэтому, либо изображения осуществляется с помощью фрагментированных яички 43 или ряд экспериментов изображений, выполненных должна быть увеличена для учета потерянных наборов данных 20. Ранние куколок яички (24 часа в сутки НПФ) еще не заключен с мышечными клетками. Даже немного старшего яички (36-45 ч НПФ) появляются, чтобы показать несколько перистальтических движений (сравните рисунок 3, и дополнительные 1 видео). Поэтому выращивание молодых куколок яичек как интактных органов может служить альтернативой.

Кроме того, после освоения, способность анализировать куколки яички и в конце концов, изолированные кисты зародышевой линии позволит дальнейшие приложения, используя одиночные кисты в качестве источника однородное, хотя и небольшой, клеточной популяции. Например, таким образом можно выполнить RT-КПЦР для анализа регуляции транскрипции специфических генов при определенных стадиях сперматогенеза, как уже было продемонстрировано <suр> 15.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors wish to thank T. Noguchi for helpful advice on the initial establishment of the culture technique in our laboratory. Research in the lab of R. R.-P. was funded by the DFG within the international collaborative research center TRR81.

Materials

Anacardic acid Merck Millipore 172050 brand: Calbiochem (EMD Millipore)
Anti-acetyl-Histone H4 Merck Millipore 06-598 brand: Upstate
AxioCam MRm  Zeiss
AxioObserver.Z1 inverted microscope Zeiss
Dimethyl sulfoxide Sigma D8418
Dumont 5-Inox forceps Dumont multiple suppliers
Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated Sigma F4135
Fiber optical  illuminator multiple suppliers
Glass Bottom Microwell Dishes MatTek P35G-1.5-14-C
goat anti-rabbit IgG (H+L)-Cy5 Dianova 711-175-152
Hoechst Sigma B1155
Inoculation loop or pin holder multiple suppliers
Austerlitz INSECT PINS stainless steel needles, size 0 Plano GmbH N5018 In our hands both these pin sizes worked well in the dissections. The minutiens are less rigid but have a smaller tip diameter.
Austerlitz INSECT PINS stainless steel minutiens, diam. 0.1 mm Plano GmbH N5014
Multiwell plates, 24-wells Becton Dickinson 351147 brand: Falcon
Pen Strep invitrogen 15070 brand: Gibco
Shields and Sang M3 Insect Medium Sigma S8398
Stemi SV6 binocular Zeiss
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Fuller, M. T. Genetic control of cell proliferation and differentiation in Drosophila spermatogenesis. Semin. Cell Dev. Biol. 9 (4), 433-444 (1998).
  2. de Cuevas, M., Matunis, E. L. The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis. Development. 138 (14), 2861-2869 (2011).
  3. Tokuyasu, K. T., Peacock, D. W. J., Hardy, R. W. Dynamics of spermiogenesis in Drosophila melanogaster. Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 124 (4), 479-506 (1972).
  4. Noguchi, T., Miller, K. G. A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Development. 130 (9), 1805-1816 (2003).
  5. Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Can’t live without them, can live with them: roles of caspases during vital cellular processes. Apoptosis. 14 (8), 980-995 (2009).
  6. Govin, J., Caron, C., Lestrat, C., Rousseaux, S., Khochbin, S. The role of histones in chromatin remodelling during mammalian spermiogenesis. Eur. J. Biochem. 271 (17), 3459-3469 (2004).
  7. Hecht, N., Behr, R., Hild, A., Bergmann, M., Weidner, W., Steger, K. The common marmoset (Callithrix jacchus) as a model for histone and protamine expression during human spermatogenesis. Hum. Reprod. 24 (3), 536-545 (2009).
  8. Kanippayoor, R. L., Alpern, J. H. M., Moehring, A. J. Protamines and spermatogenesis in Drosophila and Homo sapiens. Spermatogenesis. 3 (2), (2013).
  9. Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. Chromatin dynamics during spermiogenesis. Biochim. Biophys. Acta. , (2013).
  10. Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. Chromatin remodelling and epigenetic features of germ cells. Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).
  11. Rathke, C., Baarends, W. M., Jayaramaiah-Raja, S., Bartkuhn, M., Renkawitz, R., Renkawitz-Pohl, R. Transition from a nucleosome-based to a protamine-based chromatin configuration during spermiogenesis in Drosophila. J. Cell Sci. 120 (9), 1689-1700 (2007).
  12. Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. Histone H4 acetylation is essential to proceed from a histone- to a protamine-based chromatin structure in spermatid nuclei of Drosophila melanogaster. Syst. Biol. Reprod. Med. 56 (1), 44-61 (2010).
  13. Olivieri, G., Olivieri, A. Autoradiographic study of nucleic acid synthesis during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Mutat. Res. Fund. Mol. Mech. Mut. 2 (4), 366-380 (1965).
  14. Gould-Somero, M., Holland, L. The timing of RNA synthesis for spermiogenesis in organ cultures ofDrosophila melanogaster testes. Wilhelm Roux Arch. Entwickl. Mech. Org. 174 (2), 133-148 (1974).
  15. Barreau, C., Benson, E., Gudmannsdottir, E., Newton, F., White-Cooper, H. Post-meiotic transcription in Drosophila testes. Development. 135 (11), 1897-1902 (2008).
  16. Barckmann, B., Chen, X., et al. Three levels of regulation lead to protamine and Mst77F expression in Drosophila. Dev. Biol. 377 (1), 33-45 (2013).
  17. Cross, D. P., Shellenbarger, D. L. The dynamics of Drosophila melanogaster spermatogenesis in in vitro cultures. J. Embryol. Exp. Morphol. 53 (1), 345-351 (1979).
  18. Rebollo, E., González, C., Henderson, D. S. Time-Lapse Imaging of Male Meiosis by Phase-Contrast and Fluorescence Microscopy. Drosophila Cytogenetics Protocols. , 77-87 (2004).
  19. Kawamoto, T., Kawai, K., Kodama, T., Yokokura, T., Niki, Y. Autonomous differentiation of Drosophila spermatogonia in vitro. Dev. Growth Differ. 50 (7), 623-632 (2008).
  20. Sheng, X. R., Matunis, E. Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output. Development. 138 (16), 3367-3376 (2011).
  21. Leser, K., Awe, S., Barckmann, B., Renkawitz-Pohl, R., Rathke, C. The bromodomain-containing protein tBRD-1 is specifically expressed in spermatocytes and is essential for male fertility. Biol. Open. 1 (6), 597-606 (2012).
  22. Jayaramaiah Raja, S., Renkawitz-Pohl, R. Replacement by Drosophila melanogaster Protamines and Mst77F of Histones during Chromatin Condensation in Late Spermatids and Role of Sesame in the Removal of These Proteins from the Male Pronucleus. Mol. Cell. Biol. 25 (14), 6165-6177 (2005).
  23. Bodenstein, D., Demerec, M. The postembryonic development of Drosophila. Biology of Drosophila. , 275-367 (1950).
  24. Susic-Jung, L., Hornbruch-Freitag, C., Kuckwa, J., Rexer, K. H., Lammel, U., Renkawitz-Pohl, R. Multinucleated smooth muscles and mononucleated as well as multinucleated striated muscles develop during establishment of the male reproductive organs of Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 370 (1), 86-97 (2012).
  25. Ashburner, M., Roote, J., Sullivan, W. Laboratory Culture of Drosophila. Drosophila Protocols. , 585-599 (2000).
  26. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66 (1), 57-80 (1981).
  27. Hime, G. R., Brill, J. A., Fuller, M. T. Assembly of ring canals in the male germ line from structural components of the contractile ring. J. Cell Sci. 109, 2779-2788 (1996).
  28. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M., W, S. u. l. l. i. v. a. n. Cytological analysis of spermatocyte growth and male meiosis in Drosophila melanogaster. Drosophila Protocols. , 87-109 (2000).
  29. Stern, C. The growth of testes in Drosophila. I. The relation between vas deferens and testis within various species. J. Exp. Zool. 87 (1), 113-158 (1941).
  30. Lim, J. G. Y., Fuller, M. T. Somatic cell lineage is required for differentiation and not maintenance of germline stem cells in Drosophila testes. PNAS. 109 (45), 18477-18481 (2012).
  31. Fuller, M. T., Bate, M., Martinez-Arias, A. Spermatogenesis. The Development of Drosophila melanogaster. , 71-147 (1993).
  32. Braun, R. E. Packaging paternal chromosomes with protamine. Nature Genet. 28 (1), 10-12 (2001).
  33. Görisch, S. M., Wachsmuth, M., Tóth, K. F., Lichter, P., Rippe, K. Histone acetylation increases chromatin accessibility. J. Cell Sci. 118 (24), 5825-5834 (2005).
  34. Demerec, M., Kaufmann, B. P. . Drosophila Guide: Introduction to the Genetics and Cytology of Drosophila melanogaster. , (1996).
  35. Wang, W., Yoder, J. H. Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (56), (2011).
  36. Sang, J. H. The Quantitative Nutritional Requirements of Drosophila Melanogaster. J. Exp. Biol. 33 (1), 45-72 (1956).
  37. Meynadier, G., Vago, C. . Aseptic rearing of invertebrates for tissue culture. In: Invertebrate tissue culture. 1, (1971).
  38. Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Price, B. D. Inhibition of histone acetyltransferase activity by anacardic acid sensitizes tumor cells to ionizing radiation. FEBS Lett. 580 (18), 4353-4356 (2006).
  39. Aldaz, S., Escudero, L. M., Freeman, M. Live imaging of Drosophila imaginal disc development. PNAS. 107 (32), 14217-14222 (2010).
  40. Niki, Y., Yamaguchi, T., Mahowald, A. P. Establishment of stable cell lines of Drosophila germ-line stem cells. PNAS. 103 (44), 16325-16330 (2006).
  41. Church, K., Lin, H. P. P. Kinetochore microtubules and chromosome movement during prometaphase in Drosophila melanogaster spermatocytes studied in life and with the electron microscope. Chromosoma. 92 (4), 273-282 (1985).
  42. Rebollo, E., González, C. Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes. EMBO rep. 1 (1), 65-70 (2000).
  43. Cheng, J., Hunt, A. J. Time-lapse Live Imaging of Stem Cells in Drosophila Testis. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 11, 2E.2.1-2E.2.8 (2009).

Tags

DrosophilaPupal TestisEx Vivo CultureGerm-line CystsSpermatogenesisPost-meioticHistone-to-protamine SwitchPharmacological TreatmentMicroscopic Imaging

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Gärtner, S. M. K., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment. J. Vis. Exp. (91), e51868, doi:10.3791/51868 (2014).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image