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Biologia

Ex vivo Cultura de Drosophila Pupal Testículo e único macho da linha germinal Cistos: Dissection, Imaging, eo tratamento farmacológico

Published: September 11, 2014
doi:
10.3791/51868
, , ,
1Fachbereich Biologie, Entwicklungsbiologie,Philipps-Universität Marburg, 2Institut für Molekularbiologie und Tumorforschung,Philipps-Universität Marburg

Summary

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

Abstract

Durante a espermatogénese em mamíferos e em Drosophila melanogaster, as células germinais masculinas em desenvolver uma série de processos de desenvolvimento essenciais. Isso inclui a diferenciação de uma população de células-tronco, a amplificação de mitose e meiose. Além disso, as células germinativas de pós-meióticas submetido a um processo de remodelação morfológica dramático, bem como uma reconfiguração epigenética mundial da cromatina a opção de linha de germe de histona-a-protamina.

O estudo do papel da proteína na espermatogénese pós-meiótica usando mutagénese ou outras ferramentas genéticas é muitas vezes impedida por embrionário essencial, a pré-meiótica, meiose ou funções da proteína em estudo. O fenótipo de pós-meiótica de um mutante de uma tal proteína pode ser obscurecidos por meio de um bloco anterior de desenvolvimento, ou a interpretação do fenótipo pode ser complicado. O organismo modelo Drosophila melanogaster oferece um bypass para este problema: testículos intactos emesmo cistos de células germinativas dissecados a partir de pupas cedo são capazes de desenvolver ex vivo, em meio de cultura. Fazendo uso de tais culturas permite imagens microscópicas de células germinativas vivendo em testículos e de cistos de linha germinal. É importante ressaltar que os testículos cultivadas e células germinativas também tornar-se acessível a inibidores farmacológicos, permitindo assim a manipulação de funções enzimáticas durante a espermatogênese, incluindo as etapas de pós-meióticas.

O protocolo apresentado descreve como dissecar e cultivar testículos pupa e cistos em células germinais. Informações sobre o desenvolvimento dos testículos pupa e condições de cultura são apresentadas juntamente com dados de imagens de microscópio de testículos ao vivo e cistos germinativas em cultura. Os requerentes também descrevem um ensaio farmacológico para estudar a espermatogénese pós-meiótica, exemplificado por um ensaio de direccionamento do comutador de histona-a-protamina usando o ácido anacárdico inibidor de histona-acetiltransferase. Em princípio, este método de cultivo pode ser adaptado para tratar o muitosquestões de pesquisa utras na espermatogênese pré e pós-meiótica.

Introduction

O desenvolvimento de células germinativas masculinas de muitas espécies é um processo sequencial. Caracteriza-se por uma série de eventos cruciais que culmina na formação de espermatozóides morfologicamente e epigeneticamente altamente especializada. Em Drosophila melanogaster, as células-tronco de linha germinal na ponta da divisão testículo assimetricamente para dar origem a uma nova célula-tronco ea spermatogonium, ou seja, a célula-filha que está comprometida com a diferenciação (ver Figura 1 para uma visão geral) 1,2 . O spermatogonium sofre quatro rondas de divisões de mitose e, com o início da meiose, uma fase de crescimento impressionante e actividade de transcrição denominado a fase de espermatócitos. As células provenientes de um spermatogonium permanecem ligados uns aos outros e desenvolver-se como um feixe sincronizado envolto por duas células somáticas uma estrutura referida como um cisto. Após a conclusão da meiose, a morfologia das células germinais masculinas é completamentereorganizado (esquematicamente mostrado na Figura 1). Inicialmente, espermatídeos redondos alongados para formar a estrutura de cabeça hidrodinâmico, e o flagelo desenvolve. Eventualmente, as células do esperma são separados um do outro por um mecanismo complexo, relacionados com a apoptose chamado individualização 3-5.

Em muitas espécies, incluindo Drosophila melanogaster e espécies de mamíferos, as alterações morfológicas das células germinativas são acompanhados por um rearranjo epigenética notável da haplóides masculino germinal cromatina, chamado o interruptor histona-to-protamina (interruptor HP) 6-9. Possivelmente, a quase totalidade da histona canónica e várias moléculas de variantes de histona-são retirados a partir do ADN e são substituídas por pequenas proteínas básicas, as protaminas, resultando na estrutura altamente compacta nucleoprotamine específico para a cromatina de esperma maduro. Características gerais do interruptor HP são tele substituição de histonas canónicas primeiro por variantes de histona, em seguida, por proteínas de transição, e, finalmente, por protaminas. Tudo isto é acompanhada por várias mudanças a epigenética marcas, tais como um aumento nos níveis de acetilação da histona H4, imediatamente antes da remoção da histona 7,10 – 12.

A maioria, se não todos, os processos acima mencionados são essenciais para o desenvolvimento de maturidade, esperma completamente férteis. Isto é verdade não apenas em Drosophila, mas também em seres humanos, com as ações da espermatogênese de mamíferos uma quantidade considerável de similaridade com o sistema 1,8,9 invertebrados. Estudo do desenvolvimento de células germinativas do sexo masculino é facilitada no sistema do modelo de Drosophila. As moscas são geneticamente muito acessível. A geração de mutantes, assim como o estabelecimento de linhagens de moscas expressando genes de fusão ou construções de interferência RNA leva pouco esforço. No entanto, no estudo de pós-meiótica espermatogénese, a utilização de mutantes de umad ferramentas genéticas simples poderia chegar a um limite. Em Drosophila espermatogênese, transcrição cessa quase completamente com entrada em divisões meióticas. Assim, a espermatogênese pós-meiótica é baseado principalmente em mRNAs traducionalmente reprimidos e armazenados sintetizadas em uma prófase meiótica estendida 13-16. Portanto, como ferramentas de interferência de ARN ou a utilização de mutantes não-condicionadas, não são adequados para estudar os papéis especificamente pós-meióticas de produtos de genes que desempenham funções essenciais também no desenvolvimento de células germinativas pré-meiótica ou meiose.

Uma vantagem de Drosophila que pode ser explorada em tais casos, é a capacidade de testículos dissecados intactas e até cistos de células germinativas para desenvolver ex vivo, em meio de cultura 4,12,17 – 20. A dissecção e cultivo de testes ou cistos germinativas permite não só a observação microscópica do desenvolvimento de células germinativas em células vivas, mas umlso a utilização dos ensaios farmacológicos, por exemplo, inibidores de complexos de enzimas, tais como histona-acetiltransferases (HATs), histona desacetilases (HDACs), topoisomerases, ou o proteassoma. Assim, é possível manipular funções enzimáticas durante a espermatogênese pós-meiótica e monitorar os resultados de desenvolvimento, independentemente do embrionárias, pré-meióticas, ou meiose funções 4,12.

Em ensaios farmacológicos, que previamente analisadas a localização dependente de acetilação de uma proteína bromodomain durante a prófase meiótica, bem como a relevância dos níveis de acetilação das histonas para o interruptor epigenético HP na espermatogênese pós-meiótica utilizando inibidores específicos visando chapéus e HDAC 12,21. Visando o interruptor HP nestes ensaios foi tornada possível pelo uso de uma estirpe da mosca que expressa os genes de fusão histone2AvD-RFP e protamineB-eGFP 12,22 nos padrões endógenos, e a observação de queos primeiros espermátides nos testículos pupa passar pelo interruptor HP entre 24 e 48 horas APF 12.

O protocolo apresentado descreve a dissecção dos testículos e cistos de Drosophila pupas, as condições de cultura, e um ensaio farmacológico com testículos pupa intactas. Para esta finalidade, os testículos pupa em aproximadamente 24 horas após a formação pupário (APF) são dissecados (ver Figuras 1 e 2). Neste momento, os testículos não foram feitas ligações a outros tecidos e estão rodeados por apenas uma bainha externa fina, o que permite uma melhor penetração dos compostos inibidores de 23,24. Os testículos são órgãos bean- ou em forma de pêra que podem ser facilmente levados em cultura. Estes testes são dissecados e cultivados e tratados com inibidores específicos. Subsequentemente, os efeitos dos inibidores são monitorados utilizando imunofluorescência e microscopia de fluorescência de expressão de proteína de fusão, e por comparação da morfol nucleargia das células germinais tratados para que não tratados de células germinais. As condições apresentadas neste protocolo também permite que imagens ao vivo de desenvolver testículos e cistos germinativas em cultura.

Protocol

Declaração de Ética: Os procedimentos experimentais descritos neste protocolo envolvem a trabalhar exclusivamente com Drosophila melanogaster e não estão sujeitas às leis de protecção dos animais na Alemanha. 1. preparação de meios, ferramentas e Moscas Prepare modificado em pó meio de crescimento M3 disponível comercialmente, sem bicarbonato de potássio 17. CUIDADO: Irritante para os olhos e pele. Suplementar o meio com 10% de soro fetal bovino, 100 U / ml de penicilina, e 100 ug / ml de estreptomicina. Use soro fetal bovino inseto-cultura-testado inativado pelo calor e para obter melhores resultados. Filtra-se o meio completo (referido daqui em diante como forma) por meio de uma unidade de filtro de garrafa superior a 0,2 ^ m e no armazenamento de alíquotas a -20 ° C. Antes da sua utilização, o filtro (0,2 um filtro de seringa de ponta) do meio de novo para remover os precipitados. Preparar soluções de inibidor para os ensaios farmacológicos. Dissolve os produtos químicos no solvente apropriado e armazenar-se em aliquotas. Por exemplo, preparar uma solução estoque de ácido anacárdico 28,69 mM (CUIDADO: Irritante para os olhos e pele) em dimetilsulfóxido. Preparar as ferramentas para o rompimento dos testículos pupas dissecadas e dissecção de cistos simples. Use duas agulhas afiadas e duras, em vez de um par de fórceps. A força capilar que se desenvolve entre os dois braços de um par de fórceps faz a dissecação de cistos simples em pequenas quantidades de meio muito difícil. Por exemplo, utilizar a ponta de um pino de insectos aço inoxidável inserido num suporte de ansa de inoculação. A fim de obter pupas apropriadamente idade, cerca de 10 sementes de frascos de cultura grandes (tubos com 4 cm de diâmetro) com um número suficiente de moscas adultas (cerca de 40-60 moscas). Para analisar o switch HP, use moscas expressando H2AvD-RFP e ProtamineB-EGFP em seu padrão endógeno 12,16,22. Incubar os frascos, sob condições normais, a 25; ° C por cerca de 4-5 dias até o terceiro instar as larvas rastreamento e começar pupation nas paredes dos frascos 25. 2 Marcação ou Coleta Branco Pré-pupas obter 24 horas de idade, pupas para Dissecção Para testar a influência de certas substâncias químicas no switch HP, dissecar testículos pupa em cerca de 24 horas APF 12. Para obter pupas encenado, tomar as preparados frascos de cultura voar com pupating larvas (ver secção 1.4) e identificar como muitos brancos pré-pupas possível. Pré-pupas durante a primeira etapa em pupation aparecer como imóvel, não-alimentação, as larvas em vez encurtado com spiracles evertidas e pupário de cor branca. O pupário torna-se tan-marrom dentro de 30 a 60 min, o que indica o próximo estágio de desenvolvimento das pupas 26. Marcam as posições de pré-pupas com um marcador permanente no lado de fora dos frascos. Incubar os tubos a 25 ° C durante cerca de 24 horas. Alternativamente,escolher o pré-pupas do lado dos frascos com uma pequena escova humedecido com tampão PBS. Em seguida, transferir o pré-pupas para o lado de um tubo de reacção de 50 mL fresco e incuba-se a 25 ° C durante cerca de 24 horas. 3. Dissecção da Pupal Testes em cerca de 24 horas após a formação pupário Distribuir várias gotas (cerca de 80 ul cada) de meio de cultura de células em um de plástico 10 cm ou numa caixa de Petri. Usando uma ampla par de fórceps ou um pincel embebido em média, escolher as pupas na fase APF 24 horas dos frascos incubados (ver secção 2). Transferir uma pupa de cada gota de meio no prato. Para a dissecção, usar um microscópio estéreo equipado com um iluminador de fibra óptica. Não aquecer os testículos acima RT durante a dissecção, pois isso pode impedir o bom desenvolvimento da cultura. Dissecar pupas com dois pares de n º 5 fórceps. Com um par, agarrar a pupa, na sua mais posteriorparte (dos espiráculos posteriores) e mantê-lo na posição. Pegue os espiráculos anteriores com o outro par de fórceps e abrir o opérculo de pupa em sua extremidade anterior. Retire o caso de pupas, até, pelo menos, parte do tórax está exposta. Continue pressionando a pupa na posição pelo seu fim mais posterior. Para liberar a pressão interna da pupa, insira os dois braços de um par de fórceps para a região da cabeça da pupa. Rasgar a pupa aberto abrindo as pinças e mover a pinça na direcção anterior. Assegure-se que a abertura gerado com este movimento é tão grande quanto possível na primeira tentativa. Evite danificar a pupa em sua extremidade posterior antes que a pressão foi liberada, pois isso pode resultar nos testículos sendo empurrado diretamente através da pequena abertura e na maioria das vezes ser interrompido. Observe que uma vez que a pupa é aberta, a pressão interna lançado da pupa pressiona a aglomerados de células de gordura corporal e do tecido através do laabertura rge na região da cabeça. Verifique se os testículos pupa já foram empurrados para fora da pupa com este material; isto ocorre em alguns casos. Os testículos não estão ligados a qualquer outro tecido em 24 horas APF e, portanto, pode ser expulso facilmente da pupa 23. Evite apertar a pupa com a pinça, pois isso pode danificar os testículos se eles permanecem na pupa. Aumentar o tamanho da abertura usando um par de fórceps. Em seguida, mantenha a pupa em sua extremidade mais posterior. Feche o outro par de pinças e expelido suavemente o conteúdo da pupa de posterior para anterior para libertar os testículos das crisálidas. Recolha os testículos puxando-os em um pré-corte de 200 mL ponteira. Tentar transferir apenas uma muito pequena quantidade de meio para reduzir o número de células de gordura corporal transferidos com os testículos. Coloque os testículos em média em um prato de cultura fresco. Lave os testes várias vezes com meio até que só célula do corpo poucos gorduras permanecem. Para imagens ao vivo, transferir testículos a uma cultura prato fundo de vidro com meio e usar um microscópio de imagem invertida. Para os ensaios farmacológicos, continue com o passo 5. 4. Dissecção da masculinos Cistos linha germinal e Imagens ao vivo Transferir um ou mais testículos pupa a uma cultura prato fundo de vidro. Use um microscópio estéreo com iluminação de fibra ótica e duas agulhas de aço inoxidável (ver secção 1.3) para a dissecção das germinativas cistos do sexo masculino. Com uma agulha, cuidadosamente tentar fixar para baixo um testículo na sua anterior ou posterior final. Segure-o na posição. Inserir a agulha no outro testículo e perturbar a bainha testículo, movendo a agulha lateralmente. Muitos dos cistos será libertada do testículo por este movimento. Continue a segurar o testículo em posição com uma agulha. Gentilmente raia os cistos restantes do testículo com a outra agulha. Cistos agregados separados tanto por gently movimento de uma agulha para o lado através do conjunto de cistos ou transferindo os cistos para um prato de cultura fresca com o meio com uma pipeta de ponta de 200 ul. Mova a placa de cultura a um microscópio de imagem invertida para geração de imagens ao vivo de cistos simples. Dispersar cistos novamente com uma agulha, se necessário. Identificar a fase dos cistos utilizando contraste de fase e microscopia de fluorescência. Concentre-se em um cisto do estágio desejado. Confirmar foco e posição do cisto frequentemente durante as experiências de imagiologia mais longas, como os cistos não aderir ao fundo do prato de cultura e, por conseguinte, tendem a flutuar fora de foco. NOTA: O revestimento da placa com poli-L-lisina para a imobilização é prejudicial para o desenvolvimento de quistos germinativas iniciais. Em vez disso, os cistos individuais podem ser isolados. Com alguma prática, é possível isolar um quisto nomeadamente por muito suavemente empurrando-a com a agulha. Isto irá permitir a transferência dos cistos simples de culto separadoure pratos com uma pipeta de Pasteur de vidro, com uma parte saliente que se encaixa dentro do campo de visão do microscópio. Os cistos isolados, em seguida, pode ser facilmente transferida em placas de cultura, mesmo após a incubação de longo prazo. 5. farmacológica Ensaio com intactas pupais Testículos Encher cada poço de uma placa de 24 poços de cultura de células com 500 ul de meio para uma experiência de 12 repetições. Transferência de uma pupa testículo a cada poço, usando um pré-corte de 200 mL ponteira. Entrada para a presença de protaminas nos testículos isolados utilizando um microscópio invertido de fluorescência. Os testículos deve ser livre de sinal ProtamineB-eGFP, que indica que o comutador HP não ocorreu em qualquer dos cistos. Substitua testículos que já apresentam cistos ProtamineB-EGFP-positivos. Para os primeiros 12 poços, adicionar 500 mL de meio contendo composto inibidor diluído (ácido anacárdico) para alcançar a concentração final desejada(150 fiM) em 1 ml de meio por poço. Use os poços restantes como controles não tratados; adicionar 500 mL de meio com a mesma quantidade de solvente utilizado como com os compostos inibidores. Nota: se forem utilizados diversos compostos e solventes diferentes, pode ser mais eficiente ao utilizar meio sozinho como controlo e para testar a influência de aumentar as concentrações de solventes, em experiências separadas. Incubar a placa a 25 ° C durante 24 horas no escuro. Verificar novamente para a presença de protaminas nos testículos incubadas como descrito acima. Os testículos de controle deve agora mostrar cistos um ou mais ProtamineB-EGFP-positivos, o que indica a transição através do switch HP. Com uma pipeta com uma ponta de 200 mL, transferir os testículos aos slides poli-L-lisina-revestido, fazer os preparativos de squash e mancha com anticorpos fluorescentes adequadas conforme descrito em outros lugares 12,27,28.

Representative Results

O testículo em Drosophila machos já é formada no embrião e persistir na cavidade corporal durante a fase larval. Terceiro instar as larvas mostram testículos pequenos, redondos cercados por uma camada de células pigmentares futuras e embutidos no tecido de gordura corporal (Figura 2A). Testes em moscas machos adultos são, tubos enrolados longos, que são cobertos por uma camada de células musculares provenientes do disco genital e uma camada de pigmento 24. Curiosamente, testículos larvais conter apenas as células germinativas de fases de pré-meióticos e meióticos, até a fase de espermatócitos primários, o que corresponde a profase da meiose (ver também a Figura 1) 23. As primeiras gerações de células germinais masculinas passar através da meiose durante a formação pupário. Em cerca de 24 horas APF, estágios de pós-meióticas com flagelos alongado já desenvolveram, e todos os núcleos contêm histona H2AvD-RFP (Figuras 1 e 2B). Nenhum dos espermatídeos foram submetidos a tele HP interruptor como sem sinal ProtamineB-eGFP pode ser detectado através de microscopia de fluorescência (Figura 2C). Frequentemente, os testículos dissecados nesta fase contém uma estrutura de auto-fluorescente de tamanho variável reminiscente de um aglomerado de células do corpo gordo ou de uma a várias gotas de óleo (Figura 2C, seta). Esta estrutura dentro do testículo é também visível à microscopia de contraste de fase. Até o momento, não encontramos nenhuma descrição de sua natureza na literatura. Testes dissecados em 36 hr APF aparecem alongadas e em alguns casos já começam a enrolar (Figura 2D). Eles já ligado aos tecidos do trato genital de crescimento para fora do disco imaginal genital 23,24. Além disso, eles contêm frequentemente os primeiros espermatídeos além do interruptor HP, como indicado pelo sinal ProtamineB-eGFP (Figuras 1 e 2D, seta). Às 48 horas APF, os testículos têm mais alongada e claramente começar a enrolar noextremidade proximal. Vários cistos germinativas com núcleos protamina positivos tornam-se visíveis (Figura 2E, seta). Quando testículos dissecados às 24 h APF são mantidas em cultura durante 24 horas, não se alongam como na mosca intacta (comparar com a figura 2D e 2E com a Figura 6A '). Isto é possivelmente devido à falta de sinais de posição e de crescimento normalmente enviados a partir do trato genital desenvolvimento contactar o testículo em sua ponta posterior 23,29. Além disso, a camada de músculo da bainha testículos não desenvolver porque miotubos nascentes não podem migrar a partir do disco para a genital testículo 24. A bainha-testículo nesta situação unicamente a fina camada de pigmento não-parecem crescer suficientemente em cultura para envolver o aumento do número de desenvolvimento de células germinativas dentro. No entanto, as células germinativas crescer, dividir, diferenciar e independentemente da bainha de testículo. Assim, depois de mais de 36 hr na cultura, os primeiros testes freqüentemente se abriu, e um maior desenvolvimento não é observado. No entanto, dentro de um prazo curto, é possível gravar time-lapse ex vivo imagens ao vivo de testículos inteiros em desenvolvimento na cultura, como evidenciado pelas Figuras 3A -3 C (veja também o vídeo Suplementar 1). Um testículo de pupa, dissecado em cerca de 45 horas APF, foi incubado em meio durante 6 horas e fotografada a cada 5 min. Dentro deste período de tempo, vários cistos de espermátides emergir da fase interruptor HP e mostrar um (3A Figuras '-3 C, setas abertas) de sinal ProtamineB-EGFP brilhante. Como mencionado acima, as células germinativas masculinas no testículo Drosophila desenvolver como pacotes sincronizados de células interligadas, cistos chamados 1. Figura 4A mostra uma vista geral de cistos dissecados a partir de um testículo pupa em cerca de 24 horas do APF. Fases de pré-meióticas, Estágios da meiose, estágios iniciais de pós-meióticas, e também cistos no palco canoa cedo com núcleos alongados antes do interruptor HP podem ser encontrados (Figuras 1 e 4B -4 E). Os cistos isolados são muito frágeis e devem ser manuseados com cuidado. As duas células somáticas que formam envelope do cisto pode ser facilmente rompido mecanicamente. Células-tronco germinativas têm a capacidade de sobreviver e continuar a dividir após a ablação genética das células somáticas cisto in vivo 30. Foi relatado que in vitro, as células germinativas de a fase de 16 células separadas do seu envelope somática desenvolver e diferenciar 19. Na verdade, percebemos em nosso sistema de cultura que espermatócitos presumivelmente final concluída divisões meióticas com células císticas interrompidos, embora muito raramente. Na maioria das vezes, esses cistos interrompidos cessou desenvolvimento. Seguindo o protocolo apresentado, cistos intactos pode, em alguns casos devElop ex vivo, em meio de cultura durante um período máximo de 72 horas. No entanto, observou-se que um número razoável de cistos sobrevivem até 48 horas de incubação. Dentro deste espaço de tempo, os cistos cultivadas são capazes de se desenvolver a partir da fase de espermatócitos primários até depois divisões meióticas, bem como a partir da fase de núcleos redondos com cromatina à base de histona até a fase final de canoa para além do interruptor 12 HP. Isto permite que imagens em tempo real dos processos vitais em espermatogénese, como por exemplo, inserindo espermatócitos divisões meióticas (Figura 5 e de vídeo suplementar 2). Para esta experiência, a variante de histona marcaram-RFP H2AvD foi usada como marcador de cromossoma. O estágio espermatócito primário se estende por cerca de 3 dias vivo 31. Portanto, a fim de gravar divisões meióticas, optamos cistos com espermatócitos que tinha visivelmente iniciados condensação da cromatina (Figura 5A, região 2). Divisão meiótica começa em espermatócitosde um lado do quisto e depois segue numa onda em espermatócitos restantes (na Figura 5A de região para região 2 1, também ver vídeo suplementar 2). Condensação da cromatina em breve leva a cromossomos em movimento rápido que são visíveis como pontos brilhantes (Figura 5A, região 2). Após 30 min, os primeiros espermatócitos desta região já estão na telofase (Figura 5B, pontas de seta). Os cromossomas de uma região mais jovem providenciar na metafase placa 20 min mais tarde (Figura 5C). Eles telofase completa e está pronto para sofrer citocinese cerca de 15 minutos mais tarde (Figura 5D). Anáfase, telófase e citocinese durou cerca de 10 minutos nesta gravação (vídeo Suplementar 2). Nos mamíferos, assim como em Drosophila, um aumento pronunciado na histona H4 acetilação marca o início da remoção da histona e o interruptor HP durante a pós-meióticaespermatogênese 6,11. Tem sido proposto que esta modificação epigenética é um componente essencial ou mesmo gatilho do programa de desenvolvimento da HP exibir 10,32. Anteriormente, nós tratamos de Drosophila testículos pupa em cultura com inibidores HDAC alvo chapéus e de influenciar o nível de acetilação das histonas H4 durante os estágios pós-meióticas 12. Nestes ensaios farmacológicos, observou-se que a acetilação das histonas é essencial para a progressão da espermatogénese de fases com cromatina à base de histona para fases com cromatina à base de protamina. Figuras 6 e 7 mostram resultados representativos de um ensaio farmacológico usando ácido anacárdico alvejar HATs nos testículos pupa. Testes às 24 h APF foram dissecados de uma cepa fly expressar H2AvD-RFP e ProtamineB-EGFP. Proteína ProtamineB-eGFP estava ausente nesses testículos pupa precoce (Figura 6A e B). Após 24 hr na cultura, os testículos mostraram sinais de controle ProtamineB-EGFP, o que indica que os primeiros cistos tinham desenvolvido além do switch HP (Figura 6A ', pontas de seta abertas). Este não foi o caso com os testículos tratadas com 150 uM de ácido anacárdico (Figura 6B). Preparações de squash testículos e análises de imunofluorescência oferecer informações mais detalhadas (Figura 7). Nos controlos não tratados, os núcleos dos relativamente grandes espermatócitos primários podem ser reconhecidos pelo seu padrão característico de três regiões de ADN ricamente manchado, que correspondem aos maiores cromossomas (nível 4C) de Drosophila (Figura 7A, coluna 1). A acetilação da histona H4 é claramente detectável nesta fase (Figura 7B, coluna 1). A primeira fase após divisões meióticas é conhecido como a fase Nebenkern e é caracterizado por núcleos bastante grande, rodada (veja a Figura 4C, não mostrado na Figura 7). A etapa seguinte mostrada na Figura 7 é identificada por um crescimento flagelar e a forma arredondada dos núcleos de células germinativas, que já são muito menores do que nos estágios iniciais (Figura 7A, coluna 2), e mostram muito baixa para níveis quase indetectáveis ​​de histona H4 acetilação (Figura 7B, coluna 2). A forma redonda, em seguida, se alonga (Figura 7A, coluna 3), e a acetilação da histona H4 é novamente claramente detectável (Figura 7B, coluna 3). As espermátides em seguida, chegar à fase de forma canoa em que o switch HP tem lugar e as histonas são substituídos por protaminas (Figuras 7A – 7 C, colunas 4 e 5). Após a etapa de canoa, os núcleos protaminated então mais alongada em forma de agulha muito fina no espermatozóide maduro (não mostrado aqui). Preparações Testículo de squash de testículos tratados com ácido anacárdico apresentou resultados diferentes (Figuras 7D </ Strong> – 7 F). A cromatina em células germinativas tratados com ácido anacárdico apareceu mais condensada do que a do controlo não tratado (comparar com a figura 7D, tratados e 7A, controlo). A análise por imunofluorescência revelou que a acetilação de H4 foi muito diminuída ou mesmo ausente em núcleos de células germinativas tratados com ácido anacárdico (Figura 7E). Sabe-se que as histonas acetiladas altamente estão associados com as regiões de cromatina aberta, enquanto que as regiões de cromatina que carecem da acetilação das histonas apresentam frequentemente uma estrutura repressora 33. Portanto, não é surpreendente que o tratamento com ácido anacárdico influenciado a estrutura da cromatina de núcleos de células germinativas tratados. É importante ressaltar que não há núcleos protamina positivo do estágio final de canoa ou fora foram identificados em testes tratados (Figura 7F). Assim, nossos dados são consistentes com a ideia de que a atividade HAT é essencial para espermiogênese proceder frocromatina a cromatina fases à base de protamina m histona-base. Figura 1 Visão de Drosophila espermatogênese. O painel esquerdo mostra a seqüência de etapas no desenvolvimento de células germinativas de uma célula-tronco de esperma individualizados. Desenhos esquemáticos mostram a morfologia nuclear característica das células germinativas. Uma spermatogonium divide para produzir 16 espermatócitos interligados em um cisto. Durante esta fase, a maior parte dos transcritos necessários para o desenvolvimento pós-meiótica são produzidos, em translação reprimido, e armazenado. A maior parte da atividade transcricional termina com a entrada em divisões meióticas. O interruptor de histona-a-protamina na cromatina tem lugar entre a fase de canoa precoce e tardia. Fases com uma base cromatina-histona são elevadosiluminado em vermelho; estágios com cromatina à base de protamina são destacadas em verde. As barras no painel direito indicam as fases de células germinativas que normalmente podem ser encontrados no testículo desenvolver em larvas, pupas em cerca de 24 e 36 horas após a formação pupário (APF), e moscas adultas. Figura 2 Drosophila testículos em diferentes estágios de desenvolvimento. Imagem de contraste de fase de todo-mount um testículo ligeiramente comprimida de uma larva de terceiro estádio (L3) (A). Somente fases de pré-meióticas e meiose pode ser encontrado. Espermatogônias estão restritas à ponta anterior sob a região do centro (asterisco). O testículo restante é preenchida com espermatócitos (seta aberta). Imagem de contraste de fase de um testículo ligeiramente achatada em cerca de (B) 24 horas após a formação pupário (APF). Além de espermatócitos (seta aberta), o testículo contém espermátides em fase Nebenkern (setas abertas), com núcleos redondos e espermátides em alongamento estágios com flagelos crescente (seta aberta duplo) (C – E). Todo-mount testículos pupa expressando H2AvD-RFP e ProtamineB-EGFP (overlays de contraste de fase e eGFP e imagens de fluorescência RFP). (C) testículo Pupal dissecado em cerca de 24 horas APF. Ponta da seta marca autofluorescência das células do corpo gordo putativos. D) Pupal testículo dissecados a cerca de 36 h da primeira mostra FFA cisto ProtamineB-eGFP positivas (setas) (E). Pupal testículo a cerca de 48 horas APF com um grupo de cistos ProtamineB-eGFP-positivas (setas). Em todas as partes figura, asteriscos indicam a região do centro. Barras de escala: 100 um.ank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3. vivo imagiologia do interruptor de histona-a-protamina na testículo pupa crescimento ex vivo. Imagem de contraste de fase de um testículo de pupa expressar H2AvD-RFP e ProtamineB-EGFP levado em cultura em cerca de 45 horas após a formação pupário (APF) (A). A vesícula seminal é indicado por uma seta cheia. Um paragonium (ponta de seta dupla) permanece ligado ao testículo. (A ') e eGFP RFP fluorescência do testículo mostrado em (A). A seta aberta indica um quisto ProtamineB-eGFP-positivo. Barra de escala:. De 100 um (B) Depois de 2 h 30 min em cultura, vários outros cistos (seta aberta) emergir from a histona-to-protamina transição. (C) Depois de uma cerca adicional 3 h em cultura, ou seja, um total de 5 h 29 min, em cultura, de um grupo de cistos (seta aberta) com sinal ProtamineB-eGFP forte é visível na extremidade proximal do testículo. Veja também o vídeo Suplementar 1. Em todas as partes figura, asteriscos indicam a região do hub. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4. cistos isolados de células germinativas em diferentes fases de desenvolvimento. (A) Cistos dissecado de um testículo em cerca de 24 horas após a formação pupário (APF). Sobreposição de contraste de fase e fluorescência H2AvD-RFP (red) imagens. Barra de escala: 100 um.As ampliações de cistos isolados de diferentes fases – (E B). Sobreposição de interferência diferencial contraste (DIC) e imagens de fluorescência H2AvD-RFP. Barra de escala:. 20 um (B) Cisto de 16 espermatócitos (C) Cisto de 64 espermátides arredondadas na fase Nebenkern.. A estrutura Nebenkern desenvolve a partir de mitocôndrias fundidos e é visível em imagens DIC próximo ao núcleo (seta aberta). (D) Cisto de espermátides com núcleos round-H2AvD-RFP positivo e alongando flagelos (seta aberta indica uma estrutura Nebenkern alongando que acompanha o crescente axonema). (E) ponta apical de um cisto de espermátides em fase de canoa adiantado que mostra uma forma nuclear alongado. Os flagelos extensivamente alongado são apenas parcialmente visível. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5 ao vivo imagens de um único cisto de 16 espermatócitos sofrer meiose I ex vivo. Imagens de fluorescência de um cisto na cultura expressando H2AvD-RFP. Descrito são etapas características da meiose I. espermatócitos no quisto passar através divisões meióticas em forma de onda. (A) Cromossoma condensação começa em núcleos em um lado do cisto (2) e progride através do cisto (direcção indicada pela seta ). Núcleos na região oposta (1) representam um estágio anterior de condensação da cromatina, onde as regiões de histonas-densa que marcam os três grandes cromossomos ainda podem ser discernidos. Espermatócitos na região (2) contêm cromossomos totalmente condensados, visíveis como manchas brilhantes, fluorescentes. (B) Após 300; min, os primeiros espermatócitos na região (2) estão na telofase (setas abertas), enquanto continua cromossoma na região de condensação (1) (C) Nos últimos espermatócitos da região (1), os cromossomas (pontas de seta) estão dispostas. na metáfase placa 20 min mais tarde. (D) Dentro de mais 15 minutos, os últimos espermatócitos parecem ter concluído telophase e agora está pronto para submeter a citocinese (setas abertas). Veja também Suplementar barra de vídeo 2 Escala:.. 50 mm Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6 ácido anacárdico inibe o interruptor de histona-to-protamina na testículos pupa cultivadas. Testículos pupais expressi ng H2AvD-RFP e ProtamineB-eGFP e dissecados às 24 h após a formação pupário (FFA) foram incubadas durante 24 horas em meio sem inibidor (controle; A, A ', DMSO, dimetilsulfóxido) ou em meio suplementado com 150 uM de ácido anacárdico ( B, B '). Hub regiões indicadas por asteriscos. (A, B) Não há cistos ProtamineB-EGFP-positivos podem ser observados após a dissecação. (A ') Após 24 horas de incubação, alguns cistos sofreu a histona-se protamina interruptor e ProtamineB-EGFP-positivo cistos (setas abertas) podem ser observadas. (B ') Testículos tratados com ácido anacárdico não desenvolvem cistos ProtamineB-eGFP-positivos. Barra de escala:. 100 mm Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 68 / 51868fig7highres.jpg "width =" 500 "/> Figura 7 ácido anacárdico afeta histonas H4 acetilação ea estrutura da cromatina de espermátides preparações Squash de núcleos spermatid de testículos pupa (24 hr APF) expressando ProtamineB-EGFP incubadas por 24 horas sem inibidor (A – C). Ou com 150 mM de ácido anacárdico (D – F). ADN coradas com corante Hoechst (A e D). Acetilação H4 analisados ​​imunofluorescência (B e E). Presença de protaminas monitorizados com o sinal ProtamineB-eGFP (C e F). Após o tratamento com ácido anacárdico, a cromatina aparece fortemente compactado (D) e o sinal H4 acetilação é completamente reduzida em todas as fases spermatid (E). Além disso, tratadas com ácido a-anacárdicotestículos não apresentam cistos de estágio canoa tarde ou além e nenhum sinal ProtamineB-EGFP (F). Barra de escala:. 10 m Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Suplementar 1 imagiologia video ao vivo através de eGFP e RFP fluorescência do interruptor de histona-a-protamina na testículo pupa crescimento ex vivo. Vídeo de 6 h curso de tempo de imagem ilustra a transição de histona-a-protamina pelo aumento da prevalência de ProtamineB- cistos eGFP positivas. As imagens foram adquiridas a cada 5 min. Para mais detalhes, veja a Figura 3. (Veja "suppl_video_1.MOV" em Downloads). Suplementar Vídeo 2 ao vivo imagens de um único cisto sofrer meiose de 16 espermatócitos I ex vivo. Time-lapse fluorescente de imagem de umcisto em cultura expressando H2AvD-RFP, ao longo de 80 min. Este vídeo mostra as etapas características da meiose I. As imagens foram adquiridas a cada 1 min. Para mais detalhes, veja a Figura 5. (Veja "suppl_video_2.MOV" em Downloads).

Discussion

O protocolo apresentado descreve duas aplicações diferentes com base tanto na capacidade para dissecar os testículos de Drosophila e cistos único de linha germinal numa determinada fase de desenvolvimento e no desenvolvimento ex vivo destas células e tecidos em uma placa de cultura. Uma aplicação é o tratamento farmacológico de processos vitais, durante o desenvolvimento do esperma. É importante ressaltar que este permite o acesso a espermatogênese pós-meiótica que não é facilmente obtido utilizando análises funcionais baseadas na genética da mosca. A outra aplicação é a observação microscópica de vida e desenvolvimento de células germinativas e testículos. Especialmente esta aplicação benefícios da capacidade de células e órgãos de Drosophila em cultura para sobreviver e desenvolver à RT e sob atmosfera normal. Assim, uma imagem de microscópio invertido equipado com um estágio de aquecimento (aquecimento até à temperatura de reprodução padrão de 25 ° C) é suficiente para se obter resultados significativos em experimentos ao vivo por imagem. Maisexistem mais, muitas cepas transgênicas mosca expressando proteínas marcadas em proteínas fluorescentes para imagens ao vivo ou pode ser facilmente estabelecida.

Para obter testículos pupa ou cistos em células germinais de um estágio específico do desenvolvimento, é fundamental que se está familiarizado com o tempo de desenvolvimento da Drosophila. O momento exato para cada estágio pode variar entre laboratórios, condições de cultura e estirpes de voar e deve ser estabelecido empiricamente. Como descrito acima, isso é especialmente importante para os ensaios farmacológicos que, por exemplo, têm como alvo o switch HP. Para estes experimentos, é aconselhável sempre verificar espermatídeos com um sinal ProtamineB-eGFP antes do teste real, porque o inibidor de temporização pode variar um pouco, ainda dentro de uma população.

Seguindo o protocolo acima deve habilitar o experimentador para dissecar testículos de pupa início como órgãos intactos livres do tecido adiposo anexado corpo. Estes testes e, mais ainda, isolado gecistos de linha rm são muito frágeis. Por isso, é fundamental desenvolver a destreza manual ea experiência necessária para manusear e transferência de testículos e cistos com pinças, agulhas e pipetas. Especialmente os estudos que visam o desenvolvimento de células germinativas de pós-meiótica meiose e início iria beneficiar com isso. Embora seja relativamente fácil de dissecar cistos de espermátides final com longa flagelos de testículos de adultos, é difícil a obtenção de fases anteriores. Dissecando esses cistos de testículos pupa início seguindo este protocolo é muito mais eficiente. Tenha em mente que em uma cepa mosca de costume, apenas cerca de 50% das pupas será do sexo masculino. Portanto, prepare-se para dissecar, pelo menos, o dobro pupas como o número de testes necessários. Em alternativa, é possível identificar macho larvas L3 usando um estereomicroscópio, tal como os testículos pode ser identificado como órgãos redondos translúcidas incorporados nos tecidos do corpo gordo laterais da larva intacta 23,34, e recolher em frascos de cultura fresco que podeser usado para escolher pré-pupa para o estadiamento e dissecações. Também é possível identificar macho pré-pupas 35.

Percebemos que ambos os isolados em células germinais cistos e os testículos pupa intactas em cultura são sensíveis à luz, como também já foi relatado anteriormente 18. Esta sensibilidade à luz também pode segurar por alguns compostos químicos utilizados em ensaios farmacológicos. Portanto, é melhor para manter as placas de cultura de um ensaio, no escuro, durante a incubação. Da mesma forma, ao planejar experimentos com imagens de lapso de tempo com testículos em desenvolvimento e, especialmente, cistos isolados, tenha em mente que os tempos de exposição muito longos e / ou taxas de amostragem demasiado elevadas podem inibir ex vivo de desenvolvimento. A taxa de amostragem adequado deve ser determinado experimentalmente.

A infecção bacteriana e / ou fúngica e um excesso de crescimento em placas de cultura representa um problema grave. Placas de cultura infectados com muitas bactérias não suportam ex vivo desenvolvimento dos testículos e cistos. Portanto, o meio de cultura descrito contém penicilina e estreptomicina (ver passo 1.1), mas durante a incubação a longo prazo, estes antibióticos podem ser degradado e pode diminuir a sua actividade. Esta poderia ser uma das razões para o pouco tempo de sobrevivência (max. 72 hr) de cistos cultivadas observados quando se utiliza o protocolo acima. No entanto, esse prazo não poderá ser prorrogado por substituição regular do meio de cultura nos pratos. Conclui-se que outros factores podem influenciar a sobrevivência em cultura, tais como a falta de sinais de crescimento de outros tecidos do trato genital. Por outro lado, o desenvolvimento pós-meiótica é mais rápido do que em Drosophila nos mamíferos. Em Drosophila, espermiogênese leva cerca de 90 horas, eo switch HP tem lugar entre 50 e 60 horas após a meiose 9,12. Assim, o tempo habitual de sobrevivência de cerca de 48 horas alcançado com este protocolo é bem adequado para acompanhar os processos de desenvolvimento cruciais na spermatogenesis, como divisões meióticas ou o switch HP. Embora a contaminação bacteriana ou fúngica pode ser evitado pelo uso de ferramentas limpas e meios de comunicação, o protocolo apresentado não faz uso das condições de trabalho estritamente estéreis porque moscas e voar testículos já contêm bactérias quando criados em condições normais. No entanto, algumas aplicações desta técnica de cultura podem se beneficiar do moscas dissecadas ou mesmo criados em condições assépticas (para protocolos, consulte 17,36,37).

Os ensaios farmacológicos dependem do uso de compostos químicos que actuam como inibidores, activadores ou de várias enzimas. Os compostos comumente usados ​​em tais experiências, muitas vezes diferem muito em sua especificidade alvo. Como vantagem, este oferece o potencial para atingir as classes de enzimas inteiras, por exemplo, com ácido anacárdico p300 inibidores / CBP, PCAF e membros da família MYST de HATs 38. A desvantagem desta situação poderia ser potencial off-alvo ou efeitos citotóxicos induced por tais compostos. Portanto, cada composto utilizado em um ensaio com testículos pupa ou cistos devem ser testados quanto à sua citotoxicidade e efeito específico, em diferentes concentrações. Além disso, pequenas variações nas condições de cultura, concentração de composto ou de actividade, e as variações de permeabilidade celular pode conduzir a variabilidade dos efeitos induzidos. Portanto, é necessário controlar o êxito do tratamento em cada experiência. Por exemplo, quando foi utilizado ácido anacárdico a 150 uM, observou-se ligeira variabilidade na força do fenótipo condensação da cromatina entre e, por vezes, dentro de alguns dos testículos, ao passo que a acetilação da histona H4, foi consistentemente reduzida.

Os ensaios farmacológicos com testículos de Drosophila em cultura foram utilizados para analisar os mecanismos pré e pós-meióticas da espermatogênese 4,12,14,21. Uma vez que é difícil ter acesso a espermatogênese pós-meiótica com ferramentas genéticas para atingir os jogadores com essênciafunções l pré-meióticas e meiose, esta abordagem ex vivo constitui uma alternativa. Além disso, em princípio, o método pode ser adaptado para pulse-chase experiências para seguir o desenvolvimento de células germinativas tratados ao longo do tempo. No entanto, nós ainda não testou essa possibilidade. Fazendo uso de testículos de pupa precoce é uma vantagem em ensaios farmacológicos. Em primeiro lugar, a bainha exterior fina dos jovens testículos pupa (cerca de 24 hr APF) pode permitir a permeabilidade melhorada de compostos químicos. Em segundo lugar, quando se estuda o switch HP pós-meiótica, os testículos pupas dissecadas em 24 horas APF partir da linha de fly Protamine expressando-GFP permitir uma leitura direta de saber se o interruptor HP foi afetado ou não.

Até à data, vários protocolos para a cultura ex vivo de órgãos e tecidos, incluindo os testículos e os cistos de linha de germe de Drosophila têm sido desenvolvidos (por exemplo, ver 4,14,17,20,39,40). O meio de cultura e as condições gerais usadasno protocolo aqui apresentado foram estabelecidos em 1979, 17. sistema de cultura foi mais tarde adaptado para visualização in vivo do mecanismo de individualização em cistos pós-meióticas final isoladas de testículos adultos 4. Anteriormente, relataram que estas condições também apoiar a sobrevivência e diferenciação de meiose e as células germinais pós-meióticas primeiros em seus cistos por cerca de 48 horas 12. Em contraste com outros sistemas de cultura de 19 a temporização do desenvolvimento observado nestas culturas foi de aproximadamente consistente com o tempo determinado a partir de amostras fixas (para mais detalhes, ver 12). Sinais de fluorescência H2AvD-RFP e de protamina-GFP pode ser utilizado para visualizar a morfologia e composição da cromatina nuclear das células germinais em cultura. Descobrimos que para a identificação clara dos estágios de desenvolvimento da cultura, isso é vantajoso em relação a outros critérios, como enrolando de cistos. É importante ressaltar que o protocolo apresentado não envolve adição de fly extalém do soro fetal bovino ract factores de crescimento ou outros. Além disso, mostramos aqui que as condições sejam compatíveis com a microscopia de fluorescência de imagem de divisões meióticas ex vivo na cultura. As imagens podem ser obtidas com resolução razoável em um meio fácil de usar que suporta o desenvolvimento de longo prazo. Isto está em contraste com os protocolos que permite observações a curto prazo (cerca de 3 horas) em Voltalef óleo 41,42.

Os procedimentos acima descritos para o cultivo e tratamento farmacológico da testículos pupa e individuais germinativas masculinas cistos são facilmente adaptáveis ​​a muitos genética, epigenética, célula biológica, ou questões de desenvolvimento que pode ser pesquisado em Drosophila espermatogênese. Isso inclui principalmente pesquisa com foco em células-tronco germinativas. Foi demonstrado que o desenvolvimento das células estaminais pode ser seguido por meio de imagens ao vivo de adulto cultivadas testículos 20,43. No entanto, o movimento peristáltico do testículo madura bainhah interfere na aquisição de imagem. Portanto, ou de imagem é feita usando testes fragmentados 43 ou o número de experimentos de imagem realizados tem que ser aumentada para dar conta perdidos conjuntos de dados 20. Testículos pupa precoce (24 horas APF) ainda não está fechado com células musculares. Mesmo um pouco mais velhos (36-45 testículos hr APF) parecem mostrar alguns movimentos peristálticos (comparar Figura 3 e vídeo Suplementar 1). Assim, o cultivo de jovens testículos pupa como órgãos intactos poderia servir como uma alternativa.

Além disso, uma vez dominada, a capacidade de dissecar testículos pupa e, eventualmente, isolados em células germinais cistos permitirá novas aplicações usando cistos simples como fonte de uma homogênea, embora pequena população de células. Por exemplo, é assim possível realizar a RT-qPCR para analisar a regulação da transcrição de genes específicos em fases definidas da espermatogénese, como já foi demonstrado <sup> 15.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors wish to thank T. Noguchi for helpful advice on the initial establishment of the culture technique in our laboratory. Research in the lab of R. R.-P. was funded by the DFG within the international collaborative research center TRR81.

Materials

Anacardic acid Merck Millipore 172050 brand: Calbiochem (EMD Millipore)
Anti-acetyl-Histone H4 Merck Millipore 06-598 brand: Upstate
AxioCam MRm  Zeiss
AxioObserver.Z1 inverted microscope Zeiss
Dimethyl sulfoxide Sigma D8418
Dumont 5-Inox forceps Dumont multiple suppliers
Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated Sigma F4135
Fiber optical  illuminator multiple suppliers
Glass Bottom Microwell Dishes MatTek P35G-1.5-14-C
goat anti-rabbit IgG (H+L)-Cy5 Dianova 711-175-152
Hoechst Sigma B1155
Inoculation loop or pin holder multiple suppliers
Austerlitz INSECT PINS stainless steel needles, size 0 Plano GmbH N5018 In our hands both these pin sizes worked well in the dissections. The minutiens are less rigid but have a smaller tip diameter.
Austerlitz INSECT PINS stainless steel minutiens, diam. 0.1 mm Plano GmbH N5014
Multiwell plates, 24-wells Becton Dickinson 351147 brand: Falcon
Pen Strep invitrogen 15070 brand: Gibco
Shields and Sang M3 Insect Medium Sigma S8398
Stemi SV6 binocular Zeiss
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Riferimenti

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Gärtner, S. M. K., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment. J. Vis. Exp. (91), e51868, doi:10.3791/51868 (2014).
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