हृदय myocytes में, ट्यूबलर झिल्ली संरचनाओं intracellular नेटवर्क के रूप में. हम गुणवत्ता नियंत्रण, राज्य के अत्याधुनिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए द्वितीय) लाइव सेल धुंधला सहित माउस दिल से myocytes की मैं) अलगाव के लिए प्रोटोकॉल अनुकूलित वर्णन है, और iii) प्रत्यक्ष छवि विश्लेषण घटक जटिलता और intracellular झिल्ली के plasticity यों नेटवर्क.
In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules – the transverse-axial tubule system (TATS) – controls deep intracellular signaling functions. While the outer surface membrane and associated TATS membrane components appear to be continuous, there are substantial differences in lipid and protein content. In ventricular myocytes (VMs), certain TATS components are highly abundant contributing to rectilinear tubule networks and regular branching 3D architectures. It is thought that peripheral TATS components propagate action potentials from the cell surface to thousands of remote intracellular sarcoendoplasmic reticulum (SER) membrane contact domains, thereby activating intracellular Ca2+ release units (CRUs). In contrast to VMs, the organization and functional role of TATS membranes in atrial myocytes (AMs) is significantly different and much less understood. Taken together, quantitative structural characterization of TATS membrane networks in healthy and diseased myocytes is an essential prerequisite towards better understanding of functional plasticity and pathophysiological reorganization. Here, we present a strategic combination of protocols for direct quantitative analysis of TATS membrane networks in living VMs and AMs. For this, we accompany primary cell isolations of mouse VMs and/or AMs with critical quality control steps and direct membrane staining protocols for fluorescence imaging of TATS membranes. Using an optimized workflow for confocal or superresolution TATS image processing, binarized and skeletonized data are generated for quantitative analysis of the TATS network and its components. Unlike previously published indirect regional aggregate image analysis strategies, our protocols enable direct characterization of specific components and derive complex physiological properties of TATS membrane networks in living myocytes with high throughput and open access software tools. In summary, the combined protocol strategy can be readily applied for quantitative TATS network studies during physiological myocyte adaptation or disease changes, comparison of different cardiac or skeletal muscle cell types, phenotyping of transgenic models, and pharmacological or therapeutic interventions.
स्वस्थ धारीदार मांसपेशी कोशिकाओं में, मुख्य सेल अक्ष को सीधा "अनुप्रस्थ" झुकाव (टी tubules) के साथ ट्यूबलर झिल्ली संरचनाओं प्रचुर मात्रा में हैं. नतीजतन, टी tubules गहरा सेल केंद्र की ओर cytosol घुसना जो पेशी सेल मुख्य "पार्श्व" सतह झिल्ली (sarcolemma) का निरंतर विस्तार के रूप में लक्षण वर्णन किया गया है. बाहरी सतह झिल्ली के साथ निरंतर टी नलिकाओं के शारीरिक भूमिका वोल्टेज सक्रिय एल प्रकार सीए की nanometric निकटता युग्मन द्वारा अपेक्षाकृत बड़े हृदय की मांसपेशी कोशिका मात्रा भर एसईआर organelle संपर्क डोमेन द्वारा गठित दूरस्थ intracellular डिब्बों का तेजी से बिजली युग्मन है 2 + चैनल आसन्न ryanodine रिसेप्टर (RyR2) एसईआर Ca 2 रिलीज को सक्रिय वर्तमान (मैं सीए) आवक (Cav1.2). Junctional एसईआर डोमेन और टी के बीच निलय myocytes (वी एम एस), गैर निरंतर झिल्ली संपर्क ("जंक्शनों") में-tubules प्रत्येक सेल में 1 व्यक्ति intracellular सीए 2 + रिहाई nanodomains के हजारों नियंत्रित करने के लिए लगा रहे हैं.
किसी भी संपर्क डोमेन के लिए, juxtaposed झिल्ली अंश टी छोटी नली और परिधीय (junctional) सेवा के प्रत्येक दूसरे के करीब 15 एनएम, इसलिए nanodomain के रूप में परिभाषित लगभग हैं. इस प्रकार, बहुत छोटे व्यक्तिगत cytoplasmic subspaces अर्ध सेल स्वायत्त डिब्बे व्यवहार जो सक्षम अलग कर रहे हैं. एक आने वाली संभावित कार्रवाई वी एम एस, एक अपेक्षाकृत छोटे सीए की टी नलिकाओं में Cav1.2 चैनल को सक्रिय करता है जब 2 + आवक वर्तमान तेजी attoliter आकार nanodomain 1 में subspace सीए 2 + एकाग्रता [2 Ca +] एस वृद्धि होगी. अगला, [2 Ca +] एस वृद्धि 2 + -gated ryanodine रिसेप्टर्स (RyR2) juxtaposed एसईआर झिल्ली जंक्शन में नैनोमीटर निकटता के भीतर सीए को सक्रिय करता है, और इस युग्मन प्रक्रिया सभी विद्युत युगल भर में होता हैडी myocyte nanodomains. RyR2s 5-10 RyR2 चैनल 2 के लिए 1 Cav1.2 चैनल के एक अनुमान के अनुसार stoichiometry साथ ही घने मल्टी चैनल समूहों होते हैं. एसईआर करने वाली cytosol के बाद [सीए 2 +] ढाल बहुत खड़ी (अनुपात 10 4: 1) और RyR2s कार्यात्मक युग्मित समूहों में के रूप में उच्च प्रवाहकत्त्व सीए 2 + रिहाई चैनलों समारोह, एक मात्रात्मक बड़े CA में RyR2 सक्रियण परिणाम 2 + 1-2 मिसे 3,4 के भीतर 100 माइक्रोन या इससे अधिक के लिए [2 Ca +] एस स्थानीय subspace बढ़ती टी छोटी नली युग्मित junctional एसईआर डोमेन से मौजूदा रिलीज. यह हृदय संकेत प्रवर्धन व्यवहार भी सीए 2 + रिलीज (CICR) प्रेरित 2 + सीए के रूप में जाना जाता है. साथ में ले ली, टी tubules तेजी से उत्तेजना-संकुचन (ईसी) युग्मन के दौरान junctional nanodomain एसईआर संपर्क और सेल चौड़ा CICR के माध्यम से सीए 2 + रिहाई संकेतों को सक्रिय कि आवश्यक झिल्ली संरचनाओं हैं.
टी नलिकाओं के अलावा, अक्षीय छोटी नलीमुख्य (अनुदैर्ध्य) सेल अक्ष के लिए एक काफी अलग अभिविन्यास समानांतर के साथ एस (ए नलिकाओं) इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम), confocal और 2 फोटॉन माइक्रोस्कोपी पढ़ाई से प्रलेखित किया गया है. उदाहरण के लिए, sarcomere जेड लाइनों के पास टी नलिकाओं के साथ जुड़े myofibrils के बीच एक नलिकाओं की एक सेल चौड़ा निरंतर जाली कोशिकी tracers और तय गिनी पिग वी एम एस 5 के ईएम इमेजिंग द्वारा दिखाया गया था. बाह्य dextran से जुड़े fluorescein धुंधला का उपयोग और चूहे वी एम एस के 2 फोटॉन इमेजिंग रहते हैं, एक जटिल जालीदार 3 डी छोटी नली नेटवर्क ~ 60% टी tubules और ~ 40% ए नलिकाओं 6 से मिलकर कल्पना की गई थी. यह अध्ययन केवल लेकिन यह भी ईएम दृश्य के लिए सेक्शनिंग स्वाभाविक अनुप्रस्थ-अक्षीय छोटी नली प्रणाली (TATS) जैसे जटिल और गतिशील झिल्ली नेटवर्क के विश्लेषण के लिए सीमित है कि वसूली के लिए प्रचुर मात्रा में एक नलिकाओं की 3 डी दृश्य के लिए नेतृत्व नहीं. नतीजतन, TATS झिल्ली की confocal लाइव सेल इमेजिंग सीधे साथ दाग डि-8-ANNEPS विकसित किया गया था. यदि जीवित कोशिकाTATS नेटवर्क फूरियर परिवर्तन से विश्लेषण कर रहे हैं, sarcomere जेड लाइनों के पास अंतरिक्ष में टी छोटी नली घटकों की नियमित उपस्थिति धारीदार संकेतों 7 के एक क्षेत्र से कलाकारों की टुकड़ी शक्ति स्पेक्ट्रम से परिलक्षित होता है. यह अप्रत्यक्ष विश्लेषण रणनीति रोग मॉडल 7 में TATS घटक नियमितता में सेल चौड़ा क्षेत्रीय परिवर्तन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है. उदाहरण के लिए, shRNA मध्यस्थता junctophilin -2 तोड़े नीचे दिल की विफलता और isoform विशिष्ट प्रोटीन की कमी nanodomain सीए 2 + रिहाई शिथिलता 8 के साथ टी छोटी नली पुनर्गठन के परिणामस्वरूप का कारण बना. हमने हाल ही में प्रत्यक्ष मात्रात्मक दृष्टिकोण के माध्यम से और आगे प्रेरित उत्सर्जन रिक्तीकरण (STED) nanoscopy 9 का उपयोग माउस वी एम एस में व्यक्तिगत TATS घटकों का जीना सेल superresolution माइक्रोस्कोपी द्वारा TATS झिल्ली नेटवर्क का विश्लेषण बढ़ाया है. अनुप्रस्थ के 50:50 वितरण अनुमानित जो छोटे व्यक्ति TATS घटकों के प्रत्यक्ष विश्लेषण, के लिए अनुमति दी nanometric छवि संकल्पअक्षीय छोटी नली झुकाव बनाम, मात्रात्मक स्वस्थ माउस दिलों 9 में दो प्रचुर मात्रा में अभी तक विभिन्न उन्मुख व्यक्ति TATS घटकों की पुष्टि. इन रणनीतियों आगे नीचे प्रोटोकॉल अनुभाग में उल्लिखित किया जाएगा.
वयस्क दिल में प्रचुर मात्रा में एक छोटी नली घटकों के शारीरिक भूमिका रहस्यमय बनी हुई है, जबकि ईएम पढ़ाई 2 + अंतर्जात सीए गिनी पिग और चूहे वी एम एस 5,10 में रिलीज nanodomains सुझाव ए नलिकाओं के साथ जुड़े एसईआर झिल्ली संरचनाओं दस्तावेज है. Cav1.2 और RyR2 की Confocal विश्लेषण एक छोटी नली जंक्शनों 10 पर colocalization के एक उच्च स्तर पाया. वी एम एस टी tubules आम तौर पर पाए जाते हैं, जहां जेड लाइन स्त्रिअतिओन्स से अपेक्षाकृत दूर उत्पन्न चूहे में सहज सीए 2 + स्पार्क्स के ~ 20% के बाद से, एक तर्क एक छोटी नली जुड़े nanodomains वास्तव में अस्तित्व है और समारोह हो सकता है कि कर दिया गया है सीए 2 + रिहाई साइटों के रूप में 11,12. दिलचस्प है, टी छोटी नली गठन और परिपक्वता OCजन्म के बाद ही curs और पी -5 में अग्रदूत sarcolemmal invaginations के अंकुरण के माध्यम से जैसे हृदय कोशिकाओं के विकास, समानताएं और अपरिपक्व चूहों 13 में P10 पर TATS नेटवर्क विधानसभाओं branched. यह Junctophilin -2 shRNA तोड़े नीचे के बाद प्रसव के बाद TATS नेटवर्क परिपक्वता के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है देरी सीए 2 + रिहाई और में अपरिपक्व एक छोटी नली प्रभुत्व आर्किटेक्चर के साथ संगत रोग TATS संगठन के प्रमुख के लिए एसईआर जंक्शनों को टी छोटी नली झिल्ली एंकरिंग रोका प्रतीत होता है कि वी एम एस 13. इन टिप्पणियों अंत में सबूत की अवधारणा टी tubules अतिरिक्त या यहां तक कि वैकल्पिक intracellular तंत्र 14 के माध्यम से रूप हो सकता है एक नलिकाओं जबकि झिल्ली invagination प्रक्रियाओं के माध्यम से है कि फार्म के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
हृदय रोग में TATS झिल्ली परिवर्तन की विशेषता pathophysiological प्रश्नों के लिए एक महत्वपूर्ण अनुसंधान के क्षेत्र बन गया है. पेसिंग प्रेरित दिल failu के एक कुत्ते के मॉडल में प्रारंभिक रिपोर्टोंपुन टी tubules और Cav1.2 वर्तमान (मैं सीए) 15 का नुकसान दिखाया. इस्कीमिक कार्डियोमायोपैथी के एक पिग मॉडल टी छोटी नली घनत्व कम दिखाया और intracellular सीए का एक कम synchrony 16 रिलीज 2 +. दिल की विफलता का एक अनायास उच्च रक्तचाप से ग्रस्त चूहा (SHR) मॉडल का उपयोग करना, टी नलिकाओं का नुकसान "orphaning RyR2" की प्रस्तावित तंत्र द्वारा Cav1.2 और RyR2 की कम nanodomain युग्मन के साथ जुड़े थे 7. टी नलिकाओं का नुकसान भी, इस्कीमिक फैली हुई है, और hypertrophic cardiomyopathy नमूने 17 से मानव वी एम एस में दिखाया गया है. इसके अलावा, एक नलिकाओं में वृद्धि मानव फैली हुई cardiomyopathy 18 के ऊतक वर्गों में सूचना मिली थी. रोधगलन के बाद, हम एक छोटी नली घटकों 9 की वृद्धि के विपरीत टी नलिकाओं की महत्वपूर्ण घटने के साथ माउस वी एम एस में TATS पुनर्गठन की एक अंतर तंत्र दिखाया. महत्वपूर्ण बात है, सुधार स्थानीय झिल्ली विपरीत लाइव सेल superre के माध्यम से हासिल कीसमाधान STED माइक्रोस्कोपी समग्र TATS नेटवर्क की लंबाई की बढ़ जाती है और जटिलता 9 शाखाओं के साथ एक नलिकाओं की महत्वपूर्ण प्रसार दिखाया जो प्रत्यक्ष माप, के माध्यम से विस्तृत मात्रात्मक घटक विश्लेषण सक्षम होना चाहिए. इसके अलावा, यह रोधगलन 19 के बाद और हृदय resynchronization चिकित्सा आलिंद tachypacing प्रेरित दिल की विफलता के साथ 20 कुत्तों में टी नलिकाओं के पुनर्गठन को उल्टा करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं कि चूहों में टी छोटी नली remodeling रिवर्स सकता है कि व्यायाम प्रशिक्षण दिखाया गया था. प्रोटोकॉल में उल्लिखित और नीचे वर्गों परिणामों के रूप में साथ में ले ली, रोगग्रस्त मानव और पशुओं के वी एम एस के साथ ही संभावित उपचारात्मक उपायों में दोनों अध्ययनों यकीनन उच्च गुणवत्ता सेल अलगाव प्रक्रियाओं और विस्तृत मात्रात्मक विश्लेषण रणनीतियों से लाभ होगा.
KATP चैनल की TATS झिल्ली तस्करी 21 isoforms बनाम पार्श्व सतह से हाल ही में प्रदर्शन के रूप में इसके अलावा, यह आलिंद मीटर पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण हैyocytes जैविक रूप से अलग करने के साथ ही वी एम एस बनाम तुलनात्मक हृदय सेल मॉडल के रूप में (एम्स). टी tubules हाल ही में भेड़ और मानव एम्स के 22 में दर्ज किया गया. वर्तमान सबूत कुछ टी tubules छोटे कृन्तकों 23 में भेड़ और मनुष्य, लेकिन नहीं की तरह बड़ा स्तनधारियों में आमतौर पर पूर्वाह्न कोशिकाओं में मौजूद हैं और पता चलता है कि. वी एम एस के विपरीत, एम्स में intracellular Ca 2 रिलीज 2 + चिह्नित स्थानिक और लौकिक सीए में यह परिणाम 23 gradients जो सेल केंद्र की ओर प्रसार से कोशिका की सतह प्रचार से घटित होता है. इस ढांचे के भीतर यह ऐसी अलिंद 24 के रूप में intracellular सीए 2 + आम रोग रूपों के लिए अस्थिरता के संकेत के तंत्र को स्पष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण लगता है. संक्षेप में, स्वस्थ और रोगग्रस्त दिल के लिए दोनों AM और वी एम सेल अलगाव और प्रत्येक सामान्यतः प्रोटोकॉल कार्यरत हैं. पर्याप्त सेल गुणवत्ता का सूक्ष्म प्रलेखन द्वारा न्याय के रूप में सेल अलगाव ठीक से किया जाता है, तभी AM और वीएम नमूने सीए होना चाहिएमात्रात्मक TATS विश्लेषण के लिए आगे rried. तदनुसार, निम्नलिखित प्रोटोकॉल वर्गों माउस या बरकरार TATS झिल्ली का विश्लेषण करने के लिए लाइव सेल माइक्रोस्कोपी द्वारा पीछा अन्य प्रजातियों से आइसोलेट्स उच्च गुणवत्ता सेल पर गंभीर रूप से निर्भर हैं. पहले कहा, TATS झिल्ली के लक्षण वर्णन निर्धारण और तैयारी कलाकृतियों 6, आसमाटिक परिवर्तन के कारण झिल्ली में बदलाव, और पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी 9 का संकल्प सीमाओं के लिए एक प्रवृत्ति के साथ एक चुनौतीपूर्ण अनुसंधान क्षेत्र है. हम सीए 2 + इमेजिंग और पैच दबाना के लिए और सेल संस्कृति के लिए चूहे वी एम एस के मानव एम्स के अलगाव के लिए हाल ही में राज्य के अत्याधुनिक प्रोटोकॉल पहले इस पत्रिका 25,26 में प्रकाशित किया गया है कि ध्यान दें.
हृदय myocytes पृथक और दशकों 32 के लिए अध्ययन किया गया है हालांकि, हाल ही में एक समीक्षा लगातार उच्च गुणवत्ता वाले myocyte सेल isolations 27 चुनौतीपूर्ण बने हुए हैं कि संपन्न हुआ. इस तुलना- की तुलना में एक आम मानक दृष्टिकोण की कमी है, साझा मेटाडाटा, और पारदर्शी सेल गुणवत्ता प्रलेखन प्राथमिक हृदय myocytes के अलगाव के लिए अपेक्षाकृत जटिल प्रोटोकॉल को दर्शाता है. सेल अलगाव प्रोटोकॉल आमतौर पर अलग अलग समूहों द्वारा अनुकूलित कर रहे हैं, सेल आइसोलेट्स की, चर परिणामों का उत्पादन व्यक्तिगत मॉडल सेटिंग्स (जैसे, प्रजाति, आयु, coexisting दिल की स्थिति) पर निर्भर करती है, और आमतौर पर विशेष प्रयोगात्मक शर्तों के लिए समायोजित कर रहे हैं. झिल्ली अध्ययन और प्रोटोकॉल यहाँ प्रस्तुत मात्रात्मक TATS, गुणवत्ता मूल्यांकन और प्रलेखन का एक आवश्यक स्तर के संदर्भ में चयापचय और अलगाव प्रोटोकॉल निर्भर परिवर्तन से ग्रस्त व्यक्ति कोशिका झिल्ली संरचनाओं के confocal या superresolution माइक्रोस्कोपी का सवाल है, दोनोंAM या वी एम में. महत्वपूर्ण बात है, सेल वियोजन की उच्च पैदावार स्वस्थ बरकरार myocytes सुझाव है, भले ही जांचकर्ताओं दस्तावेज़ और समीक्षकों के कारण के कारण विभिन्न प्रकार के विशिष्ट परिवर्तन बनाम अलगाव प्रक्रियाओं के लिए गैर विशिष्ट क्षति बनाम सतह और TATS झिल्ली अखंडता की रूपात्मक मापदंड के खिलाफ सावधानी से प्रत्येक व्यक्ति के सेल न्यायाधीश की जरूरत हस्तक्षेप के रूप में स्थितियों को नियंत्रित करने के लिए की तुलना में. हृदय सेल अलगाव के दौरान एक महत्वपूर्ण चर एक दिया collagenase बहुत की विशिष्ट गतिविधि है. Collagenase के एक नए बहुत चयन करने के लिए, कई collagenase नमूने के enzymatic गतिविधि हृदय myocyte उपज और गुणवत्ता का मूल्यांकन, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार द्वारा एक दूसरे के खिलाफ परीक्षण किया जाना चाहिए. आदर्श रूप में, collagenase के एक नए बहुत पिछले सफलतापूर्वक इस्तेमाल बहुत सारे के समान collagenase गतिविधि के साथ पहचान की है (संभव एंजाइम गतिविधियों की विस्तारित मूल्यांकन के लिए सामग्री और तरीके तालिका में "collagenase बहुत चयन उपकरण" का संदर्भ लें). टीएक साथ aken, TATS झिल्ली दृश्य की मात्रात्मक दृष्टिकोण सेल अलगाव गुणवत्ता और, इसके विपरीत, अलगाव प्रक्रियाओं की महत्वपूर्ण समीक्षा और सुधार को गति प्रदान करना चाहिए TATS माइक्रोस्कोपी द्वारा दस्तावेज के रूप में unspecific झिल्ली क्षति के लिए अग्रणी हृदय सेल isolations पर गंभीर रूप से निर्भर हैं. सेल अलगाव गुणवत्ता और TATS झिल्ली दृश्य और मात्रा का ठहराव आंतरिक रूप से जुड़े हुए हैं के बाद से, इस लेख में चर्चा प्रोटोकॉल एक सतत रणनीति के रूप में सभी प्रमुख पहलुओं को कवर किया.
एक और चुनौती है और हृदय की पढ़ाई, सेल नुकसान और / या सेल नुकसान की आम मुद्दा रोधगलन 9 निम्नलिखित पाचन समझौता उपायों जैसे, की वजह से होते हैं, अभी तक सेल अलगाव के दौरान किसी का ध्यान नहीं हवा का आवेश के बाद, संभावित अनजाने क्षति जैसे खिलाफ न्याय किया जाना चाहिए. रोगग्रस्त दिल से हृदय myocytes के अलगाव अतिरिक्त, महत्वपूर्ण सेल नुकसान के लिए नेतृत्व और सेल की पैदावार में कमी आई हो सकता है. इसलिए, COMPARसेल अलगाव और गिनती लगातार मानकीकृत प्रोटोकॉल के माध्यम से लागू कर रहे हैं अगर नियंत्रण और रोगग्रस्त दिलों के बीच अलग बरकरार कोशिकाओं की कुल संख्या का ison सार्थक हो सकता है. नतीजतन, यह सबसे अच्छा संभव myocyte सेल अलगाव गुणवत्ता को दर्शाता है जो एक उपयुक्त नियंत्रण समूह, के माध्यम से सेल अखंडता न्याय करने के लिए महत्वपूर्ण है. महत्वपूर्ण बात है, व्यक्तिगत सेल गुणवत्ता और myocytes बनाम रोगग्रस्त बनाम स्वस्थ का जीना सेल माइक्रोस्कोपी अनजाने काफी TATS झिल्ली नेटवर्क के विश्लेषण को प्रभावित कर सकते अलगाव की प्रक्रिया से क्षतिग्रस्त. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल इसलिए सेल अलगाव और अक्षुण्ण झिल्ली का जीना सेल माइक्रोस्कोपी के दौरान शारीरिक झिल्ली घटकों की अखंडता और स्थिरता पर जोर. पूरे कार्यप्रवाह इन, membran बाधित झिल्ली नलिकाओं की तरह अलगाव निर्भर झिल्ली कलाकृतियों का प्रदर्शन होगा, प्राप्त करने और क्षतिग्रस्त कोशिकाओं को छोड़कर जबकि बरकरार TATS झिल्ली घटकों की रक्षा करने के लिए एक सतत रणनीति के रूप में बनाया गया हैई blebs, और बदल TATS नेटवर्क ग़लती से आगे मात्रात्मक विश्लेषण नियंत्रण परिस्थितियों में और समझौता. इसके विपरीत, एक ही रणनीति TATS झिल्ली परिवर्तन के साथ सच रोगग्रस्त सेल बनाम सच स्वस्थ के बीच सार्थक तुलना नियंत्रण पर निर्भर है, जो TATS झिल्ली, बाधित करने की क्षमता के साथ हस्तक्षेप अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण हैं.
इसके अलावा, हम पूर्वाह्न कोशिकाओं की तकनीकी रूप से और अधिक चुनौतीपूर्ण अलगाव को प्राप्त करने के लिए प्रक्रियाओं को संबोधित. प्रगति और सुधार प्रोटोकॉल के बावजूद, यह यह वी एम एस के उच्च गुणवत्ता सेल isolations पुन: पेश करने के लिए तुच्छ और भी कम विश्वसनीय एम्स के लिए नहीं है कि जोर देना जरूरी है. इस वीएम कोशिका क्षति के एक हल्के डिग्री के कारण अपेक्षाकृत अधिक सेल सेल निलंबन में कम स्पष्ट हो सकता है, जबकि सेल अलगाव के दौरान भी छोटी त्रुटियों या विविधताओं AM सेल अलगाव की विफलता को पूरा करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं कहाँ हूँ कोशिकाओं के समग्र कम उपज की वजह से है संख्या AM की तुलना में. पूर्वाह्न कोशिकाओं सी बन सकता है के बाद सेकदम 4.3 के तहत उल्लिखित के रूप में अलगाव के बाद urved, कई ROIs के माध्यम से विश्लेषण फायदेमंद हो सकता है. सेल अलगाव कदम की एक विस्तृत प्रक्रिया के बाद हम सीधे अभिन्न झिल्ली धुंधला और confocal या वी एम एस और एम्स के लिए दोनों TATS नेटवर्क की STED superresolution इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. इन प्रोटोकॉल पहले से स्थापित मानकों के माध्यम से दोनों मात्रात्मक विश्लेषण और TATS झिल्ली का चयन करें घटकों के भेदभाव सकें. वी एम एस की तुलना में, 3 डी संगठन और एम्स में आलिंद TATS नेटवर्क के कार्यात्मक व्यवहार वर्तमान में कम समझ रहे हैं.
जीवित कोशिकाओं में छवि TATS झिल्ली प्रक्रियाओं (3.1-3.7 कदम) वाणिज्यिक confocal (सामग्री / उपकरण की तालिका) और कस्टम बनाया STED प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी 9 के साथ विकसित किए गए. फ्लोरोसेंट छवि पीढ़ी और मात्रात्मक TATS विश्लेषण के लिए माइक्रोस्कोप सेटिंग्स का अनुकूलन करने के लिए, निम्नलिखित बातों सामान्य महत्व के होते हैं:
यहाँ प्रस्तुत प्रत्यक्ष विश्लेषण रणनीतियों, TATS झिल्ली और बीमारी संबंधी परिवर्तन का वर्णन पिछले प्रकाशनों के विपरीत फूरियर transf के आधार पर मात्रात्मक रणनीति 16,17, या अप्रत्यक्ष क्षेत्रीय रणनीति के रूप में टी छोटी नली घनत्व के क्षेत्रीय कुल readouts का इस्तेमाल किया हैटी छोटी नली घटक नियमितता 7 का आकलन करने के क्रम में धारीदार झिल्ली संकेतों के ormation विश्लेषण. इसके विपरीत, यहाँ वर्णित मात्रात्मक दृष्टिकोण सीधे व्यक्तिगत TATS घटकों से संबंधित है और झिल्ली नेटवर्क गुण और A-नलिकाओं का प्रतिशत तरह विशिष्ट घटकों सहित अतिरिक्त मापदंडों के एक नंबर प्रदान कर रहे हैं. इसके अलावा, TATS नेटवर्क घनत्व आरओआई क्षेत्र के प्रति पूरे निकाला कंकाल की सामान्यीकृत लंबाई के रूप में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. तीन व्यक्ति की ट्रिपल जंक्शनों की संख्या लगातार जुड़ा छोटी नली घटकों TATS झिल्ली नेटवर्क की शाखाओं में जटिलता का एक उपाय के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. हम सबसे छोटी TATS घटकों के किसी भी विश्लेषण धुंधला प्रक्रियाओं पर निर्भर करता है कि ध्यान दें. हमारे अनुभव में, एक 50 माइक्रोन DI-8-ANEPPS समाधान के 800 μl 50,000 वीएम कोशिकाओं 9 युक्त एक सेल गोली में पूरा TATS नेटवर्क दाग के लिए पर्याप्त हैं. हालांकि, सेल गोली हृदय myocytes की एक कम संख्या में शामिल अगर, शक्तिशाली प्रतिदीप्ति डिटेक्टरों उपलब्ध हैं, और अगर सबसे छोटी झिल्ली के विवरण और मात्रात्मक परिवर्तन रुचि के हैं के बजाय समग्र TATS नेटवर्क वितरण के confocal इमेजिंग, कम डाई सांद्रता अनुभवजन्य परीक्षण के आधार पर इस्तेमाल किया जा सकता है. अंत में, वर्णित विश्लेषण के लिए लिखा एक सॉफ्टवेयर मैक्रो अलग उपचार समूहों (जैसे, ड्रग्स), सेल प्रकार के बीच तुलना के लिए विशेष रूप से उपयोगी है जो बड़े डेटासेट का विश्लेषण, सुविधाजनक बनाने के लिए छवि प्रसंस्करण कदम को स्वचालित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, वीएम बनाम हूँ ), और pathophysiological हस्तक्षेप (जैसे, रोधगलन बनाम नकली).
TATS नेटवर्क की छवि विश्लेषण के लिए, सिद्धांत चरणों का निम्न क्रम लागू किया जाता है: 1) गेंद रोलिंग पृष्ठभूमि घटाव (4.5.1) पृष्ठभूमि तीव्रता में स्थानिक विविधताओं को दूर करने के लिए; 2) स्थानीय विपरीत वृद्धि (4.5.2). 3) छवि समरेखण (4.5.3); 4) सांख्यिकीय क्षेत्र विलय (4.5.4); 5) को परिभाषितछवि binarization की दहलीज (4.5.6); कंकाल डेटा की और 6) गणना (4.5.8). फ्लोरोसेंट TATS छवियों की skeletonization दौरान एक महत्वपूर्ण कदम 6 चित्र में दिखाया छवि binarization है. जुड़े thresholding चरणों अंततः सच झिल्ली संरचनाओं पृष्ठभूमि शोर से त्रुटि से पहचान संभावित झूठी संरचनाओं बनाम अंतर्निहित TATS घटकों का प्रतिनिधित्व करने के लिए पता चला रहे हैं जो परिभाषित. द्विआधारी छवि विश्लेषण के लिए सही सीमा की पहचान confocal और superresolution माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण के लिए एक पर्याप्त उच्च संकेत करने वाली शोर (SNR) अनुपात प्रत्येक पर निर्भर करता है जो सच्चे TATS झिल्ली संरचनाओं, साथ अनुरूप होना चाहिए. इसलिए, एक पर्याप्त छवि गुणवत्ता पहली और उल्लिखित के रूप में बाद में उज्ज्वल क्षेत्र छवियों द्वारा प्रलेखन सहित व्यक्तिगत सेल गुणवत्ता के महत्वपूर्ण निर्णय के साथ संयुक्त स्थापित किया जाना चाहिए. वैकल्पिक विकल्प दिया माइक्रोस्कोप डेटा उत्पादन और / या मानसिक लिए छवि विभाजन प्रोटोकॉल अनुकूलन के लिएiological सवालों छवि deconvolution और ImageJ प्लगइन्स के रूप में उपलब्ध "Otsu" या "आईएसओ डेटा" जैसे अन्य thresholding प्रक्रियाओं में शामिल हैं. भले ही अंतिम विभाजन की प्रक्रिया का, हम छवि ओवरले द्वारा निकाले और कच्चे डेटा के बीच तुलना एक अनिवार्य गुणवत्ता नियंत्रण कदम पर विचार करें. संक्षेप में, व्यक्तिगत पृथक myocytes, intracellular TATS झिल्ली की पर्याप्त धुंधला, प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए पैरामीटर अनुकूलन, और निकाले कंकाल डेटा के ओवरले नियंत्रण की रूपात्मक और झिल्ली अखंडता सभी फ्लोरोसेंट TATS छवियों और मात्रात्मक परिणामों की गुणवत्ता के लिए योगदान देगा.
माउस से बड़ा प्रजातियों सेल अलगाव के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, प्रोटोकॉल तत्काल उचित रूप में रूपांतरित किया जा सकता है. अगले बड़ी प्रजाति के लिए, चूहे दिल एक कुंद 14 जी प्रवेशनी (बाहरी व्यास 2.1 मिमी) के साथ cannulated किया जा सकता है और / मिनट 8 मिलीग्राम पर perfused. गौरतलब है कि पुराने या रोगग्रस्त दिल भी बड़ा प्रवेशनी आकार आवश्यकता हो सकती है. जीन मेंRAL, हृदय छिड़काव जलाशय और महाधमनी के बीच या एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग निरंतर प्रवाह से एक 1 मीटर ऊंची पानी स्तंभ का उपयोग कर, लगातार दबाव जैसे द्वारा या तो आयोजित किया जा सकता है. Collagenase पाचन अंत में निरंतर प्रवाह प्रोटोकॉल से कुछ हद तक नियंत्रित किया जाएगा, जो लीक पोत बेड से अत्यधिक छिड़काव दरों के प्रमुख कोरोनरी प्रतिरोध वाहिकाओं को बाधित करेगा क्योंकि चूहों और चूहों की तरह छोटे कृंतक दिलों से सेल अलगाव के लिए निरंतर प्रवाह फायदेमंद हो सकता है. प्रवाह दर और सही केन्युलेशन की निगरानी बदल रक्त वाहिका प्रतिरोध व्यवहार के साथ हस्तक्षेप मॉडल के लिए और साथ ही सेल अलगाव प्रक्रियाओं का प्रशिक्षण के लिए फायदेमंद है, जो एक प्राथमिकता हैं, इसके विपरीत, यदि लगातार दबाव छिड़काव फायदेमंद है.
ऊपर उल्लिखित के रूप में, पर्याप्त सेल गुणवत्ता अंतर्जात झिल्ली प्रणालियों के मात्रात्मक अध्ययन के लिए बहुत महत्वपूर्ण है. हालांकि, हृदय छिड़काव और collagenase पाचन के दौरान कई कारकों करोड़ कर सकते हैंitically प्रोटोकॉल अनुकूलन या मुसीबत 27 की शूटिंग के दौरान कम करके आंका नहीं किया जाना चाहिए जो सेल अलगाव, की गुणवत्ता को प्रभावित. विशेष रूप से, एक दिया collagenase बहुत की गतिविधि अध्ययन के शेष के दौरान बनाए रखा जाना ब्याज जैसे, अटरिया या अलगाव की स्थिति स्थापित करने के लिए प्रयोगात्मक सदाशयी पढ़ाई के निष्पादन के लिए पहले निलय की विशिष्ट ऊतकों के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए. इसके अलावा, छिड़काव सेटअप के पानी की गुणवत्ता, पीएच, तापमान, अनुकूलन और सफाई contaminants और एम्बोली से अनजाने नुकसान के जोखिम को कम कर देंगे, और संभवतः अतिरिक्त कारकों सेल अलगाव के दौरान इष्टतम समस्थिति की स्थिति स्थापित करने के लिए निरीक्षण किया जा रहा है. BDM (2,3-butanedione-monoxime) मायोसिन- ATPase पार पुल का एक प्रतिवर्ती अवरोध सामान्यतः सेल isolations की पैदावार बढ़ जाती है जो हृदय की मांसपेशी छूट, बनाए रखने के लिए ऊतक विच्छेदन और पाचन के दौरान प्रयोग किया जाता है. फिर भी, जांचकर्ताओं टी की जरूरतओ BDM बंद लक्ष्य प्रभाव जैसे, कुछ शर्तों के 33 के तहत ना + / सीए 2 + विनिमय धाराओं के निषेध के लिए अग्रणी गैर विशिष्ट फॉस्फेट गतिविधियों लागू हो सकता है कि बारे में पता होना. कुछ प्रयोगों के लिए यह विषाक्त और अपेक्षाकृत महंगी cardioplegic समाधान, तथापि, जो micromolar सांद्रता में मायोसिन- के लिए एक उच्च आत्मीयता के साथ एक अवरोध के रूप में blebbistatin द्वारा BDM बदलने के लिए फायदेमंद हो सकता है और अन्य ऑफ लक्ष्य प्रभाव पड़ सकता है. आराम स्वस्थ cardiomyocytes आगे के विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए बिजली की उत्तेजना और ऐसी कोशिकाओं के अभाव में किसी भी संकुचन नहीं दिखाना चाहिए. दूसरी ओर, शारीरिक कोशिकी Ca 2 सांद्रता में बिजली की उत्तेजना के जवाब में हृदय myocyte संकुचन और छूट पर स्वस्थ नियंत्रण बनाम हृदय रोग में कार्यात्मक सेल गुणवत्ता और / या असामान्य व्यवहार का आकलन करने के लिए एक अतिरिक्त उपाय के रूप में सामान्य सिकुड़ा व्यवहार को स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कोशिकाओं.
<p class="सारांश" में "jove_content">, एकल कोशिका अलगाव और यहाँ वर्णित मात्रात्मक छवि विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक कोशिकाओं 21 के साथ ही के लिए में microtubule नेटवर्क की मात्रात्मक विश्लेषण वी एम 9 में TATS झिल्ली नेटवर्क के confocal और superresolution माइक्रोस्कोपी के लिए आवेदन कर रहा हूँ किया गया है निश्चित हृदय myocytes (नहीं दिखाया डेटा). ऐसे विभिन्न विकासात्मक चरणों में TATS झिल्ली के लक्षण वर्णन या TATS नेटवर्क से संपर्क करें कि झिल्ली जुड़े प्रोटीन या organelle संरचनाओं के विश्लेषण के रूप में प्रयोगात्मक सवालों की एक किस्म के लिए रास्ते खोल सकता है प्रोटोकॉल के इन और भविष्य अनुप्रयोगों अत्यधिक, डोमेन विशिष्ट संकेत स्थानीयकृत लागू करने के लिए AM और वीएम कोशिकाओं में कार्य करता है.The authors have nothing to disclose.
This work received support through Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 1002 (subprojects A05 and B05 to S.E.L.) and KFO 155 (subproject 4 to S.E.L.), a Halbach Foundation award to S.E.L. supporting E.W.; a grant from the German Cardiac Society to S.B.; and a DAAD exchange program supporting T.K. as visitor at the University of Maryland. The research leading to these results has received funding from the European Community’s Seventh Framework Program FP7/2007-2013 under grant agreement No. HEALTH-F2-2009-241526, EUTrigTreat (to S.E.L.). S.E.L. is a principal investigator of the German Center of Cardiovascular Research (DZHK).
Chemicals and enzymes | |||
2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | B0753 | |
Bovine calf serum | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | SH30073 | Triple 0.1 µm sterile filtered. |
CaCl2 | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | 21115 | Diluted 1:10 in MQ water to obtain 100 mM CaCl2 stock concentration. |
Collagenase type II | Worthington via Cell Systems, Troisdorf, Germany | on request | Enzymatic activity depends on individual collagenase batches. Collagenase II and other enzyme activities (Caseinase, Clostripain, Tryptic) can be assessed in the "collagenase lot selection tool". Determine cell yield and quality individually for each new lot of collagenase. |
Glucose | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | HN06.1 | |
Heparin | Rotexmedica, Trittau, Germany | PZN-03862340 | Diluted in 0,9 % NaCl and injected subcutaneuosly in abdominal skin. |
HEPES | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 9105.4 | |
Forene 100% (V/V) | Abbott, Libertyville, IL, USA | B506 | Active agent: isoflurane, 250 ml. Use approximately 2 Vol% in air/oxygen dispenser instrument. |
KCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6781.3 | |
KH2PO4 | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3904.2 | |
Laminin (2 mg/ml) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 354232 | Lamination is described under step 2.1. |
MgCl2 · 6 H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2189.2 | |
MgSO4 · 7 H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8283.2 | |
Na2HPO4 · 2 H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4984.2 | |
NaHCO3 | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | HN01.1 | |
Taurin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4721.2 | |
Dyes | |||
Di-8-ANEPPS | Molecular Probes, Life Technologies, Darmstadt, Germany | D-3167 | Stock solution 2 mM in DMSO |
Trypan blue | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | T8154 | Trypan blue is gently mixed 1:1 via tip-cut 1 ml plastic pipette with cell suspension prior to cell counting in Neubauer cytometer. |
Langendorff perfusion setup | |||
Circulation thermostat | Lauda, Lauda-Königshofen, Germany | Please refer to Louch et al. (JMCC 2011). Heat up thermostat und buffers in perfusion tubing to 37 °C 15 min prior to use. | |
Flexible silicone tubing Tygon for peristaltic pump | VWR, Darmstadt, Germany | 224-2252 | Tubing needs to be changed regularly. |
Flexible silicone tubing Tygon for thermostat | VWR, Darmstadt, Germany | 228-4340 | |
Heating coil surroundung perfusion tubing | Rettberg, Göttingen, Germany | custom-made | Heating coil and tubing needs to be cleaned thoroughly via MQ water after using. Do not use detergents. Glass components should be bathed regularly in 10 mM NaOH overnight. |
Peristaltic pump | Ismatec, Wertheim, Germany | ISM830 | |
Three way stop cock Discofix C Luer Lock 10 cm | Braun, Melsungen, Switzerland | 16500C | |
Three way stop cock Discofix 3SC | Braun, Melsungen, Switzerland | 4095146 | |
Instruments | |||
42 mm glass coverslips | Menzel Gläser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany | on request | 0.13 – 0.16 mm thickness |
Cannula 21G | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lake, NY, USA | 304432 | Cut to a length of ~ 5 mm, roughened with sandpaper. |
Coverslips for Neubauer cytometer 24 x 24 mm | Menzel Gläser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany | on request | 0.38 – 0.42 mm thickness |
Graefe forceps, 0.5 mm tips, slight curve | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11151-10 | |
LSM 710 NLO | Carl Zeiss, Jena, Germany | 63x 1.4 NA oil objective | |
Neubauer improved cytometer | Labor Optik, Friedrichsdorf, Germany | 1100000 | Counting procedure: Wipe cytometer and coverslip provided with the counting chamber with 70 % ethanol. Press coverslip gently on the counting chamber so that the two glass surfaces are in contact and Newton's rings can be observed. Subsequently, 10 – 20 µl cell suspension can be applied to the edge of the coverslip to be sucked into the void by capillary action. Count the intact vs. defect myocytes using the squares of the cytometer grid which reflects 100 nl. Repeat counting procedure on the second grid provided on the cytometer. Calculate the density of cells in your original cell suspension by taking account of any dlutions and counting shortcuts. |
POC-R2 Imaging Chamber | Pecon, Erbach, Germany | Cell suspension volume: 800 µl; desired plating density: ~ 1000 AM and ~ 10,000 VM | |
Spring scissors, 8 mm blades straight, blunt | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 15025-10 | |
Student dumont #7 forceps, inox | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91197-00 | |
Student iris scissors, curved, 11.5 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91461-11 | |
Student iris scissors, straight, 11.5 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91460-11 | |
Student surcigal scissors, straight, sharp, 12 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91402-12 | |
Tissue forceps, 1×2 teeth, slim, 10 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11023-10 |