I hjertemuskelceller, rørformede membran struktur danner intracellulære nettverk. Vi beskriver optimalisert protokoller for i) isolering av myocytes fra mus hjerte inkludert kvalitetskontroll, ii) levende cellefarging for state-of-the-art fluorescens mikroskopi, og iii) direkte bildeanalyse for å kvantifisere komponenten kompleksitet og plastisitet av intracellulær membran nettverk.
In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules – the transverse-axial tubule system (TATS) – controls deep intracellular signaling functions. While the outer surface membrane and associated TATS membrane components appear to be continuous, there are substantial differences in lipid and protein content. In ventricular myocytes (VMs), certain TATS components are highly abundant contributing to rectilinear tubule networks and regular branching 3D architectures. It is thought that peripheral TATS components propagate action potentials from the cell surface to thousands of remote intracellular sarcoendoplasmic reticulum (SER) membrane contact domains, thereby activating intracellular Ca2+ release units (CRUs). In contrast to VMs, the organization and functional role of TATS membranes in atrial myocytes (AMs) is significantly different and much less understood. Taken together, quantitative structural characterization of TATS membrane networks in healthy and diseased myocytes is an essential prerequisite towards better understanding of functional plasticity and pathophysiological reorganization. Here, we present a strategic combination of protocols for direct quantitative analysis of TATS membrane networks in living VMs and AMs. For this, we accompany primary cell isolations of mouse VMs and/or AMs with critical quality control steps and direct membrane staining protocols for fluorescence imaging of TATS membranes. Using an optimized workflow for confocal or superresolution TATS image processing, binarized and skeletonized data are generated for quantitative analysis of the TATS network and its components. Unlike previously published indirect regional aggregate image analysis strategies, our protocols enable direct characterization of specific components and derive complex physiological properties of TATS membrane networks in living myocytes with high throughput and open access software tools. In summary, the combined protocol strategy can be readily applied for quantitative TATS network studies during physiological myocyte adaptation or disease changes, comparison of different cardiac or skeletal muscle cell types, phenotyping of transgenic models, and pharmacological or therapeutic interventions.
Hos friske tverrstripet muskelceller, rørformede membranstrukturer med "tverrgående" orienteringer (T-tubuli) vinkelrett på de viktigste celle aksen er rikelig. Følgelig har T-tubuli blitt karakterisert som kontinuerlig forlengelse av muskelcelle hoved "lateral" overflatemembran (sarcolemma), som penetrerer dypt i cytosol til cellen senteret. Den fysiologiske rollen til T-tubuli sammenhengende med den ytre overflate membranen er den raske elektrisk kopling av fjern intracellulære rom som er dannet av kontaktorganelle SER domener gjennom den relativt store hjertemuskelcellevolum av nanometrisk nærhet kobling av spenningsaktiverte L-type Ca2 + kanaler (Cav1.2) innover strøm (I Ca) aktivering tilstøtende ryanodine reseptor (RyR2) SER Ca 2 + utgivelser. I ventrikulære myocytes (VMS), de ikke-kontinuerlige kontakter membran ("veikryss") mellom junctional SER domener og T-tubules er tenkt å kontrollere tusenvis av individuelle intracellulære Ca 2 + utgivelsen nanodomains i hver celle en.
For enhver kontakt domene, de sidestilt membran porsjoner hver av T-tubule og det perifere (junctional) SER er ca 15 nm i nærheten av hverandre, dermed definert som nanodomain. Dermed er veldig små individuelle cytoplasmatiske underrom segregert som gjør kvasi celle-autonom compartment atferd. Når et innkommende aksjonspotensial aktiverer Cav1.2 kanaler i T-tubuli av VMs, en relativt liten Ca 2 + innover strøm vil raskt øke underrom Ca 2 + konsentrasjon [Ca 2 +] S i attoliter størrelse nanodomain en. Neste, [Ca 2 +] S økning aktiverer Ca 2 + -gated ryanodine reseptorer (RyR2) innenfor nanometer nærhet i sidestilt SER membran krysset, og denne koplingen prosessen skjer gjennom all elektrisk pard myocyte nanodomains. RyR2s skje så tett flerkanals klynger med en estimert støkiometri av en Cav1.2 kanal for 5-10 RyR2 kanaler 2. Siden SER-til-cytosol [Ca2 +] er meget bratt gradient (forhold 10 4: 1) og RyR2s fungere som høy-konduktans Ca2 + frigivelse kanaler i funksjonelt koblede klynger, RyR2 aktivering resulterer i en kvantitativt stort Ca 2 + frigjøre strøm fra T-tubulære kombinert junctional SER domener økende lokal underrom [Ca 2 +] S til 100 mikrometer eller høyere innen 1-2 msek 3,4. Denne hjerte signalamplifikasjon atferd er også referert til som Ca 2 + indusert Ca 2 + utgivelsen (CICR). Til sammen T-tubuli er essensielle membranstrukturer som raskt aktivere Ca 2 + utgivelsen signaler gjennom junctional nanodomain SER kontakter og celle-wide CICR under eksitasjon-kontraksjon (EF) kobling.
I tillegg til T-tubuli, aksial tubulis (a-tubuli) med en vesentlig annen retning parallelt med de viktigste (langsgående) celle aksen har blitt dokumentert ved elektronmikroskopi (EM), konfokal og 2-foton mikroskopi studier. For eksempel ble en celle-wide kontinuerlig gitter av A-tubuli mellom myofibrils koblet sammen med T-tubuli nærheten sarkomerlengda Z-linjer vist av ekstracellulære sporstoffer og EM avbildning av fast marsvin VMs fem. Ved hjelp av ekstracellulære dekstran bundet fluorescein flekker og leve to-foton avbildning av rotte VMs, ble en kompleks retikulære 3D tubule nettverk visualisert som består av ~ 60% T-tubuli og ~ 40% A-tubuli seks. Denne studien ikke bare ført til 3D-visualisering av rikelig A-tubuli, men også til den erkjennelse at seksjonering for EM visualisering nødvendigvis reduseres for analyse av komplekse og dynamiske membran nettverk som tverr-axial tubulære system (TATS). Følgelig konfokal levende celle avbildning av TATS membraner direkte farget med di-8-ANNEPS ble utviklet. Dersom levende celleTATS nettverk er analysert av Fourier transformasjon, er den vanlige utseendet på T-tubuli komponenter i plass i nærheten sarkomerlengda Z-linjer reflekteres av ensemblet strøm spekteret fra en region av tverrstripet signaler 7. Denne indirekte analyse strategien har blitt brukt til å oppdage celledekkende regionale endringer i TATS komponent regularitet i sykdomsmodeller 7. For eksempel, shRNA mediert junctophilin-2 knock-down forårsaket hjertesvikt og isoformen spesifikke proteinmangel førte til T-tubuli omorganisering med nanodomain Ca 2 + utgivelsen dysfunksjon åtte. Vi har nylig utvidet analyse av TATS membran nettverk gjennom direkte kvantitative tilnærminger og videre av levende celle superresolution mikroskopi av individuelle TATS komponenter i mus VMs bruker stimulert emisjon mangel (STED) nanoscopy ni. Nanometrisk bildeoppløsning tillates for direkte analyse av mindre individuelle TATS komponenter, som omtrentlig 50:50 fordeling av tverrversus aksiale tubulære orientering, kvantitativt bekrefter to rikelig ennå ulikt orienterte individuelle TATS komponenter hos friske mus hjerter ni. Disse strategiene vil bli nærmere beskrevet i protokollen nedenfor.
Mens fysiologiske rollen til de rike A-tubulære komponenter i den voksne hjertet har vært gåtefulle, har EM studier dokumentert SER membran strukturer knyttet til A-tubuli tyder endogen Ca 2 + utgivelsen nanodomains i marsvin og rotter VMs 5,10. Konfokal analyse av Cav1.2 og RyR2 funnet en høy grad av colocalization på A-tubulære veikryss 10. Siden ~ 20% av spontane Ca 2 + gnister i rotte VMs oppsto relativt langt borte fra Z-linje striper der T-tubuli vanligvis oppstår, har ett argument vært at A-tubule forbundet nanodomains kan faktisk eksistere og fungere som Ca 2 + utgivelsen sider 11,12. Interessant, T-tubule dannelse og modning occurs bare etter fødselen og paralleller veksten av hjerteceller, f.eks gjennom spirende av forløper sarcolemmal invaginations på P5 og umoden forgrenet TATS nettverks forsamlinger på P10 i mus 13. Det ser ut til at Junctophilin-2 er spesielt viktig for postnatal TATS nettverk modning siden shRNA knock-down hindret forankring av T-tubulære membraner til SER veikryss som fører til forsinket Ca 2 + utgivelsen og patologisk TATS organisasjon i samsvar med umoden A-tubule dominerte arkitekturer i VMs 13. Disse observasjonene kan til slutt føre til proof-of-concept som T-tubuli danne gjennom membranen invagination prosesser mens en-tubuli kan morph gjennom ytterligere eller alternative intracellulære mekanismer 14.
Karakterisering av TATS membran endringer i hjertesykdommer har blitt et viktig forskningsområde for patofysiologiske spørsmål. Første rapportene i en hund modell av pacing-indusert hjerte failure viste et underskudd på T-tubuli og Cav1.2 strøm (I Ca) 15. En gris modell av iskemisk kardiomyopati viste redusert T-tubuli tettheter og en redusert synkronisering av intracellulær Ca 2 + løslate 16. Ved hjelp av en spontant hypertensive rotter (SHR) modell av hjertesvikt, ble et tap på T-tubuli assosiert med redusert nanodomain kobling av Cav1.2 og RyR2 av den foreslåtte mekanisme "RyR2 orphaning" 7. Et tap av T-tubuli har også vist seg i menneskelig VMs fra iskemiske, utvidede, og hypertrofiske kardiomyopati prøver 17. Videre ble en økning i A-tubuli rapportert i vevssnitt av menneskelig dilatert kardiomyopati 18. Etter hjerteinfarkt, viste vi en differensial mekanisme TATS omorganisering i mus VM med betydelig reduksjon av T-tubuli i motsetning til økning av A-tubulære komponenter ni. Viktigere, forbedret lokal membran kontrast oppnås gjennom levende celle superredetaljert kvantitativ komponent analyse løsning STED mikros aktivert gjennom direkte målinger som viste betydelig spredning av A-tubuli med generelle økningen av TATS nettverk lengde og forgrening kompleksitet ni. Videre ble det vist at trening kan reversere T-tubule ombygging hos rotter etter hjerteinfarkt 19 og at hjerte resynkroniseringsbehandling kan føre til reversere ombygging av T-tubuli i hunder med atrial tachypacing indusert hjertesvikt 20. Til sammen vil studier både i syke mennesker og dyr VMs så vel som potensielle terapeutiske intervensjoner uten tvil dra nytte av høy kvalitet celleisolasjonsprosedyrer og detaljerte kvantitative analysestrategier som skissert i protokollen og resultater seksjoner nedenfor.
Videre, som demonstrert nylig av sideflate versus TATS membran omsetning av KATP kanal isoformene 21, er det viktig å vurdere atrial myocytes (AMS) som biologisk distinkt samt komparativ hjertecellemodell versus VMs. T-tubuli ble nylig dokumentert i sau og menneskelig AMs 22. Undersøkelser viser at få T-tubuli eksistere i AM celler og vanligvis i større pattedyr som sau og mennesker, men ikke i små gnagere 23. I motsetning til VMs, i AMS intracellulær Ca 2 + utgivelsen ser ut til å oppstå fra celleoverflaten forplanter ved diffusjon mot celle senter som resulterer i merket romlig og tidsmessig Ca 2 + bakker 23. Innenfor denne rammen synes det er viktig å belyse mekanismer for intracellulær Ca 2 + signale ustabilitet for vanlige sykdomsformer som atrieflimmer 24. I sammendrag, er begge AM og VM celleisolasjon og hver for friske og syke hjerter som vanligvis blir anvendt protokoller. Bare hvis celle isolasjon er gjort riktig bedømt ved mikroskopisk dokumentasjon av tilstrekkelig celle kvalitet, bør AM og VM-prøvene være carried frem for kvantitativ TATS analyse. Følgelig følgende protokoll delene er kritisk avhengig av høy kvalitet celle isolater fra mus eller andre arter etterfulgt av levende celle mikroskopi for å analysere intakte TATS membraner. Som påpekt tidligere, er karakterisering av TATS membraner en utfordrende forskningsområde med en tilbøyelighet for fiksering og forberedelse gjenstander 6, endringer membran på grunn av osmotiske endringer og oppløsning begrensninger konvensjonell lysmikroskopi ni. Vi merker at de siste state-of-the-art protokoller for isolering av menneske AMs for Ca 2 + bildebehandling og patch-clamp og av rotte VMs for cellekultur, har tidligere blitt publisert i dette tidsskriftet 25,26.
Selv om hjertemuskelceller har blitt isolert og studert i flere tiår 32, en fersk gjennomgang konkluderte med at konsistent høy kvalitet myocyte celle isoleringer forbli utfordrende 27. Dette gjenspeiler relativt komplekse protokoller for isolering av primære hjertemuskelceller vis-à-vis en mangel på felles standard tilnærminger, felles metadata, og gjennomsiktig celle kvalitetsdokumentasjon. Celleisolasjons protokoller er vanligvis tilpasset av enkeltgrupper, produsere variable utfall av cellekulturene avhenge av individuelle modellinnstillingene (f.eks art, alder, samtidige hjertesykdommer), og er vanligvis justert for spesielle eksperimentelle forhold. Innenfor rammen av den kvantitative TATS membran studier og protokoller som presenteres her, en viktig nivå for kvalitetsvurdering og dokumentasjon gjelder confocal eller superresolution mikroskopi av individuelle cellemembranstrukturer utsatt for metabolske og isolasjon protokollavhengige endringer, bådei AM eller VM. Viktigere, selv om høy avkastning av celle isolater foreslå sunne intakte myocytes etterforskerne trenger for å dokumentere og kritisk vurdere hver enkelt celle nøye mot morfologiske kriterier av underlag og TATS membran integritet versus ikke-spesifikk skade som følge av isolasjonsprosedyrer versus konkrete endringer på grunn av ulike typer av inngrep sammenlignet med kontrollforhold. En viktig variabel ved kardial celle isolasjon er den spesifikke aktivitet for en gitt masse kollagenase. For å velge et nytt parti med kollagenase, bør den enzymatiske aktiviteten til flere kollagenaseklassene prøver testes mot hverandre ved å evaluere hjerte myocyte avling og kvalitet, og i henhold til produsentens instruksjoner. Ideelt sett er en ny masse kollagenase identifisert med kollagenaseaktivitet lik tidligere med hell brukt masse (for utvidet vurdering av mulige enzymaktivitet referere til "collagenase mye selection tool" i materialer og metoder tabell). TAken sammen, kvantitative tilnærminger TATS membran visualisering er kritisk avhengige celle isolasjon kvalitet, og vice versa, hjertecelle isoleringer fører til uspesifikke membranskade som dokumentert av TATS mikros bør utløse kritisk gjennomgang og korreksjon av isolasjonsprosedyrer. Siden celle isolasjon kvalitet og TATS membran visualisering og kvantifisering er egentlig knyttet, protokollene omtalt i denne artikkelen dekker alle viktige aspekter som en kontinuerlig strategi.
En ekstra utfordring og vanlig problem av hjerte studier, celleskader og / eller celle tap oppstå på grunn av metabolsk kompromitterende intervensjoner f.eks, etter hjerteinfarkt 9, men trenger å bli dømt mot potensielle utilsiktet skade f.eks, etter ubemerket luftemboli under celle isolasjon. Isolering av hjertemuskelceller fra syke hjerter kan føre til ytterligere, betydelig celle tap og redusert celleutbytte. Derfor ComparIson av det totale antall isolerte intakte celler mellom kontroll og syke hjerter kan være meningsfylt hvis celle isolasjon og telling er benyttet konsekvent gjennom standardiserte protokoller. Følgelig er det viktig å vurdere celleintegritet gjennom en passende kontrollgruppe, noe som gjenspeiler den best mulige myocyte celleisolasjon kvalitet. Viktigere, enkelt celle kvalitet og levende celle mikroskopi av sunn versus syke versus myocytes utilsiktet skadet av isolasjonsmetoden kan ha stor innflytelse på analysen av TATS membran nettverk. Protokollene som presenteres her derfor understreke integritet og stabilitet av fysiologiske komponenter membran under celle isolasjon og levende celle mikroskopi av intakte membraner. Hele arbeidsflyten er utformet som en sammenhengende strategi for å oppnå og bevare intakte komponenter TATS membran mens unntatt skadede celler, siden disse vil stille isolasjon avhengige membran gjenstander som forstyrret membran tubuli, membrane blebs og endrede TATS nettverk feilaktig under kontroll forhold og kompromiss videre kvantitativ analyse. Vice versa, de samme strategiene er avgjørende for intervensjonsstudier med potensial for å forstyrre TATS membraner, som er kritisk avhengige av meningsfylte sammenligning kontrollen mellom ekte sunt versus ekte syk celle med TATS membran endringer.
I tillegg adresserer vi prosedyrer for å oppnå den teknisk mer utfordrende isolering av AM celler. Til tross for fremgang og bedre protokoller, er det viktig å understreke at det ikke er trivielt å reprodusere høykvalitets celle isoleringer av VMs og enda mindre pålitelig for AMS. Dette er på grunn av den generelt lavere utbytte av AM celler der selv små feil og variasjoner i løpet av celleisolasjon kan føre til fullstendig svikt i AM celleisolasjon, mens en mild grad av VM celleskade kan være mindre tydelig i cellesuspensjonen på grunn av relativt høy celle tall sammenlignet med AM. Siden AM celler kan bli curved etter isolasjon, kan analyse gjennom flere ROIs være en fordel som skissert i henhold til trinn 4.3. Etter en detaljert prosedyre for celle isolasjon trinn, gir vi en protokoll for direkte integrert membranfarging og confocal eller STED superresolution avbildning av TATS nettverk både for VMs og AMS. Disse protokollene at både kvantitativ analyse og differensiering av utvalgte komponenter i TATS membraner gjennom tidligere etablerte parametre. I forhold til VM, 3D-organisasjon og funksjonelle atferd av atrial TATS nettverk i AMS er for tiden mindre forstått.
Prosedyrene til bilde TATS membraner i levende celler (trinn 3.1 til 3.7) ble utviklet med kommersiell confocal (Table of Materials / utstyr) og skreddersydde STED fluorescensmikroskoper ni. Å optimalisere mikroskop innstillingene for fluorescerende image generasjon og kvantitativ TATS analyse, følgende punkter er av generell betydning:
I motsetning til de direkte analyse strategier som presenteres her, tidligere publikasjoner som beskriver TATS membraner og sykdomsrelaterte endringer, har brukt regionale aggregerte avlesninger av T-tubule tetthet som kvantitativ strategi 16,17, eller indirekte regionale strategier basert på Fourier transformasjon analyse av tverrstripet membran signaler for å vurdere T-tubule komponent regularitet 7. I kontrast er de kvantitative tilnærminger beskrevet her direkte knyttet til enkelt TATS komponenter og gi en rekke andre parametere inkludert membran nettverksegenskaper og spesifikke komponenter som prosentandelen av A-tubuli. Videre kan nettverks TATS tetthet kvantifiseres som den normaliserte lengde av hele ekstrahert skjelettet per ROI området. Antallet trippel knutepunkter i tre individuelle, kan kontinuerlig koblet tubulære komponenter benyttes som et mål for den forgrenede kompleksitet TATS membrannettverk. Vi merker oss at enhver analyse av minste TATS komponenter avhenger farvningsprosedyrer. Etter vår erfaring, 800 ul av en 50 mM di-8-ANEPPS løsningen er tilstrekkelig til å sette flekker på komp TATS nettverk i en celle-pellet inneholdende 50 000 VM celler 9. Imidlertid, hvis cellepelleten inneholder et lavere antall hjertemuskelceller, Hvis kraftige fluorescens-detektorer er tilgjengelige, og hvis konfokal avbildning av den samlede TATS nettverket fordeling snarere enn minste membran detaljer og kvantitative forandringer er av interesse, lavere fargestoffkonsentrasjoner kan brukes basert på empirisk testing. Endelig kan en programvare makro skrevet for den beskrevne analyse benyttes for å automatisere fremgangsmåten for bildebehandling for å lette analyse av større datasett, som er spesielt nyttig for sammenligning mellom forskjellige behandlingsgrupper (f.eks narkotika), celletyper (f.eks AM versus VM ), og patofysiologiske intervensjoner (f.eks humbug versus hjerteinfarkt).
For bildeanalyse av TATS nettverk, er følgende sekvens av prinsippet skritt til grunn: 1) rullende ball bakgrunn-subtraksjon (4.5.1) for å fjerne romlige variasjoner i bakgrunnen intensitet; 2) lokal kontrastforbedring (4.5.2).; 3) kantutjevning (4.5.3); 4) statistisk region sammenslåing (4.5.4); 5) som definererterskel for bilde binarization (4.5.6); og 6) beregning av skjelettet data (4.5.8). Et kritisk trinn i skeletonization av fluorescerende TATS bilder er bilde binarization vist i figur 6. Tilhørende Terskelverdier trinn til slutt definere hvilke sanne membranstrukturer er detektert til å representere den underliggende TATS komponenter versus potensielt falske strukturer identifisert ved feil fra bakgrunnsstøy. Identifikasjon av korrekt terskel for binære bildeanalyse bør samsvare med de sanne TATS membranstrukturer, som avhenger av en tilstrekkelig høy signal-til-støy (SNR) ratio hver for konfokale og superresolution mikros tilnærminger. Derfor bør etableres et tilstrekkelig bilde kvalitet først og deretter kombinert med kritisk vurdering av enkelt celle kvalitet inkludert dokumentasjon av lyse feltet bilder som skissert. Alternative muligheter for å tilpasse bilde segmentering protokollen for en gitt mikroskop datautgang og / eller physiological spørsmål inkludere bilde deconvolution og andre Terskelverdier prosedyrer som "Otsu" eller "Iso-data" tilgjengelig som ImageJ plugins. Uavhengig av den endelige segmentering prosedyren, anser vi sammenligningen mellom utvunnet og rådata etter bilde overlegg en obligatorisk kvalitetskontroll trinn. Oppsummert vil morfologisk og membran integritet individuelle isolerte myocytes, tilstrekkelig farging av intracellulære TATS membraner, parameter optimering for fluorescens bildebehandling, og overlegget utklippede skjelett data bidrar til kvaliteten på fluorescerende TATS bilder og kvantitative resultater.
Dersom større arter enn mus anvendes for celleisolasjon, kan protokollene lett tilpasses etter ønske. For de neste større arter, kan rottehjerter bli kanylert med en stump 14 G kanylen (ytre diameter 2,1 mm) og perfusert ved 8 ml / min. Betydelig eldre eller syke hjerter kan kreve enda større kanyle størrelser. I genetral, kan hjerte perfusjon bli utført enten ved konstant trykk f.eks, ved hjelp av en 1 m høy vannsøyle mellom reservoaret og aorta eller ved konstant strømning ved hjelp av en peristaltisk pumpe. For celleisolasjon fra små gnagere hjerter som mus og rotter konstant strømning kan være fordelaktig, siden kollagenase fordøyelsen vil til slutt bryte koronare resistenskarene som fører til høye priser perfusjon fra å lekke fartøys senger som skal styres til en viss grad ved konstant strømnings protokoller. I motsetning til dette er konstant trykk perfusjon fordel om kontroll av strømningshastighet og korrekt kanylering er en prioritet, som er fordelaktig for intervensjons modeller med endrede blodkarmotstand oppførsel så vel som for trening av celleisoleringsprosedyrer.
Som beskrevet ovenfor, er det tilstrekkelig cellekvalitet meget viktig for kvantitative studier av endogene membransystemer. Men under hjertet perfusjon og kollagenase fordøyelsen mange faktorer kan critically påvirke kvaliteten på celleisolasjon, som ikke bør undervurderes under protokoll optimalisering eller feilsøking 27. Særlig bør aktiviteten av en gitt kollagenase masse bestemmes for den spesifikke vev av interesse f.eks atria eller ventriklene før utførelse av de eksperimentelle bona fide studier for å etablere isolasjon vilkår som må opprettholdes gjennom hele resten av studien. Videre vil vannkvaliteten, pH, temperatur, optimalisering og rengjøring av perfusjon oppsett minimalisere risikoen for utilsiktet skade fra forurensninger og emboli, og eventuelt ytterligere faktorer må overvåkes for å etablere optimale betingelser homeostatiske under celleisolasjon. BDM (2,3-butandion-monoxime) en reversibel hemmer av myosin ATPase kryss broer er ofte brukt under vev disseksjon og fordøyelse å opprettholde hjertemuskelavslapning, noe som øker utbyttet av celle isoleringer. Likevel etterforskere trenger to være klar over at BDM kan utøve uspesifikke fosfatase aktivitet fører til off-target effekter f.eks, hemming av Na + / Ca 2 + valutastrømmer under visse forutsetninger 33. For noen eksperimenter kan det være fordelaktig å erstatte BDM ved Blebbistatin som cardioplegic løsning, en inhibitor med en høy affinitet for myosin i mikromolare konsentrasjoner som er imidlertid giftige, og relativt kostbare og kan ha andre off-target effekter. Resting sunne cardiomyocytes bør ikke vise noen sammentrekninger i fravær av elektrisk stimulering og slike celler bør utelukkes fra videre analyse. På den annen side, kardial myocyte sammentrekning og avslapning i respons til elektrisk stimulering ved fysiologiske ekstracellulære Ca 2 +-konsentrasjoner kan brukes til å etablere normal kontraktile oppførsel som et ekstra tiltak for å vurdere funksjonelle cellekvalitet og / eller unormal oppførsel i hjertesykdom sammenlignet med friske kontroll celler.
<p class="Jove_content"> Oppsummert har protokollene for enkeltcelleisolasjon og kvantitativ bildeanalyse som beskrives her blitt brukt for konfokal mikroskopi og superresolution av TATS membrannettverk i VM 9 og AM celler 21 så vel som for kvantitativ analyse av mikrotubuli nett i faste hjertemuskelceller (data ikke vist). Disse og fremtidige anvendelser av protokollene kan åpne muligheter for en rekke eksperimentelle spørsmål som karakterisering av TATS membraner på ulike utviklingsstadier eller analyse av membran assosiert protein eller organelle strukturer som henvender seg TATS nettverk for å utøve sterkt lokalisert, domenespesifikk signale funksjoner i AM og VM-celler.The authors have nothing to disclose.
This work received support through Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 1002 (subprojects A05 and B05 to S.E.L.) and KFO 155 (subproject 4 to S.E.L.), a Halbach Foundation award to S.E.L. supporting E.W.; a grant from the German Cardiac Society to S.B.; and a DAAD exchange program supporting T.K. as visitor at the University of Maryland. The research leading to these results has received funding from the European Community’s Seventh Framework Program FP7/2007-2013 under grant agreement No. HEALTH-F2-2009-241526, EUTrigTreat (to S.E.L.). S.E.L. is a principal investigator of the German Center of Cardiovascular Research (DZHK).
Chemicals and enzymes | |||
2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | B0753 | |
Bovine calf serum | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | SH30073 | Triple 0.1 µm sterile filtered. |
CaCl2 | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | 21115 | Diluted 1:10 in MQ water to obtain 100 mM CaCl2 stock concentration. |
Collagenase type II | Worthington via Cell Systems, Troisdorf, Germany | on request | Enzymatic activity depends on individual collagenase batches. Collagenase II and other enzyme activities (Caseinase, Clostripain, Tryptic) can be assessed in the "collagenase lot selection tool". Determine cell yield and quality individually for each new lot of collagenase. |
Glucose | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | HN06.1 | |
Heparin | Rotexmedica, Trittau, Germany | PZN-03862340 | Diluted in 0,9 % NaCl and injected subcutaneuosly in abdominal skin. |
HEPES | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 9105.4 | |
Forene 100% (V/V) | Abbott, Libertyville, IL, USA | B506 | Active agent: isoflurane, 250 ml. Use approximately 2 Vol% in air/oxygen dispenser instrument. |
KCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6781.3 | |
KH2PO4 | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3904.2 | |
Laminin (2 mg/ml) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 354232 | Lamination is described under step 2.1. |
MgCl2 · 6 H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2189.2 | |
MgSO4 · 7 H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8283.2 | |
Na2HPO4 · 2 H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4984.2 | |
NaHCO3 | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | HN01.1 | |
Taurin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4721.2 | |
Dyes | |||
Di-8-ANEPPS | Molecular Probes, Life Technologies, Darmstadt, Germany | D-3167 | Stock solution 2 mM in DMSO |
Trypan blue | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | T8154 | Trypan blue is gently mixed 1:1 via tip-cut 1 ml plastic pipette with cell suspension prior to cell counting in Neubauer cytometer. |
Langendorff perfusion setup | |||
Circulation thermostat | Lauda, Lauda-Königshofen, Germany | Please refer to Louch et al. (JMCC 2011). Heat up thermostat und buffers in perfusion tubing to 37 °C 15 min prior to use. | |
Flexible silicone tubing Tygon for peristaltic pump | VWR, Darmstadt, Germany | 224-2252 | Tubing needs to be changed regularly. |
Flexible silicone tubing Tygon for thermostat | VWR, Darmstadt, Germany | 228-4340 | |
Heating coil surroundung perfusion tubing | Rettberg, Göttingen, Germany | custom-made | Heating coil and tubing needs to be cleaned thoroughly via MQ water after using. Do not use detergents. Glass components should be bathed regularly in 10 mM NaOH overnight. |
Peristaltic pump | Ismatec, Wertheim, Germany | ISM830 | |
Three way stop cock Discofix C Luer Lock 10 cm | Braun, Melsungen, Switzerland | 16500C | |
Three way stop cock Discofix 3SC | Braun, Melsungen, Switzerland | 4095146 | |
Instruments | |||
42 mm glass coverslips | Menzel Gläser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany | on request | 0.13 – 0.16 mm thickness |
Cannula 21G | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lake, NY, USA | 304432 | Cut to a length of ~ 5 mm, roughened with sandpaper. |
Coverslips for Neubauer cytometer 24 x 24 mm | Menzel Gläser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany | on request | 0.38 – 0.42 mm thickness |
Graefe forceps, 0.5 mm tips, slight curve | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11151-10 | |
LSM 710 NLO | Carl Zeiss, Jena, Germany | 63x 1.4 NA oil objective | |
Neubauer improved cytometer | Labor Optik, Friedrichsdorf, Germany | 1100000 | Counting procedure: Wipe cytometer and coverslip provided with the counting chamber with 70 % ethanol. Press coverslip gently on the counting chamber so that the two glass surfaces are in contact and Newton's rings can be observed. Subsequently, 10 – 20 µl cell suspension can be applied to the edge of the coverslip to be sucked into the void by capillary action. Count the intact vs. defect myocytes using the squares of the cytometer grid which reflects 100 nl. Repeat counting procedure on the second grid provided on the cytometer. Calculate the density of cells in your original cell suspension by taking account of any dlutions and counting shortcuts. |
POC-R2 Imaging Chamber | Pecon, Erbach, Germany | Cell suspension volume: 800 µl; desired plating density: ~ 1000 AM and ~ 10,000 VM | |
Spring scissors, 8 mm blades straight, blunt | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 15025-10 | |
Student dumont #7 forceps, inox | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91197-00 | |
Student iris scissors, curved, 11.5 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91461-11 | |
Student iris scissors, straight, 11.5 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91460-11 | |
Student surcigal scissors, straight, sharp, 12 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91402-12 | |
Tissue forceps, 1×2 teeth, slim, 10 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11023-10 |