I hjärtmyocyter, rörformiga membranstrukturer bildar intracellulära nätverk. Vi beskriver optimerade protokoll för i) isolering av myocyter från mus hjärta inklusive kvalitetskontroll, ii) levande cell färgning för state-of-the-art fluorescensmikroskopi, och iii) direkt bildanalys för att kvantifiera komponent komplexitet och plasticitet i intracellulära membran nät.
In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules – the transverse-axial tubule system (TATS) – controls deep intracellular signaling functions. While the outer surface membrane and associated TATS membrane components appear to be continuous, there are substantial differences in lipid and protein content. In ventricular myocytes (VMs), certain TATS components are highly abundant contributing to rectilinear tubule networks and regular branching 3D architectures. It is thought that peripheral TATS components propagate action potentials from the cell surface to thousands of remote intracellular sarcoendoplasmic reticulum (SER) membrane contact domains, thereby activating intracellular Ca2+ release units (CRUs). In contrast to VMs, the organization and functional role of TATS membranes in atrial myocytes (AMs) is significantly different and much less understood. Taken together, quantitative structural characterization of TATS membrane networks in healthy and diseased myocytes is an essential prerequisite towards better understanding of functional plasticity and pathophysiological reorganization. Here, we present a strategic combination of protocols for direct quantitative analysis of TATS membrane networks in living VMs and AMs. For this, we accompany primary cell isolations of mouse VMs and/or AMs with critical quality control steps and direct membrane staining protocols for fluorescence imaging of TATS membranes. Using an optimized workflow for confocal or superresolution TATS image processing, binarized and skeletonized data are generated for quantitative analysis of the TATS network and its components. Unlike previously published indirect regional aggregate image analysis strategies, our protocols enable direct characterization of specific components and derive complex physiological properties of TATS membrane networks in living myocytes with high throughput and open access software tools. In summary, the combined protocol strategy can be readily applied for quantitative TATS network studies during physiological myocyte adaptation or disease changes, comparison of different cardiac or skeletal muscle cell types, phenotyping of transgenic models, and pharmacological or therapeutic interventions.
Hos friska tvärstrimmiga muskelceller, rörformiga membranstrukturer med "tvärgående" riktlinjer (T-tubuli) vinkelrätt mot huvudcellaxeln är riklig. Följaktligen har T-tubuli karaktäriserats som kontinuerliga förlängningar av muskelcellen viktigaste "lateral" ytmembran (sarcolemma), som djupt tränger cytosolen mot cellkärnan. Den fysiologiska rollen av T-tubuli kontinuerliga med den yttre ytan membranet är den snabba elektriska kopplingen av avlägsna intracellulära fack bildas med SER organell kontakt domäner i hela den relativt stora hjärtmuskelcellvolymen genom nanometrisk närhetskoppling av spänningsaktiverade L-typ Ca2 + kanaler (Cav1.2) inåt Ström (I Ca) aktivering angränsande ryanodinreceptor (RyR2) SER Ca2 + releaser. I kammar myocyter (VMS), icke-kontinuerliga membrankontakter ("korsningar") mellan junktional SER domäner och T-tubules tros styra tusentals enskilda intracellulära Ca2 + frisättning nanodomains i varje cell 1.
För varje given kontakt domän, de intilliggande membrandelar vardera av T-tubuli och det perifera (Junktional) SER är ungefär 15 nm nära varandra, därav definieras som nanodomain. Därigenom är mycket små enskilda cytoplasmiska underrum segregerade vilket möjliggör kvasi cellautonoma fack beteenden. När ett inkommande aktionspotentialens aktiverar Cav1.2 kanaler i T-tubuli av VMS, ett relativt litet Ca2 + inåt ström kommer att snabbt öka underrum Ca 2 + koncentrationen [Ca2 +] S i attoliter stora nanodomain 1. Därefter aktiverar [Ca2 +] S ökning Ca2 + -gated ryanodinreceptorer (RyR2) inom nanometer närhet i intilliggande SER membran korsningen, och denna koppling process sker i alla elektriskt pard myocyt nanodomains. RyR2s inträffar så täta flerkanals kluster med en beräknad stökiometri 1 Cav1.2 kanal för 5-10 RyR2 kanaler 2. Eftersom SER till cytosolen [Ca2 +] gradienten är mycket brant (förhållande 10 4: 1) och RyR2s fungera som hög-konduktans Ca2 + frisättning kanaler i funktionellt kopplade kluster, RyR2 aktivering resulterar i en kvantitativt stor Ca2 + släppa ström från T-tubuli kopplade junctionala SER domäner ökar lokalt underrum [Ca2 +] S till 100 ^ M eller högre inom 1-2 msek 3,4. Denna hjärtsignalförstärkning beteende även kallad Ca 2 + inducerad Ca2 + frisättning (CICR). Sammantaget T-tubuli är viktiga membranstrukturer som snabbt aktiverar Ca2 + frisättning signaler via junctionala nanodomain SER kontakter och celltäckande CICR under excitation-kontraktion (EG) koppling.
Förutom T-tubuli, axiell tubulis (A-tubuli) med en väsentligt annorlunda inriktning parallellt med huvud (längsgående) cellaxel har dokumenterats genom elektronmikroskopi (EM), konfokala och 2-foton mikroskopi studier. Till exempel var en cell omfattande kontinuerlig gitter av A-tubuli mellan myofibriller sammankopplade med T-tubuli nära sarcomere Z-linjer visas med extracellulära spårämnen och EM avbildning av fasta marsvin VMs 5. Med hjälp av extracellulära dextran bunden fluorescein färgning och leva 2-foton avbildning av råtta virtuella datorer, var en komplex retikulära 3D tubuli nät visualiseras som består av ~ 60% T-tubuli och ~ 40% A-tubuli 6. Denna studie inte bara lett till 3D-visualisering av riklig A-tubuli, men också till insikten att sektione för EM visualisering är i sig begränsat för analys av komplexa och dynamiska membran nätverk som den tvärgående-axial tubuli systemet (TATS). Följaktligen konfokal levande cell imaging av Tats membran direkt färgas med di-8-ANNEPS utvecklades. Om levande cellTats nätverk analyseras med Fourier-transformation, är det vanliga utseendet på T-tubuli komponenter i utrymmet nära sarcomere Z-linjerna reflekteras av ensemblen effektspektrum från en region av tvärstrimmiga signaler 7. Analysen strategi indirekt har använts för att upptäcka cellomfattande regionala förändringar i TATS komponentregelbundenhet i sjukdomsmodeller 7. Till exempel, orsakade shRNA medierad junctophilin-2 knock-down hjärtsvikt och isoform specifika proteinbrist ledde till T-tubuli omorganisation med nanodomain Ca2 + frisättning dysfunktion 8. Vi har nyligen förlängt analysen av Tats membran nätverk genom direkta kvantitativa metoder och vidare med levande cell Superresolution mikroskopi av enskilda tats komponenter i mus-VM med hjälp av stimulerad emission utarmning (STED) nanoscopy 9. Nanometrisk bildupplösning tillåtet för direkt analys av mindre enskilda tats komponenter som approximerar en 50:50 fördelning av tvärgåendekontra axiella tubuli inriktningar, kvantitativt bekräftar två rikliga ännu differentiellt orienterade individuella tats komponenter i friska mus hjärtan 9. Dessa strategier kommer att beskrivas närmare i protokollet nedan.
Medan den fysiologiska rollen för den rikliga A-tubuli komponenter i den vuxna hjärtat har förblivit gåtfull har EM-studier dokumenterade SER membranstrukturer associerade med A-tubuli tyder endogena Ca 2 + frisättning nanodomains i marsvin och råtta VM 5,10. Confocal analys av Cav1.2 och RyR2 fann en hög grad av colocalization på A-tubuli korsningar 10. Sedan ~ 20% av spontana Ca2 + gnistor i råtta virtuella ursprung relativt långt bort från Z-linjen strimmor där T-tubuli inträffar typiskt har ett argument varit att A-tubulus associerade nanodomains faktiskt kan existera och fungera som Ca2 + frisättning sajter 11,12. Intressant, T-tubuli bildning och mognad occurs endast efter födseln och parallellt med framväxten av hjärtceller, t.ex. genom groning av prekursor sarcolemmal invaginationer på P5 och omogna grenade TATS nätverksenheterna vid P10 i möss 13. Det framgår att Junctophilin-2 är särskilt viktigt för postnatal TATS nätverk mognaden sedan shRNA knock-down förhindrade förankringen av T-tubuli membran till Ser korsningar som leder till fördröjd Ca 2 + frisättning och patologisk TATS organisation i överensstämmelse med omogen A-tubulus dominerade arkitekturer i VM 13. Dessa observationer kan i slutändan leda till proof-of-concept som T-tubuli bildas genom membran invagination processer medan A-tubuli kan morph genom ytterligare eller alternativa intracellulära mekanismer 14.
Karakterisering av tats membranförändringar hjärtsjukdom har blivit ett viktigt forskningsområde för patofysiologiska frågor. Initiala rapporter i en hundmodell pacing-inducerad hjärt failure visade en förlust på T-tubuli och Cav1.2 Ström (I Ca) 15. En gris modell av ischemisk kardiomyopati visade minskad T-tubuli tätheter och minskad synkronisering av intracellulär Ca2 + släppa 16. Med hjälp av en spontant hypertensiva råttor (SHR) modell av hjärtsvikt, var en förlust av T-tubuli samband med minskad nanodomain koppling av Cav1.2 och RyR2 av det föreslagna systemet för "RyR2 föräldralösa" 7. En förlust av T-tubuli har även visats i human virtuella maskiner från ischemiska, vidgade och hypertrofisk kardiomyopati prover 17. Vidare ökade A-tubuli rapporterats i vävnadssnitt av human dilaterad kardiomyopati 18. Efter hjärtinfarkt, visade vi en differentialmekanism TATS omorganisation i mus virtuella datorer med betydande minskningar av T-tubuli i motsats till ökningar av A-tubuli komponenter 9. Viktigt är bättre lokal membran kontrast uppnås genom levande cell superrelösning STED mikroskopi aktiverat detaljerad kvantitativ analys komponent genom direkta mätningar, som visade signifikant ökning av A-tubuli med totala ökningarna av TATS nätverkslängd och förgrening komplexitet 9. Dessutom visade det sig att träning kan vända T-tubuli ombyggnad hos råttor efter hjärtinfarkt 19 och att hjärt resynkronisering kan leda till att vända ombyggnad av T-tubuli hos hundar med förmaksflimmer tachypacing inducerad hjärtsvikt 20. Sammantaget kommer studier både sjuka människor och djur virtuella datorer samt potentiella terapeutiska ingrepp utan tvekan dra nytta av förfaranden högkvalitativa cellisolerings och detaljerade kvantitativa strategier analys som beskrivs i protokollet och resultat avsnitten nedan.
Dessutom, vilket framgår nyligen mantelyta kontra TATS membran handel med KATP kanal isoformer 21, är det viktigt att beakta förmaks myocytes (AMS) som biologiskt distinkt liksom jämförande hjärtcellmodell versus VMS. T-tubuli nyligen dokumenterats i får och människa äf 22. Aktuella uppgifter tyder på att några T-tubuli finns i AM-celler och typiskt i större däggdjur som får och människor, men inte i smågnagare 23. I motsats till virtuella datorer, i AMS intracellulära Ca2 + frisättning tycks uppträda från cellytan föröknings genom diffusion mot cellkärnan, vilket resulterar i markerad spatial och temporal Ca2 + gradients 23. Inom denna ram verkar det viktigt att belysa mekanismerna för intracellulär Ca2 + signalering instabilitet för vanliga former sjukdom såsom förmaksflimmer 24. Sammanfattningsvis är både AM och VM cellisolering och varje för friska och sjuka hjärtan som vanligen användes protokollen. Endast om cellisolering görs på rätt sätt som bedöms av mikroskopisk dokumentation av tillräcklig cellernas kvalitet bör AM och VM prover vara carried framåt för kvantitativ TATS analys. Detta innebär att följande protokoll avsnitten är kritiskt beroende av hög kvalitet cell isolat från musen eller andra arter följt av levande cell mikroskopi för att analysera intakta tats membran. Som påpekats tidigare är karakterisering av Tats membran ett utmanande forskningsområde med en benägenhet för fixering och förberedelse artefakter 6, membranförändringar på grund av osmotiska ändringar och upplösning begränsningar konventionella ljusmikroskop 9. Vi noterar att de senaste state-of-the-art protokoll för isolering av mänskliga ändringsförslagen för Ca 2 + avbildning och patch-clamp och rått VMs för cellodling har tidigare publicerats i denna tidskrift 25,26.
Även hjärtmuskelceller har isolerats och studerats i årtionden 32, ingått ett senaste omdömet att konsekventa högkvalitativa myocyt cell isoleringar fortsatt utmanande 27. Detta återspeglar relativt komplexa protokoll för isolering av primära hjärtmyocyter gentemot en brist på gemensamma standardmetoder, delade metadata, och öppen cellkvalitetsdokumentation. Cellisoleringsprotokoll brukar anpassas av enskilda grupper, ge olika utfall i cell isolat, är beroende av enskilda modellinställningar (t.ex. arter, ålder, samexisterar hjärtsjukdomar), och är vanligtvis justerat för särskilda experimentella förhållanden. Inom ramen för den kvantitativa TATS membranstudier och protokoll som presenteras här, en viktig kvalitetsnivå vid bedömning och dokumentation gäller konfokala eller Superresolution mikroskopi av enskilda cellmembranstrukturer utsatta för metabola och isolering protokollberoende förändringar, bådei AM eller VM. Viktigt är även om höga utbyten av cell isolat tyder friska intakta myocyter, utredare behöver dokumentera och kritiskt bedöma varje enskild cell försiktigt mot morfologiska kriterier för yta och TATS membranintegritet kontra icke-specifik skada på grund av isoleringsförfaranden kontra specifika förändringar på grund av olika typer av interventioner jämfört med kontrollförhållanden. En viktig variabel under hjärtcellisolering är den specifika aktiviteten hos en given kollagenas mycket. För att välja en ny massa kollagenas, bör den enzymatiska aktiviteten av flera kollagenas proverna testas mot varandra genom att utvärdera hjärt myocyte avkastning och kvalitet, och enligt tillverkarens anvisningar. Idealt är en ny mycket kollagenas identifieras med kollagenas aktivitet liknande tidigare framgångsrikt använts partier (för utökad utvärdering av möjliga enzymaktiviteter finns i "kollagenas mycket markeringsverktyg" i tabellen material och metoder). TAken tillsammans, kvantitativa metoder för TATS membran visualisering beror kritiskt på cellisolering kvalitet och vice versa, hjärtcell isoleringar som leder till ospecifik membranskada som dokumenterats av TATS mikroskopi bör utlösa kritisk granskning och korrigering av isoleringsförfaranden. Eftersom cellisolering kvalitet och TATS membran visualisering och kvantifiering är nära förbundna, de protokoll som diskuteras i denna artikel omfattar alla viktiga aspekter som en kontinuerlig strategi.
Ytterligare en utmaning och vanligt problem av hjärtstudier, cellskada och / eller cellförlust uppstå på grund av metaboliskt komprometterande interventioner t.ex. efter hjärtinfarkt 9, men måste bedömas mot potentiell oavsiktlig skada t.ex. efter obemärkt luftemboli under cellisolering. Isolering av hjärtmuskelceller från sjuka hjärtan kan leda till ytterligare, betydande cellförlust och minskad cellutbyten. Därför comparIson av det totala antalet isolerade intakta celler mellan kontroll och sjuka hjärtan kan vara meningsfullt om cellisolering och räkning tillämpas konsekvent genom standardiserade protokoll. Därför är det viktigt att bedöma cellintegritet genom en lämplig kontrollgrupp, vilket återspeglar den bästa möjliga myocyt cellisolering kvalitet. Viktigt enskilda cellernas kvalitet och levande cell mikroskopi av friska kontra sjuka kontra myocyter oavsiktligt skadas av isoleringsförfarandet kan avsevärt påverka analysen av Tats membrannätverk. De protokoll som presenteras här betonar därför integriteten och stabiliteten i fysiologiska membrankomponenter under cellisolering och levande cell mikroskopi av oskadade hinnor. Hela arbetsflödet är utformad som en kontinuerlig strategi för att uppnå och bevara intakt TATS membrankomponenter medan exklusive skadade celler, eftersom dessa kommer att ställa ut isolering beroende membran artefakter som störda membran tubuli, membrane blebs och förändrade tats nät felaktigt enligt kontrollförhållanden och äventyra ytterligare kvantitativ analys. Vice versa, samma strategier är avgörande för interventionsstudier med potential att störa miljöer membran, som beror kritiskt på meningsfulla jämförelser kontroller mellan sant friska kontra sant sjuka cellen med tats membranförändringar.
Dessutom har vi itu med förfaranden för att uppnå den tekniskt mycket mer utmanande isolering av AM-celler. Trots framsteg och förbättrade protokoll, är det viktigt att betona att det inte är trivialt att återge högkvalitativa cell isoleringar av virtuella maskiner och ännu mindre tillförlitlig för ändringsförslagen. Detta beror på att den totala lägre utbyte av AM-celler, där till och med små fel eller variationer under cellisolering kan leda till fullständigt misslyckande av AM cellisolering, medan en mild grad av VM cellskada kan vara mindre uppenbar i cellsuspensionen på grund av relativt hög cell siffror jämfört med AM. Eftersom AM celler kan bli curved efter isolering, kan analyser genom flera ROI vara fördelaktigt som det beskrivs i steg 4.3. Efter ett detaljerat förfarande för cellisoleringssteg, ger vi ett protokoll för direkt integrerad membranfärgning och konfokala eller STED Superresolution avbildning av Tats nät för både virtuella och äf. Dessa protokoll möjliggör både kvantitativ analys och differentiering av utvalda komponenter i Tats membran genom tidigare fastställda parametrar. Jämfört med virtuella datorer, 3D-organisation och funktionella beteenden förmaks TATS nätet i AMS för närvarande mindre förstås.
Procedurerna till bildtatueringar membran i levande celler (steg från 3,1 till 3,7) utvecklades med kommersiella konfokala (Table of Materials / utrustning) och skräddarsydda sted fluorescensmikroskop 9. För att optimera mikroskop inställningarna för fluorescerande bildgenerering och kvantitativ TATS analys, följande punkter är av allmän betydelse:
Till skillnad från de direkta strategierna analys som presenteras här, tidigare publikationer som beskriver tats membran och sjukdomsrelaterade förändringar, har använt regionala aggregerade avläsning av T-tubuli täthet som kvantitativ strategi 16,17 eller indirekta regionala strategier baserade på Fourier transfFörnyelsen analys av tvärstrimmiga membransignaler för att bedöma T-tubuli komponentregel 7. Däremot är de kvantitativa metoder som beskrivs här direkt relaterade till enskilda tats komponenter och ger ett antal ytterligare parametrar, bland annat fastigheter membran nätverk och specifika komponenter som andelen A-tubuli. Vidare kan TATS nätdensitet kvantifieras som den normaliserade längden på hela extraherade skelettet per ROI området. Antalet trippel korsningar av tre enskilda kan kontinuerligt anslutna tubuli komponenter användas som ett mått på förgrenings komplexitet TATS membrannätverk. Vi noterar att varje analys av minsta tats komponenter beror på färgningsförfaranden. Enligt vår erfarenhet, 800 | il av en 50 | iM di-8-ANEPPS lösning är tillräcklig för att färga kompletta tats nätverk i en cellpellet innehållande 50.000 VM celler 9. Men om cellpelleten innehåller ett lägre antal hjärtmyocyterOm kraftfulla fluorescensdetektorer finns tillgängliga, och om konfokal avbildning av den totala fördelningen TATS nätverket än minsta membran detaljer och kvantitativa förändringar är av intresse, lägre färgämneskoncentrationer kan användas utifrån empiriska tester. Slutligen kan en programvara makro skriven för den beskrivna analysen användas för att automatisera bildbehandlings åtgärder för att underlätta analys av större datamängder, vilket är särskilt användbart för jämförelse mellan olika behandlingsgrupper (t.ex. läkemedel), celltyper (t.ex. AM kontra VM ), och patofysiologiska insatser (t.ex. bluff kontra hjärtinfarkt).
För bildanalys av Tats nätverk, är följande sekvens av principi steg tillämpas: 1) rullande boll bakgrund-subtraktion (4.5.1) för att avlägsna rumsliga variationer i bakgrunden intensitet; 2) lokal kontrastförbättring (4.5.2). 3) bildutjämning (4.5.3); 4) statistisk region sammanslagning (4.5.4); 5) som definierartröskel Bildens binärisering (4.5.6); och 6) beräkning av de skelett uppgifter (4.5.8). Ett kritiskt steg under skeletonization av fluorescerande tats bilder är bild binärisering visas i figur 6. Intressetröskelsteg slutligen definiera vilka sanna membranstrukturer upptäcks att representera de underliggande tats komponenter kontra potentiellt falska strukturer identifierats av misstag från bakgrundsljud. Identifiering av rätt tröskeln för binär bildanalys bör motsvara de verkliga TATS membranstrukturer, vilket beror på en tillräckligt hög signal-till-brus (SNR) förhållandet var för konfokala och Superresolution mikroskopi metoder. Därför bör en tillräcklig bildkvalitet etableras först och därefter kombineras med kritisk bedömning av enskilda cellernas kvalitet inklusive dokumentation av ljusa fält bilder som beskrivs. Alternativa möjligheter att anpassa bildsegmente protokoll för en given objektdatautgång och / eller fysiological frågor är bild deconvolution och andra tröskel förfaranden som "Otsu" eller "Iso-data" finns som ImageJ plugins. Oavsett den slutliga segmenteförfarandet anser vi jämförelsen mellan extraherade och rådata från bildöver ett obligatoriskt kvalitetskontroll steg. Sammanfattningsvis kommer morfologiska och membranintegritet enskilda isolerade myocyter, tillräcklig färgning av intracellulära tats membran, parameteroptimering för fluorescens avbildning, och overlay kontroll av extraherade skelett uppgifter bidrar till kvaliteten på fluorescerande tats bilder och kvantitativa resultat.
Om större arter än mus används för cellisolering, kan protokollen lätt anpassas på lämpligt sätt. För de kommande större arter kan råtthjärtan att kanyl med en trubbig 14 G kanyl (ytterdiameter 2,1 mm) och perfusion vid 8 ml / min. Betydligt äldre eller sjuka hjärtan kan kräva ännu större kanylstorlekar. I-genenral, kan hjärt perfusion utföras antingen genom konstant tryck t ex med hjälp av en 1 meter hög vattenpelare mellan reservoar och aorta eller med konstant flöde med hjälp av en peristaltisk pump. För cellisolering från små gnagar hjärtan som möss och råttor konstant flöde kan vara fördelaktigt eftersom kollagenasdigestion småningom kommer att störa koronara resistenskärlen som leder till överdrivna perfusion natt från läckande kärl bäddar som kommer att kontrolleras i viss utsträckning av konstanta flödesprotokoll. Däremot är konstant tryck perfusion fördel om övervakning av flödet och korrekt kanyle är en prioritet, vilket är fördelaktigt för interventionsmodeller med förändrad blodkärlet motståndsbeteenden samt för utbildning av cellisoleringsförfaranden.
Som beskrivits ovan, är mycket viktigt för kvantitativa studier av endogena membransystem tillräckligt cellernas kvalitet. Under hjärt perfusion och kollagenasdigestion flertal faktorer kan spitically påverka kvaliteten på cellisolering, som aldrig bör underskattas vid protokolloptimering eller felsökning 27. I synnerhet bör aktiviteten av en viss kollagenas mycket bestämmas för den specifika vävnaden av intresse t.ex. förmaken eller kamrarna före verkställandet av de experimentella god tro studier för att fastställa isoleringskrav som skall bibehållas under resten av studien. Dessutom kommer vattenkvalitet, pH, temperatur, optimering och rengöring av perfusion installationen minimera risken för oavsiktlig skada från föroreningar och emboli, och potentiellt ytterligare faktorer måste övervakas för att fastställa optimala homeostatiska förhållanden under cellisolering. BDM (2,3-butandion-monoxim) en reversibel hämmare av myosin ATPas tvärbryggor används vanligen vid vävnads dissekering och matsmältning att upprätthålla hjärtmuskelavslappning, vilket ökar utbytet av cell isoleringar. Ändå utredare behöver to vara medveten om att BDM kan utöva ospecifika fosfatas verksamhet som leder till off-target effekter, t.ex., hämning av Na + / Ca2 + valutaströmmar under vissa villkor 33. För vissa experiment kan det vara fördelaktigt att ersätta BDM genom blebbistatin som kardioplegisk lösning, en hämmare med hög affinitet för myosin vid mikromolära koncentrationer, som är emellertid toxiska och relativt dyra och kan ha andra ej åsyftade effekter. Vilande friska hjärtmuskelceller skall inte förete några sammandragningar i frånvaro av elektrisk stimulering och sådana celler bör undantas från vidare analys. Å andra sidan, hjärt myocyte kontraktion och avslappning som svar på elektrisk stimulering vid fysiologiska extracellulära Ca2 + koncentrationer kan användas för att fastställa normal kontraktila beteende som en ytterligare åtgärd för att bedöma funktionella cellernas kvalitet och / eller onormalt beteende i hjärtsjukdom kontra frisk kontroll celler.
<p class="Jove_content"> Sammanfattningsvis protokollen för enskild cell isolering och kvantitativ bildanalys beskrivs här har tillämpats med framgång för konfokal och Superresolution mikroskopi av TATS membrannätet i VM 9 och AM celler 21 samt för kvantitativ analys av mikrotubuli nätverk fasta hjärtmyocyter (data visas ej). Dessa och framtida tillämpningar av protokollen kan öppna vägar för en mängd olika experimentella frågor som karakterisering av Tats membran i olika utvecklingsstadier eller analys av membranassocierade proteiner eller organell strukturer som kontaktar TATS nätverk för att utöva mycket lokal, domänspecifik signalering funktionerna i AM och VM-celler.The authors have nothing to disclose.
This work received support through Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 1002 (subprojects A05 and B05 to S.E.L.) and KFO 155 (subproject 4 to S.E.L.), a Halbach Foundation award to S.E.L. supporting E.W.; a grant from the German Cardiac Society to S.B.; and a DAAD exchange program supporting T.K. as visitor at the University of Maryland. The research leading to these results has received funding from the European Community’s Seventh Framework Program FP7/2007-2013 under grant agreement No. HEALTH-F2-2009-241526, EUTrigTreat (to S.E.L.). S.E.L. is a principal investigator of the German Center of Cardiovascular Research (DZHK).
Chemicals and enzymes | |||
2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | B0753 | |
Bovine calf serum | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | SH30073 | Triple 0.1 µm sterile filtered. |
CaCl2 | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | 21115 | Diluted 1:10 in MQ water to obtain 100 mM CaCl2 stock concentration. |
Collagenase type II | Worthington via Cell Systems, Troisdorf, Germany | on request | Enzymatic activity depends on individual collagenase batches. Collagenase II and other enzyme activities (Caseinase, Clostripain, Tryptic) can be assessed in the "collagenase lot selection tool". Determine cell yield and quality individually for each new lot of collagenase. |
Glucose | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | HN06.1 | |
Heparin | Rotexmedica, Trittau, Germany | PZN-03862340 | Diluted in 0,9 % NaCl and injected subcutaneuosly in abdominal skin. |
HEPES | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 9105.4 | |
Forene 100% (V/V) | Abbott, Libertyville, IL, USA | B506 | Active agent: isoflurane, 250 ml. Use approximately 2 Vol% in air/oxygen dispenser instrument. |
KCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6781.3 | |
KH2PO4 | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3904.2 | |
Laminin (2 mg/ml) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 354232 | Lamination is described under step 2.1. |
MgCl2 · 6 H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2189.2 | |
MgSO4 · 7 H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8283.2 | |
Na2HPO4 · 2 H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4984.2 | |
NaHCO3 | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | HN01.1 | |
Taurin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4721.2 | |
Dyes | |||
Di-8-ANEPPS | Molecular Probes, Life Technologies, Darmstadt, Germany | D-3167 | Stock solution 2 mM in DMSO |
Trypan blue | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | T8154 | Trypan blue is gently mixed 1:1 via tip-cut 1 ml plastic pipette with cell suspension prior to cell counting in Neubauer cytometer. |
Langendorff perfusion setup | |||
Circulation thermostat | Lauda, Lauda-Königshofen, Germany | Please refer to Louch et al. (JMCC 2011). Heat up thermostat und buffers in perfusion tubing to 37 °C 15 min prior to use. | |
Flexible silicone tubing Tygon for peristaltic pump | VWR, Darmstadt, Germany | 224-2252 | Tubing needs to be changed regularly. |
Flexible silicone tubing Tygon for thermostat | VWR, Darmstadt, Germany | 228-4340 | |
Heating coil surroundung perfusion tubing | Rettberg, Göttingen, Germany | custom-made | Heating coil and tubing needs to be cleaned thoroughly via MQ water after using. Do not use detergents. Glass components should be bathed regularly in 10 mM NaOH overnight. |
Peristaltic pump | Ismatec, Wertheim, Germany | ISM830 | |
Three way stop cock Discofix C Luer Lock 10 cm | Braun, Melsungen, Switzerland | 16500C | |
Three way stop cock Discofix 3SC | Braun, Melsungen, Switzerland | 4095146 | |
Instruments | |||
42 mm glass coverslips | Menzel Gläser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany | on request | 0.13 – 0.16 mm thickness |
Cannula 21G | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lake, NY, USA | 304432 | Cut to a length of ~ 5 mm, roughened with sandpaper. |
Coverslips for Neubauer cytometer 24 x 24 mm | Menzel Gläser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany | on request | 0.38 – 0.42 mm thickness |
Graefe forceps, 0.5 mm tips, slight curve | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11151-10 | |
LSM 710 NLO | Carl Zeiss, Jena, Germany | 63x 1.4 NA oil objective | |
Neubauer improved cytometer | Labor Optik, Friedrichsdorf, Germany | 1100000 | Counting procedure: Wipe cytometer and coverslip provided with the counting chamber with 70 % ethanol. Press coverslip gently on the counting chamber so that the two glass surfaces are in contact and Newton's rings can be observed. Subsequently, 10 – 20 µl cell suspension can be applied to the edge of the coverslip to be sucked into the void by capillary action. Count the intact vs. defect myocytes using the squares of the cytometer grid which reflects 100 nl. Repeat counting procedure on the second grid provided on the cytometer. Calculate the density of cells in your original cell suspension by taking account of any dlutions and counting shortcuts. |
POC-R2 Imaging Chamber | Pecon, Erbach, Germany | Cell suspension volume: 800 µl; desired plating density: ~ 1000 AM and ~ 10,000 VM | |
Spring scissors, 8 mm blades straight, blunt | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 15025-10 | |
Student dumont #7 forceps, inox | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91197-00 | |
Student iris scissors, curved, 11.5 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91461-11 | |
Student iris scissors, straight, 11.5 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91460-11 | |
Student surcigal scissors, straight, sharp, 12 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91402-12 | |
Tissue forceps, 1×2 teeth, slim, 10 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11023-10 |