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Biologia

Isolamento di cellule murine endoteliali Valve

Published: August 21, 2014
doi:
10.3791/51860
,
1Molecular, Cellular and Developmental Biology Graduate Program,The Ohio State University, 2Center for Cardiovascular and Pulmonary Research, The Heart Center,The Research Institute at Nationwide Children’s Hospital, 3Department of Pediatrics,The Ohio State University

Summary

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Abstract

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

Introduction

La valvola maturo è composto da tre strati stratificati di matrice specializzata extracellulare (ECM) intervallati da cellule interstiziali valvolari (VIC) e incapsulato da un singolo strato di cellule endoteliali delle valvole cardiache (VEC) 1. Il ruolo della ECM è quello di fornire tutte le necessarie proprietà biomeccaniche di resistere continui cambiamenti in vigore emodinamico durante il ciclo cardiaco. Il fatturato del ECM valvola nella valvola adulti è strettamente regolata da VIC, che sono in gran parte quiescente e fibroblasti-come, in assenza di malattia. Oltre alla popolazione VIC, cellule endoteliali valvole cardiache (VEC) formano un endotelio ininterrotta sulla superficie delle cuspidi della valvola 2. Mentre l'importanza di ECM e VIC per la struttura e la funzione della valvola sono stati descritti da noi e gli altri, il ruolo di VEC è meno noto. Tuttavia, questa relativamente piccola popolazione di cellule è critico per la formazione valvola nell'embrione ed è descritto come disfunzionale nella valvolamalattia.

Formazione di valvola cardiaca in embrione inizia quando un sottoinsieme di cellule endoteliali all'interno delle regioni canale e del tratto di efflusso atrioventricolare subire endoteliale alla trasformazione mesenchimale (EMT) e formano gonfiori conosciuti come cuscinetti endocardici 1,3. Le cellule mesenchimali recentemente trasformate all'interno di queste strutture poi si differenziano in VIC e formano le valvole maturi. Una volta EMT è completa, le cellule endoteliali che circondano i cuscini, chiamati VEC, formano uno strato di cellule endoteliali ininterrotto che protegge la valvola maturo contro i danni. Inoltre, VEC percepiscono l'ambiente emodinamico e hanno dimostrato a livello molecolare comunicare con VIC sottostanti per regolare ECM omeostasi 1,3. Nelle valvole malate, il monostrato VEC viene interrotto in associazione con i cambiamenti anormali nell'organizzazione ECM e biomeccanica alterati 4,5. Inoltre, studi in modelli murini suggeriscono che la disfunzione VEC è la causa di fondo della valvola disease 1,6-9. Come VEC svolgono un ruolo importante nello sviluppo della valvola, la manutenzione, e la malattia, è importante che noi definiamo pienamente i loro fenotipi temporali, al fine di avanzare il campo e capire i meccanismi della malattia.

Precedente lavoro di molti laboratori si è isolato con successo VEC da suini e ovini modelli 10-12. A causa delle grandi dimensioni di queste valvole, isolamenti attraverso tampone e / o digestione enzimatica, seguita da un numero di diversi metodi di isolamento, tra cui la separazione delle cellule tallone magnetica e singola cella espansione clonale è stata efficace per generare popolazioni puri 11-13. Tuttavia, questi modelli possono essere restrittivi causa l'annotazione incompleta dei suini e ovini genomi che limitano la disponibilità di strumenti molecolari oltre ai costi elevati. Pertanto sperimentazione di suini e ovini VEC dopo l'isolamento può essere restrittivo. Modelli murini sono preferibili a causa delle molte possibilità di manipula genetica, ma fino ad oggi, sono stati riportati zione e strumenti molecolari in embrione e l'adulto non isolamenti VEC in piccoli modelli animali. Ciò è probabilmente dovuto alla difficoltà di lavorare con campioni di tessuto di piccole dimensioni che comprendono una popolazione di cellule minoranza che attualmente privi di identità unica di marcatori VEC-specifici, evitando così metodi di isolamento a base di anticorpi.

In questo articolo, riportiamo un nuovo metodo per l'isolamento diretto di VEC murini nelle fasi embrionali e adulte. Questo protocollo sfrutta topi Tie2-GFP, che esprimono GFP in tutti i tipi di cellule endoteliali e sono stati ampiamente utilizzati per studiare popolazioni di cellule endoteliali 14. Tuttavia, la novità di questo studio è che questi topi, per la prima volta sono stati utilizzati per isolare cellule endoteliali dalle valvole. Con attenta dissezione del tessuto valvola e una serie di nove digestioni enzimatiche seguiti da FACS ordinamento, VEC possono essere isolati e utilizzati per varie tecniche sperimentali including estrazione e cultura RNA, direttamente dopo l'ordinamento.

Protocol

1 Preparazione di apparecchiature e soluzioni Sterilizzare gli strumenti di dissezione – forbici tessuti pregiati per estrarre i cuori adulti e 2 pinza sottile per la dissezione della regione valvolare – in autoclave in un vassoio strumento coperto. Spray utensili con il 70% di etanolo (EtOH) prima della dissezione. Preparare tutte le soluzioni immediatamente prima dell'esperimento e sterilizzare le soluzioni facendoli passare attraverso un filtro sterile 0,2 micron. Tenere soluzioni sul ghiaccio fino al momento dell'uso. Sterile Dissociazione Buffer (15 ml totale / campione). Combina 1,2 ml di collagenasi IV, 300 ml 2,5% tripsina e 150 microlitri di siero pulcino. Portare il volume fino a 15 ml con soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS). Sterile ordinamento Buffer (12 ml totale). Combina 25 microlitri 0,5 M di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e 12 microlitri DNasi I (RNase-free). Portare il volume fino a 12 ml con HBSS. Cultura VEC Media. Mix gro endotelialiwth mezzi secondo le istruzioni del produttore (vedi materiale foglio di calcolo) aggiungendo i componenti aliquotate dal kit a 500 ml di EBM2 media. GFP Negativo Cultura supporti (supporti cellule non endoteliali). Mescolare 445 ml di Medium 199 1x con 5 ml di penicillina / streptomicina (pen / strep) (concentrazione finale 1%) e 50 ml di FBS (concentrazione finale del 10%). 2 Dissezione della Regione valvolare da topi adulti ed embrioni E14.5 Tutte le procedure sugli animali sono stati approvati ed eseguiti in conformità alle linee guida Hospital Research Institute IACUC dei Bambini Nazionale. Topi Tie2-GFP sono stati acquistati da Jackson Laboratories (magazzino numero 003.658) 14 e sono stati mantenuti come genotipi omozigoti su uno sfondo FVB / N, e quindi garantire che tutti GFP espresso off-primavera in cellule endoteliali Tie2-positivi. Per FACS ordinamento, preparare una età abbinato samp negativole che non contiene BPA come C57 / BL6 per impostare i parametri di gate GFP per FACS ordinamento. NOTA: Questo protocollo e risultati rappresentativi si basano sull'utilizzo di tre, quattro mesi di età topi adulti o una cucciolata a giorno embrionale (E) 14.5. Topi adulti: Subito dopo il sacrificio da CO 2 anossia, usano forbici dissezione per aprire delicatamente la cavità toracica ed esporre il cuore ei polmoni. Dopo l'esposizione, afferrare il cuore con una pinza le grandi arterie e tirare fuori dal corpo. Rimuovere tessuto polmonare, se intatto, e posto il cuore in HBSS freddo a risciacquare. Rimuovere il ventricolo e tirare via atri lasciando il canale atrioventricolare 'anello' e regioni aortici intatti. Effettuare una incisione lungo il lato del canale atrioventricolare di aprire il 'ring' e esporre le strutture valvolari. Rimuovere il miocardio e le regioni aorta prossimale da prendere in giro delicatamente con una pinza. Identificare i lembi valvolari come bianco, tessuto denso sul miocardio rosa. Deta delicatamenteCH L'corde tendinee dalle valvole atrioventricolari e rimuovere la maggior quantità di miocardio residuo possibile. Siate cauti a non tirare o raschiare i lembi valvolari durante questo processo poiché VEC possono essere sloggiati. Posizionare regioni valvolari tagliati in una provetta Eppendorf da 1,5 ml contenente 1 ml HBSS e tenere su ghiaccio. NOTA: dissezione accurata è fondamentale per eliminare le cellule endoteliali non valvolare che potrebbero contaminare il campione. Embrioni: il sacrificio topi femmina 14,0 giorni dopo la spina copulazione si osserva (mattina del tappo di copulazione = 0,5 giorni). Subito dopo il sacrificio, sezionare l'utero (contenente gli embrioni) e lavare in HBSS freddo. Sezionare singoli embrioni dall'utero e rimuovere il sacco vitellino embrionale che circonda ogni embrione. Rimuovere i cuori di ciascuno degli embrioni e seguire passo 2.1. (NOTA: stringendo delicatamente l'embrione con una pinza appena sotto le appendici superiori dovrebbe contribuire a esporre il cuore e rendere più facile la rimozione.) <pclass = "jove_title"> 3. Dissociazione delle cellule e preparazione per FACS Utilizzo di puntali sterili, rimuovere HBSS dal tubo eppendorf contenente le regioni valvolari. Sostituire con 1 ml di tampone di dissociazione e 4 microlitri DNasi I. Ruotare le provette a 37 ° C per 7 minuti. Pipettare su e giù 3 volte e poi lasciare che il campione riposare per 15 sec. Raccogliere il surnatante (contenente le cellule dissociate) in una provetta da 15 ml. Per fermare la reazione collagenasi, aggiungere 125 ml di siero di cavallo al tubo di raccolta. Tenere tubo di raccolta sul ghiaccio. Ripetere passaggi dissociazione (3,2-3,5) nove volte a raccogliere nove frazioni di surnatante. Passare la raccolta frazionata attraverso un filtro di nylon 70 micron in un nuovo tubo di raccolta per garantire una sospensione di cellule singole rimuovendo eventuali residui e grumi. Gira la sospensione a 400 g per 5 minuti per agglomerare le cellule. Risospendere il pellet di cellule in 1 ml di tampone e Ordinamentotenere in ghiaccio fino al FACS. 4. FACS Ordinamento GFP positive VEC Set porte per avanti e side scatter escludere detriti e catturare singole cellule; escludere doppietti utilizzando discriminazione doppietto gating. Registrare il campione di controllo negativo e definire le impostazioni di gate al fine di confrontare e definire con precisione la popolazione di cellule GFP-positive nel campione Tie2-GFP. Analizzare le cellule GFP positive tramite FACS e perfezionare impostazioni del gate. Ordina il campione Tie2-GFP e raccogliere sia le cellule GFP-positive e GFP-negativi. Se verranno utilizzate cellule per l'estrazione dell'RNA, ordinare direttamente nel buffer ordinamento. Per le celle di coltura dopo FACS, raccogliere le cellule GFP positive in una provetta sterile contenente 1 ml di media VEC con 1 ml di FBS, e raccogliere le cellule GFP negativi in ​​1 ml di media non-endoteliali con 1 ml di FBS. Utilizzare questa combinazione di siero media / 50% 50% per migliorare la vitalità cellulare. Tenere in ghiaccio fino analisi post FACS. 5. post FACS analisi dells Estrazione RNA: Subito dopo FACS, le cellule positive e negative GFP centrifugare a 1500 xg per 8 min. Pipettare con attenzione il surnatante (smistamento buffer) e scartare. Risospendere il pellet di cellule (pellet non è visibile per le dimensioni del campione consigliate qui) in 200 ml Trizol. Congelare a -80 ° C o iniziare l'estrazione fenolo-cloroformio standard per isolare mRNA totale come precedentemente descritto dal nostro laboratorio 15. Utilizzare 50-200 ng di RNA per la sintesi di cDNA utilizzando la Mastermix secondo le istruzioni del produttore. Oggetto cDNA per l'amplificazione PCR quantitativa utilizzando sonde IDT Primetime qPCR contro marcatori di cellule endoteliali del mouse (CD31, Fattore di von Willebrand (vWF)), marcatori valvola di cellule interstiziali (α-actina del muscolo liscio (α-SMA), periostina (Postn)), miociti marcatori (Mhc6, Mhc7) e GAPDH. </ol> Coltura murino VEC: Dopo FACS smistamento e raccolta di cellule (punto 4.3), le cellule centrifugare a 300 xg per 5 min. Pipetta con cautela il surnatante (ordinamento tampone + media) e scartare. Risospendere il pellet di cellule GFP-positive in 1 ml di media VEC e il pellet GFP-negativo in 1 ml di media non endoteliali. Piatto ciascun campione in un pozzetto di una diapositiva camera di plastica e crescere fino confluenti. Cultura per circa 1 settimana per le cellule GFP negativi a diventare confluenti e più di 2 settimane per le cellule GFP positive per diventare confluenti (da un campione di 3, topi adulti). Modificare i media ogni due giorni. Colorazione di immunofluorescenza: Rimuovere i supporti dalle cellule e fissare nel 4% paraformaldeide (PFA) per 30 minuti a RT. Lavare le cellule fissate tre volte per 5 minuti ciascuno in soluzione tampone fosfato (PBS). Rimuovere pozzi camera da scivolo e blocco in siero bovino 5% di albumina / 1x PBS per 1 ora a temperatura ambiente. Covarediapositive O / N a 4 ° C con anticorpi primari (CD31, 1: 1.000 o actina del muscolo liscio α-(α-SMA), 1: 100). Lavare 3x per 5 min in PBS. Diluire l'anticorpo secondario (Alexa Fluor-568 di capra anti-Rat) 1: 400 in PBS, aggiungere alle diapositive, e incubare 1 ora a temperatura ambiente. Sciacquare i vetrini 3x per 5 min in PBS. Montare in Vectashield contenenti DAPI e incubare 1 ora a 4 ° C prima della visualizzazione.

Representative Results

Tie2 cellule GFP-co-localizzano con marcatori di cellule endoteliali nelle valvole cardiache embrionali e adulte. Al fine di confermare la specificità di espressione Tie2-GFP in VEC da topi embrionali e adulte, immunofluorescenza è stata eseguita per determinare co-localizzazione con il marcatore delle cellule endoteliali, CD31 in sezioni di tessuto preparate da E14.5 e 3 mesi di età adulta Tie2-GFP topo, utilizzando metodi precedentemente pubblicate dal nostro laboratorio 16. Come mostrato in Figura 1, VECs co-esprimono GFP (Figura 1 A, B, E, F) e CD31 (Figura 1 C, D, E, F) sia adulto (Figura 1 B, D, F) e embrionale ( Figura 1 A, C, E) le fasi, quindi convalida il nostro modello per il successivo isolamento VEC. Analisi FACS identificato popolazioni di cellule GFP-positive e GFP-negativi distinti in valvole cardiache embrionali e adulte isolate da topi Tie2-GFP. Selvaggio ttopi YPE C57 / BL6 sono stati usati per impostare i parametri GFP e circa il 2% delle singole cellule-gated da topi Tie2-GFP mostrano un arricchimento significativo in cellule GFP-positive mediante analisi FACS in entrambi i campioni embrionali e adulte (Figura 2). Sulla base di studi di co-localizzazione illustrate nella Figura 1, queste cellule sono considerati VECs e producono una media di 61.800 cellule totali (campioni vanno da 39,000-77,000 cellule / campione) in campioni adulti (n = 3), e 8,928 cellule (8,015- 11.000 cellule / lettiera) da una cucciolata di embrioni E14.5. Analisi PCR conferma arricchimento di marcatori di cellule endoteliali in cellule GFP-positive e valvola di marcatori di cellule interstiziali di cellule GFP-negativi isolati da topi Tie2-GFP. Analisi dell'espressione genica di popolazioni di cellule GFP positivi e negativi per qPCR seguenti FACS Mostra profili molecolari distinti. Rispetto alle popolazioni di cellule GFP negativi isolati da embrioni Tie2-GFP e adults, le cellule GFP positive sono arricchite per l'espressione di marcatori di cellule endoteliali CD31 e vWF, (Figura 3). Inoltre, l'espressione di marcatori miociti (MYH6, MYH7) in queste popolazioni di cellule è molto bassa, dimostrando minimo la contaminazione di cellule non endoteliali. Al contrario, le cellule GFP negativi isolate da topi adulti Tie2-GFP e E14.5 embrioni sono arricchiti per valvola cellule interstiziali (VIC), marcatori di cellule positive α-SMA e periostina (POSTN) relativi alla GFP. Arricchimento di questi marcatori è maggiore nelle cellule GFP negativi isolati da campioni E14.5 rispetto agli adulti a causa del fenotipo quiescente di VIC adulti e quindi bassa espressione di marcatori attivati. Cellule GFP-positive isolate dal Tie2-GFP topi adulti possono essere coltivate in vitro. La capacità di cultura GFP cellule negative e positive GFP isolati da campioni adulti è stata esaminata la based sulla morfologia cellulare e la colorazione immunoistochimica. Utilizzando protocolli precedentemente descritti da noi 17 illustra la Figura 4 che le cellule GFP positive appaiono round morfologia (figura 4A) e co-express GFP con il marker delle cellule endoteliali CD31 dopo due settimane in coltura (Figura 4C). Al contrario, le cellule non endoteliali sono negativi per la GFP, visualizzare una morfologia mesenchimale-like (Figura 4B) ed esprimere il VIC marcatori α-SMA dopo nove giorni (Figura 4D). Figura 1.-Tie2 cellule GFP-positive co-localizzano con CD31 in valvole cardiache embrionali e adulte. Immunofluorescenza per mostrare associazione di (Tie2-) espressione GFP (A, B) con il marcatore delle cellule endoteliali, CD31 (C, D) in le svolantini eptal della valvola mitrale a E14.5 (A, C, E) e adulti (B, D, F) fasi. La regione valvola è evidenziato in A, C, E. (E, F) fusione di immagini. Cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2. VEC Tie2-GFP-positive possono essere identificate da FACS. Rispetto ai controlli C57 / BL6 di pari età (A, C), le valvole isolate da embrioni Tie2-GFP (B) e adulti (D) contengono una GFP distinta popolazione di cellule positive, come indicato in verde. Eventi GFP-negativo, mostrati in rosso sono stati raccolti come controllo. I numeri tra (B) e (D) indicano la% media di GFP-pcellule ositive dal numero totale di eventi ordinati per FACS (n = 3). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 3. cellule GFP-positive sono arricchiti per i marcatori delle cellule endoteliali mentre le cellule GFP-negativi esprimono geni associati con le cellule interstiziali valvolari. Rappresentante qPCR di marcatori di cellule endoteliali (CD31, Fattore di von Willebrand (vWF)) e adulti (MYH6) e fetali ( MYH7) marcatori miociti in cellule GFP-positive isolate dalle regioni valvolari di E14.5 (A) e adulti (B) topi Tie2-GFP. Nota arricchimento di marcatori di cellule endoteliali e livelli molto bassi di geni miociti-associata. (C, D) Fold chaNGES in espressione di marcatori di cellule interstiziali valvolari α-SMA e Postn in cellule GFP-negativi isolati da E14.5 (C) e adulti (D) topi Tie2-GFP. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 4.-Tie2 cellule GFP-positive mantengono l'espressione di marcatori di cellule endoteliali in vitro. Seguito FACS, GFP positive (A, C) e negativo (B, D) le popolazioni di cellule provenienti da topi adulti sono stati coltivati ​​fino confluenti e sottoposti alla fase di imaging contrasto (A, B) e immunostaining fluorescente (C, D). Cellule GFP-positive esprimono CD31 (rosso) (C) dopo10 giorni di coltura. Al contrario, l'espressione della GFP non è stato rilevato nella popolazione di cellule negativo, che macchiato positivo per α-SMA, un marker di VIC attivati ​​(D).

Discussion

Qui si descrive per la prima volta, un nuovo metodo per l'isolamento di VEC murini embrionali e adulte di topi Tie2-GFP. Anche se questa linea di topi è stato ampiamente utilizzato per l'isolamento di popolazioni di cellule endoteliali, questo è il primo rapporto che mostra isolamento selettivo di VEC. A causa della fragilità della popolazione VEC, abbiamo sviluppato un protocollo rigoroso che consente l'isolamento di singole cellule di GFP positive (e negative GFP) le cellule da valvole cardiache di topi embrionali e adulte. Rispetto alla pubblicazione originale utilizzando embrioni interi o organi da Tie2-GFP topi 14, abbiamo ottimizzato collagenasi e dissezione misure basate sulla bassa abbondanza di questa popolazione di cellule endoteliali fragile per isolare una popolazione selezionata di cellule.

Isolamenti VEC hanno già stati riportati solo in modelli animali di grandi dimensioni con strumenti genetici e biomolecolari limitato. Questi strumenti sono ben stabiliti nei topi e, quindi, l'abilità di isolare VEC murini consente un set esteso di disegni sperimentali da utilizzare per la ricerca delle valvole cardiache. Di conseguenza, un vantaggio significativo di questo approccio è che VEC possono essere isolati temporalmente da topi wild type, e modelli di malattia della valvola e lesioni. Un secondo vantaggio è che VECs possono essere isolati e analizzati quasi immediatamente dopo la dissezione, preservando pattern di espressione che riflettono la situazione in vivo in modo più accurato. Inoltre, questo protocollo isolamento è sufficiente ad eliminare coltura cellulare per l'espansione numero e quindi possibili variazioni fenotipiche indotte dall'ambiente in vitro sono impediti.

Nonostante le novità ei vantaggi sperimentali di questo protocollo, ci rendiamo conto che esistono ancora limitazioni. In primo luogo, la dimensione della popolazione VEC entro valvole murini è molto piccolo e quindi, più cucciolate embrionali temporizzate sono necessari al fine di generare RNA sufficiente per l'analisi di espressione genica. Mentre this può essere superato utilizzando più allevatori, potrebbe avere un impatto sulla domanda di alcuni strumenti di analisi post-isolamento. Questa limitazione è stata una sfida particolare per stabilire colture confluenti di VEC GFP-positive, al fine di effettuare analisi più approfondite di fenotipi VEC compresi i profili molecolari e test funzionali. Pertanto riconosciamo che non tutte le difficoltà sono state superate dal nostro approccio, ma questa è una zona di interesse che stiamo cercando di superare.

Questo approccio di isolare VEC dalle regioni valvolari introduce la possibilità di contaminazione da Tie-GFP -positive, non valvolare cellule endoteliali della dell'endocardio, o strutture vascolari all'interno del miocardio ventricolare. Ad oggi, distinzione molecolare di VEC da altre popolazioni di cellule endoteliali cardiache non sono stati identificati. Tuttavia una regione enhancer del gene NFATc1 è stato identificato e dimostrato di etichettare specificamente VEC che non faresottoposti EMT, e le altre popolazioni di cellule endoteliali all'interno del cuore 18. Come modello Cre (NFATc1 encre) è disponibile, gli studi futuri potrebbero utilizzare la specificità di questa linea per minimizzare i rischi di contaminazione. Oltre alle cellule positive Tie2-GFP non valvolare, c'è sempre la possibilità di contaminazione da miociti nel punto in cui i lembi valvolari si attaccano alla regione anulare del setto e pareti miocardiche murali. In dati non riportati qui, inizialmente abbiamo iniziato gli studi per isolare VEC dalle regioni valvolari sezionati utilizzando perline anticorpi coniugati rivestiti con anti-GFP e anti-CD31. Anche se questo approccio ha avuto successo per isolare le cellule endoteliali, abbiamo sperimentato significativa aggregazione di cellule da tipi di cellule adiacenti, non endoteliali e quindi VIC e cellule miocardiche contaminati nostro campione sperimentale. Questo è stato evitato utilizzando l'analisi FACS come parametri sono stati impostati per isolare solo sospensione singola cellas e analisi PCR per rilevare l'espressione di geni specifici miociti è controllata per questa limitazione (Figura 3). Mentre il nostro contaminazione può essere ritenuto come minimo, rimane un potenziale complessità sperimentale che potrebbero essere evitati in futuro con la doppia selezione di GFP e marcatori di superficie specifici delle cellule endoteliali.

Usando questo protocollo, abbiamo VEC successo isolate da topi embrionali e adulte e gli esempi forniti di come questo approccio può essere utilizzato per l'isolamento di RNA e la coltura di cellule di popolazioni di cellule GFP positive e negative GFP. Tuttavia, questo approccio non è limitato a queste applicazioni e può essere utilizzato per una pletora di approcci molecolari, cellulari e funzionali. Inoltre, il fondo Tie2-GFP può essere allevato con modelli genetici di topo che permettano di studi comparativi delle popolazioni VEC nella salute e nella malattia. Lo sviluppo di questa nuova metodologia, per la prima volta, consentire studi miratiesaminando il contributo di VEC nello sviluppo della valvola e la manutenzione e potrebbe svelare i meccanismi precedentemente sottovalutati della malattia della valvola endotelio-dipendente.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo L'impianto Comprehensive Cancer Center analitico Citometria Nucleo Ohio State University, in particolare Katrina Moore, per l'assistenza tecnica FACS. Inoltre riconosciamo il dottor William Pu e il suo gruppo per le loro intuizioni scientifiche. Questo lavoro è stato supportato dal NIH HL091878 (JL) e il centro del cuore all'ospedale dei bambini nazionale.

Materials

[header]
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Life Technologies A-11077
70 μm nylon cell strainer BD Falcon 352350
2.5% Trypsin Invitrogen LT 15090-046
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, Heat Shock Treated Fisher Scientific BP1600-100
CD31 rat anti-mouse antibody BD Pharmingen 553370
Chick Serum Invitrogen LT 16110-082
Collagenase IV Invitrogen LT 17104-019 Prepared according to manufactuer's instructions
DNase I, RNase free (10,000 Units) Roche 4716728001
EBM-2 Lonza CC3156 For VEC media
EDTA, 0.5M Solution  Hoefer 03-500-506
EGM2 SingleQuot, Bulletkit Lonza CC-4176 For VEC media
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated Hyclone SH3007103IH
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Life Technologies 14025-092
Horse Serum Invitrogen LT 16050-130
Hybridization Oven VWR 230301V
Medium 199 1X Corning Cell gro 10-060-CV
Paraformaldehyde 16% Solution EM grade Electron Microscopy Sciences 15710
Pen/Strep MP-Biomed ICN1670049
Permanox sterile chamber slide with cover Thermo-Scientific 177429
Phosphate-Buffered Saline, 1X Corning Cell gro 21-040-CV
PrimeTime Mini qPCR Assay Integrated DNA Technologies Acta2 (αSMA), GAPDH, Myh6, Myh7, POSTN, CD31, vWF
StepOnePlus Real-Time PCR System Applied Biosystems 4376600
SuperScript VILO Mastermix Invitrogen LT 11755050
Tie2-GFP mice Jackson Laboratories 3658
Tissue forceps #5 11cm Dumont 14096
Trizol Ambion 15596018
α-SMA anti-mouse antibody  Sigma-Aldrich A2547
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1500
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Riferimenti

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Miller, L. J., Lincoln, J. Isolation of Murine Valve Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (90), e51860, doi:10.3791/51860 (2014).
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