鼠阀门内皮细胞的分离

1，前处理设备和解决方案消毒清扫工具 – 细剪的组织中提取的成人心和2细镊子的瓣膜区的清扫 – 在有盖的仪表盘通过高压灭菌。喷用70％乙醇（EtOH中）之前清扫工具。 准备好所有的解决方案在紧接实验，通过无菌0.2微米的过滤器将它们消毒解决方案。保持在冰上的解决方案，直到使用。 无菌分离缓冲液 （15毫升总/样品）。结合1.2毫升Ⅳ型胶原酶，300微升2.5％胰蛋白酶和150微升鸡血清。使体积达15毫升，Hank氏平衡盐溶液（HBSS）中。 无菌排序缓冲区 （12毫升总）。结合25微升的0.5M乙二胺四乙酸（EDTA）和12微升DNA酶I（不含RNA酶）。带量高达12毫升的HBSS。 血管内皮细胞培养基。混合内皮GRO相机连按制造商的说明（见材料的电子表格）通过从所述试剂盒至500ml EBM2媒体的加入等分的组件介质。 绿色荧光蛋白阴性文化传媒 （非内皮细胞介质）。混合445毫升中199 1X与5 ml青霉素/链霉素（青霉素/链霉素）（1％终浓度）和50毫升胎牛血清（10％终浓度）。 从成年小鼠E14.5胚胎2解剖瓣膜区 所有动物的程序获得批准，并按照全国儿童医院研究所IACUC准则进行的。 的Tie2-GFP的小鼠从杰克逊实验室（股票号003658）14购买并维持纯合基因型上的FVB / N的背景，因此，确保在Tie2的阳性内皮细胞全部脱落弹簧表达绿色荧光蛋白。 对于流式细胞仪分选，预备一个年龄匹配的负面SAMP勒不包含GFP如C57 / BL6设置GFP栅参数用于FACS分选。注：本协议和代表性的成果是基于使用三，四月龄的成年小鼠或一窝在胚胎一天（五）14.5。 成年小鼠：紧随牺牲的CO 2缺氧，用解剖剪刀轻轻打开胸腔暴露心脏和肺。一旦接触，握钳心脏的大血管和拉离身体。如果完整取出肺组织，和地方的心在冷的HBSS冲洗。取出心室和拉远心房留下房室管'环'和主动脉区的完整。做一个切口向下房室通道的一侧开辟了“环”和揭露瓣膜结构。轻轻用钳子戏弄客场取下心肌和主动脉近端区域。识别瓣叶白，致密组织在粉红色的心肌。轻轻DETA从房室瓣CH腱索和删除尽可能多的剩余心肌越好。一定要小心不要拉扯或在此过程中刮瓣叶，因为血管内皮细胞可脱落。将修剪瓣膜地区，在含有1毫升的HBSS 1.5ml离心管中，并保持在冰上。注意：仔细清扫关键是要消除非瓣膜内皮细胞可能污染样品。 胚胎：牺牲雌性小鼠后14.0天交配塞观察（早晨交配塞= 0.5天）。 紧接着牺牲，解剖子宫（含胚胎），并用冷的HBSS。剖析了从子宫单个胚胎并取出周围的每个胚胎的胚胎卵黄囊。删除从每个胚胎的心，按照步骤2.1。 （注意：轻轻挤压用钳子刚上附属物低于胚胎应有助于暴露心脏，使搬迁更加容易。） <pCLASS =“jove_title”> 3。细胞分离，并准备流式细胞仪用无菌枪头，从包含瓣膜地区的Eppendorf管中取出的HBSS。 更换1毫升缓冲液分离和4微升DNA酶一旋转试管，在37℃7分钟。 移液器上下3次，然后让样品定居，持续15秒。收集上清液（含有解离的细胞）入15ml锥形管中。 停止胶原酶反应，加入125微升的马血清至收集管。保持在冰上收集管。 重复步骤分解（3.2 – 3.5）的九倍，收集9级上清液。 通过70微米尼龙过滤器的分馏收集到一个新的收集管，以确保单个细胞悬液通过消除任何碎片和团块。 旋转的悬浮液，在400克5分钟以沉淀细胞。 重悬细胞沉淀在1ml排序缓冲器和保持在冰上，直到流式细胞仪。 4，流式细胞仪分选GFP阳性血管内皮细胞设置闸门的前向和侧向散射以排除碎片和捕捉单个细胞;通过使用双重歧视门排除双峰。记录的阴性对照样品和以对的Tie2-GFP的样品中比较准确地定义了GFP阳性细胞群定义的门限设置。 通过流式细胞仪分析GFP阳性细胞和完善的门限设置。 排序的Tie2-GFP的样品，并收集两个GFP阳性和GFP阴性细胞。如果细胞将被用于RNA提取，排序直接插入排序缓冲器。以FACS后培养的细胞，收集的GFP阳性细胞在含有1毫升胎牛血清1毫升VEC介质的无菌管中，并收集GFP阴性细胞在1ml的非内皮媒体的用1毫升胎牛血清。使用这个50％的媒体/ 50％血清相结合，提高细胞活力。置于冰上，直到后流式细胞仪分析。 5，邮政流式细胞仪分析;软件Š RNA提取： 紧接FACS，离心机GFP阳性和阴性细胞在1,500×g离心8分钟。 小心吸取上清液（排序缓冲区）并丢弃。 重悬细胞沉淀（沉淀是不为这里推荐的样本大小可见）在200μl的Trizol。 冷冻于-80℃或开始标准的苯酚-氯仿抽提分离总mRNA为先前由本实验室15说明。 使用50-200纳克的RNA，用于根据制造商的说明使用Mastermix cDNA合成。 受试者的cDNA定量PCR扩增使用IDT黄金时间的qPCR探针针对小鼠内皮细胞标记物（CD31，血管性血友病因子（vWF）的 ），阀间质细胞标志物（α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA），骨膜素（POSTN）），心肌细胞标记（Mhc6，Mhc7）和GAPDH。 </oL> 培养小鼠血管内皮细胞： 经过FACS分选和细胞收集（步骤4.3），离心细胞，在300×g离心5分钟。 认真吸取掉上清液（排序缓冲区+媒体）并丢弃。 重悬的GFP阳性细胞沉淀在1ml VEC媒体和在1ml的非内皮媒体的GFP阴性粒料。 板每个样品的塑料腔滑的一个良好，成长，直到汇合。培养1周左右的GFP阴性细胞变得汇合和超过2周的GFP阳性细胞变得汇合（距离为3的样本中，成年小鼠）。改变媒体每隔两天。 免疫荧光染色： 从细胞中除去介质并在4％多聚甲醛（PFA）进行30分钟，在室温固定。对于每次5分钟在磷酸盐缓冲盐水溶液（PBS）洗涤固定的细胞三次。 从滑动和块，在5％牛血清白蛋白/ 1×PBS中除去腔孔1小时，在室温下。 孵育幻灯片O 2 / N，在4℃用第一抗体（CD31，1:1,000或α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA），1:100）。冲洗3×5分钟，在PBS中。 稀释的二级抗体（Alexa的 – 氟568山羊抗鼠）1：在PBS 400中，添加到载玻片，并孵育1小时，在室温下。漂洗玻片3倍进行5分钟的PBS中。 山中的Vectashield含DAPI孵育1小时，在4℃下观看之前。