JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Ex vivo cultuur van Drosophila Pupal testis en Single Man Germ-lijn Cysten: Dissection, Imaging, en farmacologische behandeling

Published: September 11, 2014
doi:
10.3791/51868
, , ,
1Fachbereich Biologie, Entwicklungsbiologie,Philipps-Universität Marburg, 2Institut für Molekularbiologie und Tumorforschung,Philipps-Universität Marburg

Summary

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

Abstract

Tijdens de spermatogenese bij zoogdieren en in Drosophila melanogaster, mannelijke kiemcellen ontwikkelen in een reeks belangrijke ontwikkelingsprocessen. Dit omvat differentiatie van een stamcel populatie mitotische amplificatie en meiose. Bovendien, post-meiotische kiemcellen dramatische morfologische omvorming proces als een globale epigenetische herconfiguratie van de kiembaan chromatine-de histon-to-protamine switch ondergaan.

Het bestuderen van de rol van een eiwit in post-meiotische spermatogenese middels mutagenese of andere genetische hulpmiddelen wordt vaak belemmerd door essentiële embryonale pre-meiotische of meiotische functies van het eiwit onderzocht. De post-meiotische fenotype van een mutant van een dergelijk eiwit kon worden verduisterd door een eerdere ontwikkelingsstoornissen blok, of de interpretatie van het fenotype kan worden bemoeilijkt. De modelorganisme Drosophila melanogaster biedt een bypass voor dit probleem: intact testes enzelfs cysten van kiemcellen ontleed vanuit vroege poppen kunnen ontwikkelen ex vivo in kweekmedium. Door gebruik te maken van dergelijke culturen maakt microscopische beeldvorming van levende kiemcellen in de testes en de kiem-lijn cysten. Belangrijk is dat de gecultiveerde testes en kiemcellen ook toegankelijk voor farmacologische remmers te worden, waardoor het toelaat manipulatie van enzymatische functies tijdens de spermatogenese, waaronder post-meiotische stadia.

De gepresenteerde protocol beschrijft hoe te ontleden en te cultiveren pupal testes en de kiem-lijn cysten. Informatie over de ontwikkeling van popstadium testes en kweekomstandigheden worden voorzien langs microscoop beeldgegevens levende testes en kiemlijn cysten in kweek. We een farmacologische test om post-meiotische spermatogenese, geïllustreerd door een test gericht op de histon-to-protamine switch met behulp van de histonacetyltransferase remmer anacardic zuur studeren beschrijven ook. In principe zou deze teeltwijze worden aangepast aan vele pakken other onderzoeksvragen in de pre-en post-meiotische spermatogenese.

Introduction

De ontwikkeling van mannelijke kiemcellen veel soorten een sequentieel proces. Het wordt gekenmerkt door een reeks van cruciale gebeurtenissen die culmineert in de vorming van morfologisch en epigenetisch zeer gespecialiseerde spermatozoa. In Drosophila melanogaster, kiembaan stamcellen op het puntje van de testis kloof asymmetrisch aanleiding te geven tot een nieuwe stamcel en de spermatogonium, dat wil zeggen, de dochter cel die zich inzet voor differentiatie (zie figuur 1 voor een overzicht) geven 1,2 . De spermatogonium ondergaat vier ronden van mitotische delingen en met het begin van meiose, een fase van indrukwekkende groei en transcriptionele activiteit genoemd spermatocyte fase. De cellen afkomstig ve spermatogonium blijven met elkaar verbonden en ontwikkelen als een gesynchroniseerde bundel omwikkeld met twee somatische cellen-structuur aangeduid als een cyste. Na voltooiing van meiose, de morfologie van de mannelijke kiemcellen vollediggereorganiseerd (schematisch weergegeven in figuur 1). Aanvankelijk ronde spermatiden verlengen om de hydrodynamische hoofd structuur te vormen, en het flagellum ontwikkelt. Uiteindelijk worden de zaadcellen van elkaar gescheiden door een complex, apoptose-gerelateerde mechanisme dat individualisering 3-5.

In veel species, waaronder Drosophila melanogaster en zoogdiersoorten, de morfologische veranderingen van de kiemcellen vergezeld door een opmerkelijke epigenetische herschikking van de haploïde mannelijke kiemlijn chromatine genoemd histon naar protamine (HP switch) 6 – 9. Mogelijk bijna alle canonische histon en vele histon-variant moleculen gestript van het DNA en worden door kleine basische eiwitten, de protamines, resulteert in de zeer compacte nucleoprotamine specifiek voor het chromatine van rijpe zaadcellen. Algemene kenmerken van de HP switch zijn thij vervangen van canonieke histonen eerst door histon varianten, vervolgens door overgangsregeling eiwitten, en ten slotte door protaminen. Dit alles gaat gepaard met verschillende wijzigingen epigenetische markeringen, zoals een stijging acetyleringsgehalten van histone H4 net voor histon verwijderen 7,10 – 12.

De meeste, zo niet alle, van de bovengenoemde werkwijzen zijn essentieel voor de ontwikkeling van rijpe, volledig vruchtbaar sperma. Dit geldt niet alleen in Drosophila maar ook bij mensen, zoals zoogdieren spermatogenese aandelen een aanzienlijke overeenkomst met de ongewervelde systeem 1,8,9. Studeren mannelijke kiemcel ontwikkeling wordt aanzienlijk vergemakkelijkt in het Drosophila model systeem. Vliegen zijn genetisch zeer toegankelijk. De generatie van de mutanten, alsmede de oprichting van vlieg stammen die fusiegenen of RNA interferentie constructies kost weinig moeite. In de studie van post-meiotische spermatogenese, het gebruik van mutanten eend eenvoudige genetische hulpmiddelen kunnen een limiet bereikt. In Drosophila spermatogenese, transcriptie stopt bijna volledig met de intrede op meiotische delingen. Aldus wordt na meiose spermatogenese voornamelijk gebaseerd op translationeel onderdrukt en opgeslagen mRNA gesynthetiseerd in een uitgebreid meiotische profase 13-16. Daarom tools als RNA interferentie of het gebruik van niet-conditionele mutanten zijn niet geschikt voor het bestuderen van specifieke post-meiotische rol van genproducten die ook aan essentiële functies in pre-meiotische of meiose kiemcelontwikkeling.

Een voordeel van Drosophila dat in dergelijke gevallen kunnen misbruikt is het vermogen van ontleed intact testes en zelfs cysten van kiemcellen ontwikkelen ex vivo in kweekmedium 4,12,17 – 20. De dissectie en de teelt van testes of kiem-lijn cysten maakt niet alleen microscopische observatie van de kiem-cel ontwikkeling in levende cellen, maar eenLSO het gebruik van farmacologische testen met, bijvoorbeeld, remmers van enzym-complexen zoals histon acetyltransferases (HAT), histondeacetylasen (HDAC), topoisomerases, of het proteasoom. Aldus is het mogelijk enzymatische functies manipuleren tijdens post-meiotische spermatogenese en de ontwikkelingsresultaten volgen ongeacht embryonale pre-meiotische of meiotische functies 4,12.

In farmacologische testen we eerder geanalyseerd acetylering-afhankelijke lokalisatie van een bromodomain eiwit gedurende meiotische profase en de relevantie van histonacetylering niveaus voor de epigenetische HP switch in post-meiotische spermatogenese door bepaalde inhibitoren gericht HATs en HDAC 12,21. Gericht op de HP switch in deze testen werd mogelijk gemaakt door het gebruik van een vlieg stam die de fusiegenen histone2AvD-RFP en protamineB-eGFP 12,22 in de endogene patronen uitdrukt, en de constatering datde eerste spermatiden in pupal testes passeren de HP switch tussen 24 en 48 uur APF 12.

De gepresenteerde protocol beschrijft de dissectie van de testes en cysten van Drosophila poppen, de kweekomstandigheden, en een farmacologische test met intacte pupal testes. Voor dit doel worden pupal testes bij ongeveer 24 uur na puparium vorming (APF) ontleed (zie figuren 1 en 2). Op dit moment hebben de testes geen verbindingen naar andere weefsels gemaakt en zijn omgeven door slechts een dunne buitenmantel, die betere penetratie toelaat van de inhibitor verbindingen 23,24. De testes bonen- of peervormig organen die in cultuur gemakkelijk kan worden genomen. Deze testes ontleed, gekweekt en behandeld met specifieke inhibitoren. Vervolgens, het effect van de remmers worden gevolgd met immunofluorescentie analyses en fluorescentie microscopie van fusie-eiwit expressie, en vergelijking van de nucleaire Morphollogie van de behandelde kiemcellen onbehandelde kiemcellen. De in dit protocol het toelaat ook live imaging van het ontwikkelen van testes en de kiem-lijn cysten in de cultuur.

Protocol

Ethiek statement: De in dit protocol beschreven experimentele procedures omvatten uitsluitend te werken met Drosophila melanogaster en zijn niet onderworpen aan het dierenwelzijn wetten in Duitsland. 1 Voorbereiding van de Media, Tools en Flies Bereid bewerkt commercieel verkrijgbaar in poedervorm M3-groei medium zonder kalium bicarbonaat 17. LET OP: Irriterend voor de ogen en de huid. Vul het medium met 10% foetaal bovien serum, 100 U / ml penicilline, en 100 ug / ml streptomycine. Gebruik hitte-geïnactiveerd en insect-cultuur-geteste foetaal serum voor het beste resultaat. Filtreer de volledige medium (aangeduid als medium bedoeld) door een 0,2 urn fles-top filter en bewaar in monsters bij -20 ° C. Voor het gebruik, filter (0,2 um spuit filter tip) het medium opnieuw om neerslagen te verwijderen. Bereid voorraadoplossingen inhibitor voor de farmacologische assays. Dissolve de chemische stoffen in de juiste oplosmiddel en op te slaan in porties. Bijvoorbeeld, bereiden een voorraad oplossing van 28,69 mM anacardic zuur (LET OP: Irriterend voor de ogen en de huid) in dimethylsulfoxide. Bereid gereedschappen voor de verstoring van de ontleed pupal testes en dissectie van enkele cysten. Gebruik twee scherp en stijf naalden, in plaats van een pincet. De capillaire kracht die ontstaat tussen de twee takken van een pincet wordt de ontleding van enkele cysten in kleine hoeveelheden drager zeer moeilijk. Gebruik bijvoorbeeld de punt van een roestvrij stalen insect pin ingebracht in een inenting lus houder. Om doeltreffend leeftijd poppen, zaad ca. 10 grote kweek flacons (buizen met diameter 4 cm) te verkrijgen met een voldoende aantal volwassen vliegen (ca. 40-60 vliegen). Om de HP switch te analyseren, gebruiken vliegen die H2AvD-RFP en ProtamineB-eGFP in hun endogene patroon 12,16,22. Incubeer de buisjes onder standaard omstandigheden bij 25, ° C gedurende ongeveer 4-5 dagen tot derde instar larven kruipen en beginnen verpopping op de wanden van de buisjes 25. 2 Markering of Collecting White Pre-poppen te verkrijgen 24-uur-oude poppen voor Dissection Om de invloed van bepaalde chemicaliën op de HP switch testen ontleden pupal testes bij ca. 24 uur APF 12. Om geënsceneerd poppen te verkrijgen, nemen de voorbereide fly cultuur flacons met verpoppen de larven (zie paragraaf 1.4) en het identificeren als vele witte pre-poppen mogelijk. Pre-poppen tijdens de allereerste stap in verpopping verschijnen als onbeweeglijk, niet-voeding, in plaats van verkorte larven met omgeslagen siphonen en witgekleurde puparium. De puparium wordt tan-bruin binnen 30 tot 60 min, waarbij de volgende fase van ontwikkeling pupal 26 aangeeft. Markeer de posities van de pre-poppen met een permanente marker op de buitenkant van de flesjes. Incubeer de flesjes bij 25 ° C gedurende ca. 24 uur. Als alternatief,kies de pre-poppen van de kant van de vaatjes met een kleine borstel bevochtigd met PBS buffer. Daarna brengt de pre-poppen aan de zijkant van een verse 50 ml reageerbuis en incubeer bij 25 ° C gedurende ca. 24 uur. 3 Dissectie van Pupal testes bij ca. 24 uur na puparium Vorming Verdeel enkele druppels (ca. 80 pl elk) van medium op een 10 cm plastic celkweek of petrischaal. Met behulp van een brede pincet of een borstel bevochtigd met medium, kies de poppen aan het 24 uur APF etappe van de bebroede flacons (zie paragraaf 2). Transfer een pop aan elke druppel medium op de schotel. Voor de dissectie, gebruik dan een stereo-microscoop voorzien van een glasvezel-verlichting. Laat de testes bovenstaande RT niet verwarmen tijdens de dissectie als dit zou kunnen voorkomen dat een goede ontwikkeling in de cultuur. Ontleden poppen met twee paar No. 5 pincet. Met een paar, pak de pop in zijn meest posterieuredeel (de achterste siphonen) en houd deze vast. Pak de voorste siphonen met de andere pincet en open het popstadium operculum aan zijn voorste einde. Verwijder het popstadium tot ten minste een deel van de thorax wordt blootgesteld. Doorgaan met de pop in positie te houden door zijn meest achterste einde. Om de interne druk van de pop los, steek beide armen van een pincet in het hoofd gebied van de pop. Rip de pop geopend door het openen van de tang en het bewegen van de tang in de voorste richting. Zorg ervoor dat de opening gegenereerd met deze beweging is zo groot mogelijk in de eerste poging. Voorkom beschadiging van de pop op zijn achterste einde voordat de druk is vrijgegeven, omdat dit zou kunnen resulteren in de testes wordt rechtstreeks door de kleine opening geduwd en meestal wordt verstoord. Merk op dat wanneer de pop wordt geopend, de vrijgekomen interne druk van de pop drukt uit agglomeraten van dik lichaam cellen en weefsels door de laRGE opening in het hoofdgebied. Controleer of de pupal testes hebben reeds uit de pop met dit materiaal zijn geduwd; dit in sommige gevallen. De testes zijn niet aangesloten op een ander weefsel na 24 uur APF en dus gemakkelijk zou worden verdreven uit de pop 23. Vermijd knijpen de pop met de tang, omdat dit de testikels kunnen beschadigen als ze in de pop blijven. De grootte van de opening via een paar pincetten. Houd dan de pop in zijn meest achterste einde. Sluit de andere pincet en voorzichtig streak uit de inhoud van de pop van posterior naar anterior de testes los van de pop. Verzamel de testes door ze in een voorgesneden 200 ul pipetpunt trekken. Probeer slechts een zeer kleine hoeveelheid medium dragen aan het aantal vet lichaamscellen overgedragen met testes verminderen. Plaats de testes in medium in een verse cultuur schotel. Was de testes meerdere malen met medium tot slechts weinig vet lichaamscels blijven. Voor live imaging, overdragen testes een glazen bodem cultuur schotel met medium en gebruik een omgekeerde imaging microscoop. Voor farmacologische testen, gaat u verder met stap 5. 4 Dissectie van Male Germ-lijn cysten en Live-Imaging Transfer van een of meer pupal testis een glazen bodem cultuur schotel. Gebruik een stereo-microscoop met glasvezel-verlichting en twee roestvrijstalen naalden (zie paragraaf 1.3) voor de dissectie van de mannelijke kiembaan cysten. Met een naald voorzichtig proberen vast te pinnen een testis bij zijn voorste of achterste einde. Houd deze vast. Steek de andere naald in de testis en verstoren de testis schede door het bewegen van de naald zijwaarts. Veel van de cysten zullen worden vrijgegeven de testis van deze beweging. Blijf de testis in positie te houden met een naald. Zachtjes streak uit de resterende cysten van de testis met de andere naald. Aparte geaggregeerd cysten hetzij door gently verplaatsen van een naald zijdelings door de cluster van cysten of door overdracht van de cysten een nieuwe kweekschaal met medium met 200 ul pipetpunt. Verplaats de cultuur schotel op een omgekeerde imaging microscoop voor live-beeldvorming van enkele cysten. Verspreiden cysten opnieuw met een naald indien nodig. Bepaal de fase van de cysten door fase-contrast en fluorescentie microscopie. Focus op een cyste van de gewenste fase. Bevestig focus en positie van de cyste vaak gedurende langere imaging experimenten, omdat de cysten niet houden aan de onderkant van de cultuur schotel en dus de neiging te zweven onscherp. OPMERKING: de schaal met poly-L-lysine voor immobilisatie Coating is nadelig voor de ontwikkeling van vroegtijdige kiemlijn cysten. In plaats daarvan kunnen individuele cysten worden geïsoleerd. Met enige oefening, is het mogelijk om enkel een bepaald cyste door zachtjes duwen met de naald. Hierdoor wordt de overdracht van enkele cysten aparte sekte toeure gerechten met een glas Pasteur pipet met een uitgesponnen tip die past in het gezichtsveld van de microscoop. De geïsoleerde cysten kan dan eenvoudig worden verplaatst in de kweekschalen zelfs na langdurige incubatie. 5 FARMACOLOGISCHE Assay met Intact Pupal Testikels Vul elk putje van een 24-well celkweek plaat met 500 ul van medium voor een experiment van 12 duplo's. Transfer ene pupal testis aan elk putje, met behulp van een pre-cut 200 ul pipet tip. Controleer de aanwezigheid van protamines in geïsoleerde testes behulp van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop. De testes moeten vrij zijn van ProtamineB-eGFP signaal, dat aangeeft dat de HP switch niet heeft plaatsgevonden in een van de cysten zijn. Vervang testes die al tonen ProtamineB-eGFP-positieve cysten. De eerste 12 putjes, voeg 500 pl medium bevattende verdunde remmer verbinding (anacardic zuur) om de gewenste eindconcentratie te bereiken(150 uM) in 1 ml medium per putje. Gebruik de overige wells als onbehandelde controles; voeg 500 ul van medium met dezelfde hoeveelheid oplosmiddel gebruikt bij de remmende verbindingen. Opmerking: Als veel verschillende verbindingen en oplosmiddelen worden gebruikt, kan het efficiënter medium alleen als controle en de invloed van toenemende concentraties oplosmiddel in afzonderlijke experimenten getest. Incubeer de plaat bij 25 ° C gedurende 24 uur in het donker. Controleer opnieuw de aanwezigheid van protamines in de geïncubeerde testes zoals hierboven beschreven. De controle testes moet nu een of meer ProtamineB-eGFP-positieve cysten, die de overgang via de HP switch aangeeft. Met behulp van een pipet met een 200 ul tip, breng de testes poly-L-lysine-gecoate glaasjes, maak squash preparaten en vlek met geschikte fluorescente antilichamen zoals elders beschreven 12,27,28.

Representative Results

De testis in Drosophila mannen is al gevormd in het embryo en volhardt in de lichaamsholte tijdens de larvale stadia. Derde instar larven toon kleine, ronde testes omgeven door een laag van toekomstige pigmentcellen en ingebed in vet lichaamsweefsel (Figuur 2A). Testes in mannelijke volwassen vliegen zijn lange, opgerolde buizen, die onder een laag spiercellen afkomstig uit het genitale schijf en een pigmentlaag 24. Interessant larvale testes bestaan ​​uit kiemlijn cellen van pre-meiotische en meiotische stadia totdat de primaire spermatocyte fase, die overeenkomt met meiotische profase (zie ook figuur 1) 23. De eerste cohorten van de mannelijke geslachtscellen passeren meiose tijdens puparium vorming. Op ca. 24 uur APF, zijn post-meiotische stadia met langwerpige flagellen reeds ontwikkeld, en al kernen bevatten histon H2AvD-RFP (figuren 1 en 2B). Geen van de spermatiden hebben t ondergaanHij HP switch als no ProtamineB-eGFP signaal kan worden gedetecteerd door fluorescentie microscopie (figuur 2C). Vaak, de testes ontleed in dit stadium bevatten een auto-fluorescerende structuur van variabele omvang denken aan een agglomeraat vet lichaamscellen of een tot verscheidene druppels olie (figuur 2C, pijlpunt). Deze structuur binnen de testis is zichtbaar met fase-contrast microscopie. Tot op heden hebben we niet gevonden een beschrijving van de aard ervan in de literatuur. Testes ontleed bij 36 uur APF lijken langwerpig en in sommige gevallen al beginnen te krullen (figuur 2D). Ze hebben al naar de weefsels van de voortplantingsorganen groeit uit de genitale imaginale schijf 23,24 bevestigd. Bovendien bevatten ze vaak de eerste zaadcellen buiten de HP schakelaar, zoals aangegeven door de ProtamineB-eGFP signaal (figuren 1 en 2D, pijl). Na 48 uur APF, de teelballen hebben verder langwerpig en duidelijk beginnen curling bij deproximale uiteinde. Verschillende kiem-lijn cysten met protamine-positieve kernen zichtbaar worden (figuur 2E, pijl). Bij testes ontleed bij 24 uur APF in kweek worden gehouden voor 24 uur, ze langwerpig zoals in intacte fly (vergelijk figuur 2D en 2E figuur 6A). Dit is mogelijk door een gebrek aan positionele en groeisignalen gewoonlijk verzonden vanaf de ontwikkeling genitale tractus gesprek met de testis bij zijn achterste uiteinde 23,29. Bovendien is de spierlaag van de testis schede niet ontwikkelen omdat ontluikende myotubes niet kunnen migreren van de genitale disc naar de testis 24. De testis schede-in deze situatie alleen het dunne laagje pigment-lijkt niet voldoende te groeien in cultuur aan de toename van het aantal te ontwikkelen kiemcellen binnen envelop. Maar de kiemcellen groeien, delen, en onafhankelijk van de testis schede differentiëren. Vandaar dat, na meer dan 36 uurr in de cultuur, zal het begin van de testes vaak barsten open, en de verdere ontwikkeling is niet waargenomen. Echter, binnen een korter tijdsbestek, is het mogelijk om time-lapse ex vivo live beelden van hele testes ontwikkelen in cultuur te nemen, zoals blijkt uit de figuren 3A -3 C (zie ook Aanvullende video 1). Een pupal testis, ontleed op ca. 45 uur APF, werd geïncubeerd in medium voor 6 uur en in beeld gebracht om de 5 minuten. Binnen dit tijdsbestek, meerdere cysten van spermatiden komen uit de HP switch podium en laten een lichte ProtamineB-eGFP signaal (figuren 3A '-3 C open pijlen). Zoals hierboven vermeld, mannelijke zaadcellen in Drosophila testis ontwikkelen gesynchroniseerde bundels van onderling verbonden cellen, genaamd cysten 1. Figuur 4A toont een overzicht van cysten ontleed uit een popstadium testis ongeveer 24 uur APF. Pre-meiotische stadia, Meiotische stadia, vroege post-meiotische stadia, en ook cysten in de vroege kano podium met langwerpige kernen voor de HP switch kan worden gevonden (figuren 1 en 4B -4 E). De geïsoleerde cysten zijn zeer kwetsbaar en moet voorzichtig behandeld worden. De twee somatische cellen die enveloppe de cyste te vormen eenvoudig mechanisch verstoord. Kiemlijn stamcellen hebben het vermogen om te overleven en blijven delen na genetische ablatie van de somatische cellen in vivo cyste 30. Er is beschreven dat in vitro, kiemcellen van de 16-cellig stadium gescheiden van hun somatische envelop verder te ontwikkelen en differentiëren 19. Inderdaad, merkten we in onze cultuur systeem dat vermoedelijk eind spermatocyten afgerond meiotische delingen met verstoord cyste cellen, zij het zeer zelden. Meestal echter verstoord cysten opgehouden ontwikkeling. Naar aanleiding van de gepresenteerde protocol, intact cysten zou in sommige gevallen devElop ex vivo in kweekmedium voor maximaal 72 uur. Echter waargenomen dat een redelijk aantal cysten overleven tot 48 uur incubatie. Binnen dit tijdsbestek, de gekweekte cysten kunnen ontwikkelen vanuit de primaire spermatocyt fase tot na meiotische delingen, alsmede van de ronde kernen podium met-histon gebaseerd chromatine tot in de late kano stadium verder dan de HP-schakelaar 12. Dit maakt levende beeldvorming van vitale processen in spermatogenese, bijvoorbeeld, spermatocyten invoeren meiotische delingen (Figuur 5 en brief 2 video). Voor dit experiment de RFP gelabeld histon variant H2AvD werd als chromosoommerker. De primaire spermatocyt fase strekt zich uit over ca. 3 dagen in vivo 31. Teneinde te meiotische delingen nemen, kozen we cysten met spermatocyten die zichtbaar begonnen chromatine condensatie (figuur 5A gebied 2). Meiotische deling begint in spermatocytenaan een zijde van de cyste en vervolgens volgt een golf in de resterende spermatocyten (figuur 5A van regio tot regio 2 1, zie ook brief 2 video). Condensatie van het chromatine leidt al snel tot snel bewegende chromosomen die zichtbaar als heldere vlekken (figuur 5A, regio 2) zijn. Na 30 min, de eerste spermatocyten deze regio reeds telophase (figuur 5B, pijlpunten). De chromosomen van de jongere regio 1 te regelen bij de metafaseplaat 20 min later (figuur 5C). Ze compleet telofase en zijn klaar ongeveer 15 min later (Figuur 5D) aan cytokinesis ondergaan. Anafase telofase en cytokinesis duurde ca. 10 min in deze opname (Aanvullend 2 video). In zoogdieren, evenals in Drosophila, een uitgesproken toename van histon H4 acetylering markeert het begin van histon verwijderen en de HP switch tijdens post-meiotischespermatogenese 6,11. Men heeft voorgesteld deze epigenetische modificatie essentieel onderdeel of zelfs trekker van het ontwikkelingsprogramma van de HP schakelen 10,32. Eerder behandelde we Drosophila pupal testes in cultuur met inhibitoren gericht hoeden en HDAC's aan de acetylering niveau van histon H4 beïnvloeden tijdens post-meiotische stadia 12. In deze farmacologische assays, we vonden dat histonacetylering essentieel is voor de progressie van spermatogenese van graden met histon gebaseerde chromatine de fasen met protamine gebaseerde chromatine. Figuren 6 en 7 tonen representatieve resultaten van farmacologische test met behulp anacardic zuur HATs in pupal testes richten. Testes bij 24 uur APF werden ontleed vanuit een vlieg stam die H2AvD-RFP en ProtamineB-eGFP. ProtamineB-eGFP eiwit afwezig is in deze eerste pupal testes (Figuur 6A en B). Na 24 uurr in cultuur, de controle testes bleek ProtamineB-eGFP signalen, waaruit blijkt dat de eerste cysten voorbij de HP schakelaar (figuur 6A 'open pijlpunten) had ontwikkeld. Dit was niet het geval bij de testes behandeld met 150 uM anacardic acid (figuur 6B). Testis squash voorbereidingen en immunofluorescentie analyses bieden meer gedetailleerde informatie (figuur 7). In de onbehandelde controle, kunnen de kernen van de relatief grote primaire spermatocyten te herkennen aan de karakteristieke patroon van drie regio rijk gekleurd DNA, die overeenkomen met grote chromosomen (4C niveau) van Drosophila (figuur 7A, kolom 1). Acetylering van histone H4 duidelijk detecteerbaar in dit stadium (figuur 7B, kolom 1). De eerste fase na meiotische delingen bekend als Nebenkern podium en wordt gekenmerkt door vrij grote, ronde kernen (zie figuur 4C, niet in Figuur 7 getoond). De volgende stap is getoond in figuur 7 wordt geïdentificeerd door flagellaire groei en de ronde vorm van de kiem celkernen, die al veel kleiner dan in eerdere fasen (figuur 7A, kolom 2) en zeer lage dichtheid bijna ondetecteerbare niveaus van histon H4 acetylering (Figuur 7B, kolom 2). De ronde vorm verlengt dan (figuur 7A, kolom 3), en acetylering van histone H4 weer duidelijk detecteerbaar (Figuur 7B, kolom 3). De zaadcellen bereiken dan de kano vorm fase waarin de HP omschakeling plaatsvindt en histonen vervangen door protamines (figuren 7A – 7 C, kolommen 4 en 5). Na de kano stadium de protaminated kernen dan verder verlengen in een zeer dunne naald vorm in het rijpe zaad (hier niet afgebeeld). Testis squash voorbereidingen van testes behandeld met anacardic zuur lieten verschillende resultaten (figuren 7D </ Strong> – 7 F). De chromatine in kiemcellen behandeld met anacardic zuur leek meer gecondenseerd dan die van de onbehandelde controle (vergelijk figuur 7D, behandelde en 7A, controle). Immunofluorescentie analyses bleek dat acetylering van H4 sterk werd verminderd of zelfs afwezig in kernen van geslachtscellen behandeld met anacardic zuur (Figuur 7E). Het is bekend dat sterk geacetyleerde histonen geassocieerd met gebieden open chromatine, maar chromatine gebieden die histonacetylering gebrek vertonen vaak een repressieve structuur 33. Daarom is het niet verwonderlijk dat de behandeling met anacardic zuur beïnvloed de chromatine structuur van de behandelde kiemcel kernen. Belangrijker nog, geen protamine-positieve kernen van late kano podium of daarbuiten werden geïdentificeerd in behandelde testes (Figuur 7F). Aldus onze gegevens consistent met het idee dat HAT activiteit essentieel is voor spermiogenese om weer doorgaanm histon-gebaseerde chromatine naar protamine gebaseerde chromatine fasen. Figuur 1 Overzicht van Drosophila spermatogenese. Het linker paneel toont de volgorde van de fasen in de kiem-cel ontwikkeling van een stamcel tot geïndividualiseerde sperma. Schematische tekeningen tonen de kenmerkende nucleaire morfologie van de kiemcellen. Een spermatogonium verdeelt tot 16 onderling verbonden spermatocyten produceren in een cyste. Tijdens deze fase meeste transcripten die nodig zijn voor post-meiotische ontwikkeling geproduceerd, translationeel onderdrukt en opgeslagen. Het grootste deel van de transcriptie-activiteit eindigt met het binnenbrengen in de meiotische delingen. De histon naar protamine schakelaar in de chromatine plaatsvindt tussen de vroege en late fase kano. Podia met een histon-gebaseerde chromatine zijn hoogverlicht in rood; fasen met een protamine gebaseerd chromatine zijn groen gemarkeerd. De bars in het rechter paneel geven de stadia van kiemcellen die normaal kan worden gevonden in het ontwikkelen van testis in larven, poppen op ca. 24 en 36 uur na puparium vorming (APF), en volwassen vliegen. Figuur 2 Drosophila testes in verschillende stadia van ontwikkeling. (A) Fase-contrast beeld van een enigszins geplet geheel-mount testis van een derde-instar larve (L3). Alleen pre-meiose en meiotische stadia kan worden gevonden. Spermatogonia zijn beperkt tot het voorste punt onder de hub regio (asterisk). De resterende testis is gevuld met spermatocyten (open pijl) Fase-contrast beeld van een enigszins geplet testis op ca.. (B) 24 uur na puparium vorming (APF). Naast spermatocyten (open pijl), de testis bevat spermatiden in de Nebenkern fase (open pijlpunten), met ronde kernen en spermatiden in het verlengen van stadia met het kweken van flagellen (dubbel geopend pijlpunt) (C – E). Whole-mount pupal testes uiten H2AvD-RFP en ProtamineB-eGFP (overlays van fase-contrast en eGFP en RFP fluorescentie beelden). (C) Pupal testis ontleed op ca. 24 uur APF. Pijlpunt markeert auto-fluorescentie van vermeende vet lichaamscellen. D) Pupal testis ontleed bij ongeveer 36 uur APF geeft de eerste ProtamineB EGFP-positieve cyste (pijl). (E) Pupal testis bij ca. 48 uur APF een groep ProtamineB-eGFP-positieve cysten (pijl). In alle figuur delen, sterretjes geven de naaf regio. Schaal bars: 100 micrometer.ank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 3 live beeldvorming van de histon-to-protamine switch in een pupal testis groeiende ex vivo. (A) Fase-contrast beeld van een pupal testis uiten H2AvD-RFP en ProtamineB-eGFP in cultuur genomen op ca. 45 uur na puparium vorming (APF). De zaadblaasjes wordt aangegeven door een pijl gevuld. A paragonium (dubbele pijl) altijd aan de testis. (A) eGFP en RFP fluorescentie van de in (A) testis. De open pijl markeert een ProtamineB-eGFP-positieve cyste. Schaalbalk:. 100 micrometer (B) Na 2 uur en 30 minuten in de cultuur, diverse andere cysten (open pijl) ontstaan ​​frOM de histon-to-protamine transitie. (C) Na nog ca. 3 uur in cultuur, dus een totaal van 5 uur 29 min in kweek, een groep cysten (open pijl) met sterke ProtamineB-eGFP signaal zichtbaar aan het proximale uiteinde van de testis. Zie ook Aanvullende video 1. In alle figuur delen, sterretjes geven de hub regio. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 4 Geïsoleerde cysten van kiemcellen in verschillende stadia van ontwikkeling. (A) cysten ontleed uit een testis bij ca. 24 uur na puparium vorming (APF). Overlay van de fase-contrast en H2AvD-RFP fluorescentie (rood) beelden. Schaal bar: 100 micrometer.(B – E) vergrotingen van enkele cysten van de verschillende stadia. Overlay van differentieel interferentie contrast (DIC) en H2AvD-RFP fluorescentie beelden. Schaalbalk:. 20 micrometer (B) cyste van 16 spermatocyten (C) cyste van 64 ronde spermatiden op Nebenkern stadium.. De Nebenkern structuur ontstaat uit gesmolten mitochondriën en is zichtbaar in DIC beelden naast de kern (open pijlpunt). (D) cyste van spermatiden met ronde H2AvD-RFP-positieve kernen en het verlengen van flagellen (open pijlpunt geeft aan een langer wordende Nebenkern structuur die begeleidt de groeiende axoneme). (E) Apical tip van een cyste van spermatiden bij het ​​begin van de kano fase tot een langgerekte kern vorm. Het uitgebreid langwerpige flagellen zijn slechts gedeeltelijk zichtbaar. Klik hier om een grotere versie van deze f bekijkenigure. Figuur 5 live beeldvorming van een 16-spermatocyte cyste ondergaan meiose I ex vivo. Fluorescentie afbeeldingen van een cyste in kweek tot expressie H2AvD-RFP. Afgebeeld zijn kenmerkend fasen van meiose I. spermatocyten in de cyste pass meiotische delingen in een golfachtige wijze. (A) Chromosoom condensatie begint kernen aan een zijde van de cyste (2) en doorloopt de cyste (richting volgens de pijl ). Kernen in de tegengestelde region (1) vormen een vroeger chromatine condensatie, waarbij histon-dichte gebieden markeren de drie belangrijkste chromosomen nog te onderscheiden. Spermatocyten in regio (2) bevatten volledig gecondenseerde chromosomen, zichtbaar als heldere fluorescerende vlekken. (B) Na 300; min, de eerste spermatocyten in regio (2) zijn in telofase (open pijlpunten), terwijl chromosoom condensatie blijft in de regio (1) (C) In de laatste spermatocyten van gebied (1), worden de chromosomen (pijlpunten) geregeld. bij de metafaseplaat 20 min later. (D) Binnen nog eens 15 min, de laatste spermatocyten verschijnen telofase te hebben afgerond en zijn nu klaar om cytokinese (open pijlpunten) ondergaan. Zie ook Aanvullende video 2 Schaal bar:.. 50 pm Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 6 anacardic zuur remt de histon-to-protamine switch in gekweekte pupal testes. Pupal testes expressi ng H2AvD-RFP en ProtamineB-eGFP en ontleed op 24 uur na puparium vorming (APF) werden gedurende 24 uur in medium zonder inhibitor (controle, A, A ', DMSO, dimethylsulfoxide) of in medium gesupplementeerd met 150 uM anacardic acid ( B, B '). Hub gebieden aangegeven met een asterisk. (A, B) No ProtamineB EGFP-positieve cysten kan worden waargenomen na dissectie. (A) na 24 uur incubatie, sommige cysten onderging de histon-to-protamine schakelaar en ProtamineB EGFP-positieve cysten (open pijlpunten) worden waargenomen. (B) Testes behandeld met anacardic zuur ontwikkelen geen ProtamineB EGFP-positieve cysten. Schaalbalk:. 100 micrometer Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. 68 / 51868fig7highres.jpg "width =" 500 "/> Figuur 7 anacardic zuur beïnvloedt histon H4 acetylering en de chromatine structuur van spermatiden Squash voorbereidingen van spermatide kernen uit pupal testes (24 hr APF) uiten ProtamineB-eGFP gedurende 24 uur zonder inhibitor (A – C). Of met 150 uM anacardic zuur (D – F). DNA gekleurd met Hoechst kleurstof (A en D). H4 acetylering geanalyseerd immunofluorescently (B en E). Aanwezigheid van protaminen bewaakt met de ProtamineB-eGFP signaal (C en F). Na behandeling met anacardic zuur, verschijnt het chromatine sterk verdicht (D) en H4 acetylering signaal in alle spermatid stages (E) volledig gereduceerd. Bovendien, de anacardic-zuur behandeldetestes tonen geen cysten van late kano podium of daarbuiten en geen ProtamineB-eGFP signaal (F). Schaalbalk:. 10 micrometer Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Aanvullende Video 1. Levende beeldvorming via eGFP en RFP fluorescentie van de histon-to-protamine switch in een pupal testis groeiende ex vivo. Video van 6 uur tijdsverloop imaging illustreert de histon-to-protamine overgang in de toename in prevalentie van ProtamineB- eGFP-positieve cysten. Beelden werden om de 5 min verworven. Voor meer informatie, zie figuur 3. (Zie "suppl_video_1.MOV" onder Downloads). Aanvullende Video 2 Live-beeldvorming van een enkele 16-spermatocyten cyste ondergaan meiose I ex vivo. Time-lapse fluorescerende beeldvorming van eencyste in kweek tot expressie H2AvD-RFP de loop van 80 minuten. Deze video toont de karakteristieke fasen van meiose I. Beelden werden elke 1 min verkregen. Voor meer informatie, zie figuur 5. (Zie "suppl_video_2.MOV" onder Downloads).

Discussion

Het gepresenteerde protocol beschrijft twee verschillende toepassingen worden gebaseerd op het vermogen om Drosophila testes en enkele kiemlijn cysten ontleden bij een bepaalde ontwikkelingsfase en de ex vivo ontwikkeling van deze cellen en weefsels in een kweekschaal. Een toepassing is de farmacologische manipulatie van vitale processen tijdens sperma ontwikkeling. Belangrijker nog, dit maakt het mogelijk de toegang tot de post-meiotische spermatogenese die niet gemakkelijk wordt verkregen met behulp van functionele analyses op basis van fly genetica. De andere toepassing is de microscopische observatie van het leven en de ontwikkeling van de geslachtscellen en testes. Vooral deze toepassing voordelen van het vermogen van Drosophila cellen en organen in kweek te overleven en te ontwikkelen bij kamertemperatuur en onder normale atmosfeer. Vandaar, een omgekeerde imaging microscoop uitgerust met een verwarmd trap (verhitting tot standaard kweektemperatuur van 25 ° C) voldoende om significante resultaten in levende imaging-experimenten te verkrijgen. VerderMeer, veel transgene vlieg stammen die fluorescerend eiwit gemerkte eiwitten voor live-imaging bestaan ​​of kan eenvoudig worden vastgesteld.

Om pupal testes of kiemlijn cysten van een bepaald ontwikkelingsstadium te verkrijgen, is het belangrijk dat men bekend met de timing van Drosophila ontwikkeling. De exacte timing voor elke fase kan variëren tussen laboratoria, kweekomstandigheden, en vliegen stammen en dient empirisch te worden vastgesteld. Zoals hierboven uiteengezet, is vooral belangrijk voor farmacologische assays die bijvoorbeeld gericht op de HP switch. Bij dergelijke experimenten is het raadzaam om altijd controleren zaadcellen met een ProtamineB-eGFP signaal voor de eigenlijke inhibitortest omdat de timing enigszins kan variëren zelfs binnen een populatie.

Volgens het protocol dat hierboven dient de onderzoeker in staat stellen om testes vanaf de vroege stadia pupal ontleden als intacte organen vrij van vastzittend vet lichaamsweefsel. Deze testes en, meer nog, geïsoleerd germ-line cysten zijn zeer kwetsbaar. Daarom is het cruciaal om de handigheid en ervaring nodig voor het hanteren en overbrengen testes en cysten behulp van een tang, naalden, pipetten en ontwikkelen. Vooral studies richten meiose en vroege post-meiotische kiemcel ontwikkeling zou profiteren. Hoewel het relatief gemakkelijk om cysten laat spermatiden met lange flagella uit volwassen teelballen ontleden, is het moeilijk om eerdere fasen te verkrijgen. Ontleden van deze cysten van begin pupal testes na dit protocol is veel efficiënter. Houd er rekening mee dat in een gewone vlieg stam, slechts ca. 50% van de poppen zullen mannelijk zijn. Daarom bereiden ten minste tweemaal ontleden zoveel poppen als het aantal benodigde testes. Alternatief is het mogelijk om mannelijke L3 larven identificeren met een stereo-microscoop, zoals de testes kan worden geïdentificeerd als doorzichtige ronde organen ingebed in het laterale vet lichaamsweefsels van het intacte larve 23,34, en ze te verzamelen in cultuur flesjes vers dat kanworden gebruikt om pre-poppen voor enscenering en dissecties halen. Het is ook mogelijk om mannelijke pre-poppen 35 identificeren.

We hebben gemerkt dat zowel de geïsoleerde kiemlijn cysten en intact popstadium testes in kweek gevoelig zijn voor licht, zoals ook eerder 18 vermeld. Deze lichtgevoeligheid kan ook gelden voor sommige chemische verbindingen die farmacologische assays. Daarom is het het beste om de kweekschalen van een test in het donker tijdens incubatie houden. Ook bij de planning van time-lapse imaging experimenten met het ontwikkelen van testes en, vooral, geïsoleerde cysten, in gedachten houden dat de te lange belichtingstijden en / of te hoge sampling rates ex vivo ontwikkeling kunnen remmen. De juiste bemonsteringsfrequentie moet experimenteel worden bepaald.

Bacteriële en / of fungale infectie en over-groei in de kweekschalen vormt een ernstig probleem. Geïnfecteerde cultuur gerechten met te veel bacteriën niet ondersteunen ex vivo devekeling van de testes en cysten. Daarom beschreven kweekmedium penicilline en streptomycine (zie stap 1.1), maar tijdens langdurige incubatie kan deze antibiotica worden afgebroken en hun activiteit kan verzwakken. Dit zou een van de redenen voor de beperkte tijd van overleven (max. 72 uur) van gekweekte cysten waargenomen bij het gebruik van het protocol hierboven. Toch is deze periode niet kon worden uitgebreid door regelmatige vervanging van het kweekmedium in de gerechten. We concluderen dat andere factoren het voortbestaan ​​van invloed kunnen zijn op de cultuur, zoals een gebrek aan groei signalen van andere weefsels van de voortplantingsorganen. Anderzijds, post-meiotische ontwikkeling in Drosophila sneller dan bij zoogdieren. In Drosophila, spermiogenese duurt ongeveer 90 uur, en de HP switch vindt plaats tussen 50 en 60 uur na de meiose 9,12. Aldus, de gebruikelijke overlevingstijd van ongeveer 48 uur bereikt met dit protocol is geschikt voor centrale ontwikkelingsprocessen in spe volgenrmatogenesis, zoals meiotische delingen of de HP switch. Hoewel bacteriële of schimmelinfectie kan worden vermeden door het gebruik van schone instrumenten en media, heeft de gepresenteerde protocol geen gebruik van strikt steriele arbeidsomstandigheden omdat vliegen te maken en vliegen testes bacteriën bevatten reeds toen opgevoed onder standaard condities. Toch kunnen sommige toepassingen van deze cultuur techniek profiteren van vliegen ontleed of zelfs verhoogd onder aseptische omstandigheden (voor protocollen, zie 17,36,37).

Farmacologische assays aangewezen op het gebruik van chemische verbindingen die als remmers of activatoren van verschillende enzymen. De verbindingen vaak gebruikt in dergelijke experimenten vaak verschillen sterk in hun doelwitspecificiteit. Als voordeel biedt dit de mogelijkheid om hele enzymklassen richten, bijvoorbeeld met anacardic zuur remmende p300 / CBP, PCAF en MYST familieleden van HATs 38. Het nadeel hiervan kan potentiële off-target of cytotoxische effecten induc zijned van dergelijke verbindingen. Daarom moet elke verbinding gebruikt in een test met pupal testes of cysten worden getest op de cytotoxiciteit en specifieke effect bij verschillende concentraties. Bovendien kunnen kleine variaties in de kweekomstandigheden, chemisch concentratie of activiteit, en variaties in de cel permeabiliteit leiden tot variabiliteit van de geïnduceerde effecten. Daarom is het noodzakelijk voor het succes van de behandeling in elk experiment te controleren. Bijvoorbeeld, wanneer we gebruik anacardic zuur bij 150 uM, we waargenomen geringe variatie in de sterkte van de chromatine condensatie tussen fenotype en soms binnen enkele testes, terwijl acetylering van histone H4 consistent afgenomen.

Farmacologische testen met Drosophila testes in kweek zijn gebruikt voor en na de meiotische mechanismen van spermatogenese 4,12,14,21 analyseren. Aangezien het moeilijk is om toegang te krijgen tot de post-meiotische spermatogenese met genetische tools waarmee spelers met essentia richtenl pre-meiose en meiotische functies, deze ex vivo benadering vormt een alternatief. Bovendien, in principe, de werkwijze kan worden aangepast om-chase experimenten puls aan de ontwikkeling van behandelde geslachtscellen tijd volgen. Toch hebben we nog niet getest in deze mogelijkheid. Gebruikmakend van vroege pupal testes is een voordeel farmacologische assays. Ten eerste zou de dunne buitenmantel van de jonge pupal testes (rond 24 uur APF) verbeterde doorlaatbaarheid van chemische verbindingen mogelijk te maken. Ten tweede, bij het bestuderen van de post-meiotische HP switch, de pupal testes ontleed in 24 uur APF van de Protamine-GFP-expressie vliegen lijn staat een directe uitlezing van de vraag of de HP switch niet is aangetast of niet.

Tot op heden zijn verscheidene protocollen voor ex vivo kweek van Drosophila organen en weefsels waaronder testes en kiemlijn cysten ontwikkeld (zie bijvoorbeeld 4,14,17,20,39,40). De teelt medium en de gehanteerde algemene voorwaardenin het protocol hier gepresenteerd in 1979 werden vastgesteld 17. Het kweeksysteem werd later aangepast voor in vivo beeldvorming van de individualisering mechanisme late post-meiotische cysten geïsoleerd uit volwassen teelballen 4. Eerder hebben we gemeld dat deze voorwaarden overleving en differentiatie van de meiose en de vroege post-meiotische kiemcellen ondersteunen ook in hun cysten voor ongeveer 48 uur 12. In tegenstelling tot andere kweeksystemen 19 was de waargenomen ontwikkelingsstoornissen timing in deze culturen ongeveer overeen met de timing bepaald uit vaste monsters (voor details, zie 12). H2AvD-RFP en GFP fluorescentie Protamine-signalen kunnen worden gebruikt om de nucleaire morfologie en chromatine samenstelling van de kiemcellen in kweek visualiseren. Wij vonden dat een duidelijke identificatie van de ontwikkelingsstadia in de cultuur, dit is gunstig ten opzichte van andere criteria, zoals het rollen van cysten. Belangrijkste is echter dat de gepresenteerde protocol niet toevoeging van vlieg ext betrekkenract of andere dan foetaal bovine serum groeifactoren. Verder zien we hier dat de voorwaarden zijn compatibel met fluorescentie microscopie beeldvorming van meiotische delingen ex vivo in cultuur. Beelden kunnen worden verkregen met een redelijke resolutie in een gemakkelijk te gebruiken medium dat de lange-termijn ontwikkeling ondersteunt. Dit is in tegenstelling tot protocollen waarmee op korte termijn (ca. 3 uur) waarnemingen in Voltalef olie 41,42.

De hierboven beschreven voor de teelt en farmacologische behandeling van pupal testes en enkele mannelijke kiembaan cysten procedures zijn eenvoudig aan te passen aan de vele genetische, epigenetische, celbiologische, of ontwikkelingsstoornissen vragen die kunnen worden onderzocht in Drosophila spermatogenese. Dit omvat in het bijzonder onderzoek gericht op kiemlijn stamcellen. Het is aangetoond dat stamcellen ontwikkeling kan worden gevolgd door levende beeldvorming van gekweekte volwassen testes 20,43. De peristaltische beweging van het rijpe testis sheath interfereert met beeldopname. Daarom wordt ofwel beeldvorming gedaan met behulp gefragmenteerd testes 43 of het aantal imaging experimenten uitgevoerd moet worden toegenomen tot verlies datasets 20. Vroege pupal testes (24 hr APF) zijn nog niet afgesloten met spiercellen. Ouder testes (36-45 uur APF) lijken zelfs iets te weinig peristaltische bewegingen zien (vergelijk figuur 3 en Aanvullende video 1). Daarom zou teelt van jonge pupal testes intact organen dienen als een alternatief.

Bovendien, wanneer de knie, de mogelijkheid om popstadium testes ontleden en uiteindelijk geïsoleerd kiemlijn cysten Aanvullende toepassingen enkelvoudige cysten als een bron van een homogene, hoewel klein, celpopulatie toelaten. Zo is het dus mogelijk om RT-qPCR uitvoeren om de transcriptionele regulatie van specifieke genen tijdens bepaalde stadia van de spermatogenese te analyseren, zoals reeds aangetoond <sup> 15.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors wish to thank T. Noguchi for helpful advice on the initial establishment of the culture technique in our laboratory. Research in the lab of R. R.-P. was funded by the DFG within the international collaborative research center TRR81.

Materials

Anacardic acid Merck Millipore 172050 brand: Calbiochem (EMD Millipore)
Anti-acetyl-Histone H4 Merck Millipore 06-598 brand: Upstate
AxioCam MRm  Zeiss
AxioObserver.Z1 inverted microscope Zeiss
Dimethyl sulfoxide Sigma D8418
Dumont 5-Inox forceps Dumont multiple suppliers
Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated Sigma F4135
Fiber optical  illuminator multiple suppliers
Glass Bottom Microwell Dishes MatTek P35G-1.5-14-C
goat anti-rabbit IgG (H+L)-Cy5 Dianova 711-175-152
Hoechst Sigma B1155
Inoculation loop or pin holder multiple suppliers
Austerlitz INSECT PINS stainless steel needles, size 0 Plano GmbH N5018 In our hands both these pin sizes worked well in the dissections. The minutiens are less rigid but have a smaller tip diameter.
Austerlitz INSECT PINS stainless steel minutiens, diam. 0.1 mm Plano GmbH N5014
Multiwell plates, 24-wells Becton Dickinson 351147 brand: Falcon
Pen Strep invitrogen 15070 brand: Gibco
Shields and Sang M3 Insect Medium Sigma S8398
Stemi SV6 binocular Zeiss
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Fuller, M. T. Genetic control of cell proliferation and differentiation in Drosophila spermatogenesis. Semin. Cell Dev. Biol. 9 (4), 433-444 (1998).
  2. de Cuevas, M., Matunis, E. L. The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis. Development. 138 (14), 2861-2869 (2011).
  3. Tokuyasu, K. T., Peacock, D. W. J., Hardy, R. W. Dynamics of spermiogenesis in Drosophila melanogaster. Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 124 (4), 479-506 (1972).
  4. Noguchi, T., Miller, K. G. A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Development. 130 (9), 1805-1816 (2003).
  5. Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Can’t live without them, can live with them: roles of caspases during vital cellular processes. Apoptosis. 14 (8), 980-995 (2009).
  6. Govin, J., Caron, C., Lestrat, C., Rousseaux, S., Khochbin, S. The role of histones in chromatin remodelling during mammalian spermiogenesis. Eur. J. Biochem. 271 (17), 3459-3469 (2004).
  7. Hecht, N., Behr, R., Hild, A., Bergmann, M., Weidner, W., Steger, K. The common marmoset (Callithrix jacchus) as a model for histone and protamine expression during human spermatogenesis. Hum. Reprod. 24 (3), 536-545 (2009).
  8. Kanippayoor, R. L., Alpern, J. H. M., Moehring, A. J. Protamines and spermatogenesis in Drosophila and Homo sapiens. Spermatogenesis. 3 (2), (2013).
  9. Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. Chromatin dynamics during spermiogenesis. Biochim. Biophys. Acta. , (2013).
  10. Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. Chromatin remodelling and epigenetic features of germ cells. Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).
  11. Rathke, C., Baarends, W. M., Jayaramaiah-Raja, S., Bartkuhn, M., Renkawitz, R., Renkawitz-Pohl, R. Transition from a nucleosome-based to a protamine-based chromatin configuration during spermiogenesis in Drosophila. J. Cell Sci. 120 (9), 1689-1700 (2007).
  12. Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. Histone H4 acetylation is essential to proceed from a histone- to a protamine-based chromatin structure in spermatid nuclei of Drosophila melanogaster. Syst. Biol. Reprod. Med. 56 (1), 44-61 (2010).
  13. Olivieri, G., Olivieri, A. Autoradiographic study of nucleic acid synthesis during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Mutat. Res. Fund. Mol. Mech. Mut. 2 (4), 366-380 (1965).
  14. Gould-Somero, M., Holland, L. The timing of RNA synthesis for spermiogenesis in organ cultures ofDrosophila melanogaster testes. Wilhelm Roux Arch. Entwickl. Mech. Org. 174 (2), 133-148 (1974).
  15. Barreau, C., Benson, E., Gudmannsdottir, E., Newton, F., White-Cooper, H. Post-meiotic transcription in Drosophila testes. Development. 135 (11), 1897-1902 (2008).
  16. Barckmann, B., Chen, X., et al. Three levels of regulation lead to protamine and Mst77F expression in Drosophila. Dev. Biol. 377 (1), 33-45 (2013).
  17. Cross, D. P., Shellenbarger, D. L. The dynamics of Drosophila melanogaster spermatogenesis in in vitro cultures. J. Embryol. Exp. Morphol. 53 (1), 345-351 (1979).
  18. Rebollo, E., González, C., Henderson, D. S. Time-Lapse Imaging of Male Meiosis by Phase-Contrast and Fluorescence Microscopy. Drosophila Cytogenetics Protocols. , 77-87 (2004).
  19. Kawamoto, T., Kawai, K., Kodama, T., Yokokura, T., Niki, Y. Autonomous differentiation of Drosophila spermatogonia in vitro. Dev. Growth Differ. 50 (7), 623-632 (2008).
  20. Sheng, X. R., Matunis, E. Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output. Development. 138 (16), 3367-3376 (2011).
  21. Leser, K., Awe, S., Barckmann, B., Renkawitz-Pohl, R., Rathke, C. The bromodomain-containing protein tBRD-1 is specifically expressed in spermatocytes and is essential for male fertility. Biol. Open. 1 (6), 597-606 (2012).
  22. Jayaramaiah Raja, S., Renkawitz-Pohl, R. Replacement by Drosophila melanogaster Protamines and Mst77F of Histones during Chromatin Condensation in Late Spermatids and Role of Sesame in the Removal of These Proteins from the Male Pronucleus. Mol. Cell. Biol. 25 (14), 6165-6177 (2005).
  23. Bodenstein, D., Demerec, M. The postembryonic development of Drosophila. Biology of Drosophila. , 275-367 (1950).
  24. Susic-Jung, L., Hornbruch-Freitag, C., Kuckwa, J., Rexer, K. H., Lammel, U., Renkawitz-Pohl, R. Multinucleated smooth muscles and mononucleated as well as multinucleated striated muscles develop during establishment of the male reproductive organs of Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 370 (1), 86-97 (2012).
  25. Ashburner, M., Roote, J., Sullivan, W. Laboratory Culture of Drosophila. Drosophila Protocols. , 585-599 (2000).
  26. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66 (1), 57-80 (1981).
  27. Hime, G. R., Brill, J. A., Fuller, M. T. Assembly of ring canals in the male germ line from structural components of the contractile ring. J. Cell Sci. 109, 2779-2788 (1996).
  28. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M., W, S. u. l. l. i. v. a. n. Cytological analysis of spermatocyte growth and male meiosis in Drosophila melanogaster. Drosophila Protocols. , 87-109 (2000).
  29. Stern, C. The growth of testes in Drosophila. I. The relation between vas deferens and testis within various species. J. Exp. Zool. 87 (1), 113-158 (1941).
  30. Lim, J. G. Y., Fuller, M. T. Somatic cell lineage is required for differentiation and not maintenance of germline stem cells in Drosophila testes. PNAS. 109 (45), 18477-18481 (2012).
  31. Fuller, M. T., Bate, M., Martinez-Arias, A. Spermatogenesis. The Development of Drosophila melanogaster. , 71-147 (1993).
  32. Braun, R. E. Packaging paternal chromosomes with protamine. Nature Genet. 28 (1), 10-12 (2001).
  33. Görisch, S. M., Wachsmuth, M., Tóth, K. F., Lichter, P., Rippe, K. Histone acetylation increases chromatin accessibility. J. Cell Sci. 118 (24), 5825-5834 (2005).
  34. Demerec, M., Kaufmann, B. P. . Drosophila Guide: Introduction to the Genetics and Cytology of Drosophila melanogaster. , (1996).
  35. Wang, W., Yoder, J. H. Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (56), (2011).
  36. Sang, J. H. The Quantitative Nutritional Requirements of Drosophila Melanogaster. J. Exp. Biol. 33 (1), 45-72 (1956).
  37. Meynadier, G., Vago, C. . Aseptic rearing of invertebrates for tissue culture. In: Invertebrate tissue culture. 1, (1971).
  38. Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Price, B. D. Inhibition of histone acetyltransferase activity by anacardic acid sensitizes tumor cells to ionizing radiation. FEBS Lett. 580 (18), 4353-4356 (2006).
  39. Aldaz, S., Escudero, L. M., Freeman, M. Live imaging of Drosophila imaginal disc development. PNAS. 107 (32), 14217-14222 (2010).
  40. Niki, Y., Yamaguchi, T., Mahowald, A. P. Establishment of stable cell lines of Drosophila germ-line stem cells. PNAS. 103 (44), 16325-16330 (2006).
  41. Church, K., Lin, H. P. P. Kinetochore microtubules and chromosome movement during prometaphase in Drosophila melanogaster spermatocytes studied in life and with the electron microscope. Chromosoma. 92 (4), 273-282 (1985).
  42. Rebollo, E., González, C. Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes. EMBO rep. 1 (1), 65-70 (2000).
  43. Cheng, J., Hunt, A. J. Time-lapse Live Imaging of Stem Cells in Drosophila Testis. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 11, 2E.2.1-2E.2.8 (2009).

Tags

DrosophilaPupal TestisEx Vivo CultureGerm-line CystsSpermatogenesisPost-meioticHistone-to-protamine SwitchPharmacological TreatmentMicroscopic Imaging

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Gärtner, S. M. K., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment. J. Vis. Exp. (91), e51868, doi:10.3791/51868 (2014).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image