Bestimmung der Protein-Ligand-Wechselwirkungen mit Differential Scanning Fluorimetrie
Summary
Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.
Abstract
Eine breite Palette von Methoden sind derzeit für die Bestimmung der Dissoziation zwischen einem Protein konstant und die Interaktion kleine Moleküle zur Verfügung. Allerdings sind die meisten von ihnen ist der Zugriff auf spezielle Ausrüstung, und erfordern oft eine gewisse Kompetenz, um effektiv zu etablieren zuverlässige Experimente und Daten zu analysieren. Differential Scanning fluorimetrisch (DSF) wird zunehmend als eine robuste Methode zur ersten Screening von Proteinen zu interagieren kleine Moleküle, entweder zur Identifizierung physiologischen Partnern oder für Hit Entdeckung eingesetzt. Diese Technik hat den Vorteil, dass es nur eine PCR-Maschine für die quantitative PCR und so geeignete Instrumentierung ist in den meisten Einrichtungen benötigt; Eine exzellente Auswahl von Protokollen sind bereits verfügbar; und es gibt starke Präzedenzfälle in der Literatur für mehrere Anwendungen des Verfahrens. Frühere Arbeiten mehrere Mittel zur Berechnung Dissoziationskonstanten von DSF Daten vorgeschlagen, aber diese sind mathematisch anspruchsvoll. Hier haben wir DMonstrate Verfahren zum Schätzen Dissoziationskonstanten von einer moderaten Menge an DSF experimentellen Daten. Diese Daten können in der Regel gesammelt und an einem einzigen Tag analysiert werden. Wir zeigen, wie verschiedene Modelle verwendet werden, um Daten von der einfachen Bindungsereignisse gesammelt zu passen, und wo kooperative Bindung oder unabhängige Bindungsstellen vorhanden sind. Schließlich präsentieren wir ein Beispiel für die Datenanalyse in einem Fall, wo Standard-Modelle nicht gelten. Diese Methoden werden mit den Daten auf handelsüblichen Kontrollproteine gesammelt und zwei Proteine, die von unserem Forschungsprogramm veranschaulicht. Insgesamt bietet unsere Methode eine einfache Möglichkeit für die Forscher, um schnell zu gewinnen weitere Einblicke in Protein-Ligand-Interaktionen mit DSF.
Introduction
Alle Proteine binden, mit unterschiedlichen Affinitäten, um eine breite Palette von anderen Molekülen aus einfachen Ionen zu anderen großen Makromolekülen. In vielen Fällen, Proteine zu binden, um kleine Molekül Partner als Teil ihrer normalen Funktion (beispielsweise eine Kinase-Bindung an ATP). Andere Wechselwirkungen kann unabhängig funktionieren können, sind jedoch experimentell nützlich als Werkzeuge (beispielsweise kleine Moleküle, Proteine zu stabilisieren, um die Kristallisation Erfolg zu verbessern oder zu unterstützen bei der Aufrechterhaltung der Proteine in Lösung); während kleine Moleküle, die an aktiven Stellen und allosterischen Zentren von Proteinen binden kann, als Inhibitoren wirken, und so modulieren die Aktivität von Enzymen.
Es gibt eine Vielzahl von Techniken, die verwendet werden kann, um die Affinität der Proteine für die Partner-Moleküle zu bestimmen. Isothermen Titrationskalorimetrie 1 wird allgemein als "Goldstandard" angesehen, da es reich Informationen über Reaktionen ist Etikett kostenlos, und hat für einen begrenzten Möglichkeitenrtifacts des Experiments. Trotz der jüngsten Verbesserungen in der Empfindlichkeit der Instrumentierung und Automatisierung der Versuchsaufbau ist es jedoch immer noch in Bezug auf die Proteinbedarf relativ teuer, hat im besten Fall einen niedrigen bis mittleren Durchsatz und ist am besten geeignet, um Interaktionen mit mittelschwerer bis hohe Affinitäten (10 nM bis 100 uM K d) 2. Andere Label freie Verfahren wie Oberflächenplasmonenresonanz-oder Doppelschicht-Interferometrie 3 bieten höhere Durch und haben die Empfindlichkeit erreicht werden, um kleinere Moleküle so niedrig wie 100 Da zu erkennen. Allerdings sind hohe Durchsatz Instrumente für diese Methoden vergleichsweise teuer sind, werden nur gerechtfertigt, wenn es eine ständige Durch relevanter Projekte, und so dürften unzugänglich vielen akademischen Laboratorien zu sein.
Differential-Scanning-Fluorimetrie (DSF oder thermofluor) wurde erstmals 2001 4 als ein Verfahren zur Wirkstoffsuche beschrieben. In diesem method werden die Proteine mit einem Fluoreszenzfarbstoff inkubiert (zunächst Naphthalin-Sulfonsäure-Farbstoffe verwendet wurden), die ihre Fluoreszenz bei der Bindung an den hydrophoben Bereichen der Proteine verändert. Das Protein-Farbstoff-Probe wird dann erwärmt, und die Fluoreszenz überwacht die Wärme ansteigt. Die Entfaltung des Proteins, und die Belichtung des hydrophoben Teile des Proteins, verursacht eine charakteristische Muster in der Fluoreszenz als eine Funktion der Temperatur (Abbildung 1a). Das Experiment kann in kleinen Mengen in kommerziellen quantitativen PCR-Gerät durchgeführt werden, so dass in einem einzigen Experiment kann eine große Anzahl von Proben gleichzeitig getestet werden (gewöhnlich 48, 96 oder 384 Proben, je nach Gerätetyp). Experimente können in der Regel in der Nähe von einer Stunde durchgeführt werden, wodurch die Möglichkeit einer Hochdurchsatzanalyse der Proben 5.
Weitere Verbesserungen der Methodik haben die Annahme von Farbstoffen mit besseren spektralen Eigenschaften 6,7 gesehen </sup>, generische Instrumente zur Datenanalyse, und schlug vor, Protokolle für die ersten Screening 8,9. Die Bandbreite der Anwendungen des Verfahrens auf die Einrichtung optimale Bedingungen für die Herstellung und Lagerung von Proteinen 10 und auf die Identifizierung von potentiellen Bindungspartnern, um die Kristallisation 11 Beihilfen erweitert worden, mit einem besonderen Fokus. Die relativ hohe Durchsatz der Methode, mit relativ geringen Kosten in Protein (~ 2 g pro Reaktion), und die Anwendbarkeit zur Untersuchung schwach bindende Moleküle hat DSF einen wertvollen Werkzeug für Fragment basiertes Wirkstoffdesign, vor allem im akademischen Kontext 12-14.
Trotz der breiten Anwendung des DSF zum Studium von Protein-Ligand-Wechselwirkungen haben nur wenige Studien Bestimmung von Dissoziationskonstanten aus diesen Studien beschrieben. Allerdings sind diese tendenziell detaillierten Gleichungen zur Beschreibung der Entfaltung des Proteins, mit vielen Parametern, die zu wenige Daten oder in einigen Fällen E montiert werden muß produzierenstimated 7,15-17. Diese Methoden sind von besonderer Bedeutung in schwierigen Fällen, wie dicht verbindlich Verbindungen oder Proteine, die ungewöhnliche Übergängen. Jedoch für viele Labors sind diese detaillierte Analysen zu umständlich für den Routineeinsatz. Wir haben daher alternative Behandlungen schlagen für verschiedene Szenarien und zeigen, wie diese verwendet werden, um Daten aus verschiedenen Protein-Ligand-Wechselwirkungen, die zu passen. Unsere Methode verwendet das StepOne qPCR Instrument, für die maßgeschneiderte Datenanalyse-Software ist vorhanden; Während dies beschleunigt die Datenanalyse, können die Ergebnisse von anderen Instrumenten mit zuvor veröffentlichten Verfahren 9 bearbeitet werden, und dasselbe stromabwärts Analyse durchgeführt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Differential Scanning fluorimetrisch hat seine Macht als robuste und vielseitige Methode zur Charakterisierung von Proteinen und Identifizierung potenzieller Proteinliganden gezeigt. Die gut dokumentierten Erfolge bei der Beschleunigung Proteinstabilisierung, Arzneimittelforschung (vor allem in weniger gut finanzierten Laboratorien) und Kristallisation 10,23-25 haben sie eine attraktive Methode für die anfängliche Screening von Verbindungen hergestellt. Verbindungen, Proteine hinzugefügt zeigen eine klare Dosis-abhängigen Anstieg der scheinbaren Schmelztemperatur 7,9. Jedoch gab es einige Versuche, um die Ergebnisse aus diesen Experimenten verwendet, um scheinbare Bindungskonstanten in der Rangfolge von Verbindungen auf ihre Affinität zu helfen zu bestimmen. Hier stellen wir ein Verfahren zum systematischen Bestimmen einer scheinbaren Dissoziationskonstante von Proteinen in Gegenwart eines Liganden.
Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass DSF schnell und robust stellen Schätzungen der Dissoziationskonstante fürein Protein-Ligand-Kombination. Die beobachteten Daten können mit handelsüblichen Werkzeugen manipuliert werden, um eine schnelle Bestimmung der K d zu schaffen, ohne dass Annahmen über den wahrscheinlichen Wert der Parameter vorzunehmen. Das Verfahren hat einen wesentlichen Vorteil gegenüber einer vergleichbaren Verfahren, sparsam sowohl Protein und Zeit erforderlich. Das hier beschriebene Experiment wird 0,13 mg Protein verbrauchen pro Versuch (etwa 0,4 mg für Experimente in dreifacher Ausfertigung wiederholt). Dieser Vergleich mit isothermer Titrationskalorimetrie (ITC), in einem einzigen Experiment mit durchschnittlich 40 kDa-Protein eine ähnliche Menge zu verbrauchen. Der vollständige Satz von Experimenten für dieses Protokoll erforderlich wäre, etwa 4 Stunden, einschließlich der Herstellung verbraucht, für eine Reihe von Experimenten. Auch dies ist wahrscheinlich sehr viel schneller als Verfahren, wie ITC oder Oberflächen-Plasmon-Resonanz, die während leistungsfähige erfordern oft erhebliche Optimierung besten Daten zu erzielen.
Unsere Ergebnisse zeigen, dass es nach wie vor ein Bedarf an sorgfältig die Rohdaten, die Anpassung der Daten an die Schmelztemperatur zu bestimmen, und die Passform des Schmelztemperaturdaten an die Dissoziationskonstante zu bestimmen. Ein erstes Problem ist die Form der in dem Protein Schmelzen hergestellt Rohdaten. In einigen Fällen kann die Form nicht auf die in 1A beobachtet nähern. Häufige Probleme sind geringe Temperaturschwankungen auf die Ligandenbindung, hohe Hintergrundfluoreszenz, und ungewöhnliche mehrere Übergänge in der Temperatur. Niedertemperatur-Verschiebungen auf der Bindung von Liganden eine Reihe gesehen. Für dieses Verfahren ist der kritischste Parameter der Fehler in der T m-Messung, verglichen mit der Temperaturverschiebung. Die Daten können in der Regel relativ gut ausgestattet, wenn die Standardabweichung von Dreifachmessungen nicht 10% der Schmelztemperatur Verschiebung zwischen ungebundenem und gebundenem Protein vollständig nicht übersteigt. Unsere Erfahrung ist, dass, wenn diese Temperaturratur Verschiebungen sind nur 2 ° C, kann dies ausreichend für die Montage der Daten, wenn die einzelnen Datenpunkte sind sehr genau. Ein zweites Thema ist ungewöhnlich geformte Kurven. Diese unterscheiden sich oft von freiem Protein und Ligand gebundenen Formen, wie die Ligandenbindungsarten beeinflusst Entfaltung des Proteins. In diesen Fällen muss der Benutzer prüfen, ob die Daten mit angemessenen Berücksichtigung der Modelle verwendet werden, um für die Bestimmung der Schmelztemperatur und der Dissoziationskonstante eingesetzt werden. Ein weiteres häufiges Problem ist, dass die Zugabe von Cofaktor an das Protein (zB MgCl 2 in unserem Beispiel mit Hexokinase) erforderlich, um verlässliche Daten zu erhalten. Unsere Erfahrung hat in der Phase der Ausgangswerte unter wesentlich ist für den Erhalt der besten Ergebnisse waren, daß eine sorgfältige Abwägung aller Faktoren wahrscheinlich in dem Experiment. Darüber hinaus können alternative Behandlungen theoretischen Eigenschaften dieser Daten 15,17 offenbaren. Schließlich ist es nicht ungewöhnlich, dass einige Proteine, contain nativ exponierten hydrophoben Regionen zu hohen Hintergrundfluoreszenz zeigen. Es gibt eine Anzahl von Lösungen für diese Probleme, die an anderer Stelle 6,9 bewertet wurden.
Insbesondere kann der Benutzer prüfen, ob ein an die Boltzmann-oder abgeleitete Modelle (beispielsweise 4), und im Fall der Verwendung von Derivaten, ob mehrere Schmelzen modelliert werden verwendet. Die beiden Methoden der Modellierung des thermischen Entfaltungs unterscheiden, dass die Boltzmann-Methode passt die experimentellen Daten an die Boltzmann-Gleichung, unter der Annahme einer regelmäßigen S-Form auf die Entfaltungskurve. Im Gegensatz dazu nimmt die Ableitung Verfahren der ersten Ableitung der experimentellen Daten an jedem Punkt (unten in Figur 1A), und hält die Schmelztemperatur der Punkt der höchsten ersten Ableitung sein. Das Derivat im allgemeinen Verfahren liefert eine höhere Schmelztemperatur um ca. 2 – 3 ° C beträgt. Die meisten Proteine wird eine konsequentere RückErgebnis (dh niedriger ist der Standardfehler der Schmelztemperatur für Dreifachversuche) für eine der beiden Methoden. Dies ist normalerweise eng mit der präzisen Form des Proteins Entfaltungskurve bezogen, und es ist erforderlich, empirisch zu bestimmen, die beste Methode in jedem Fall. Wobei die Ableitung Modell verwendet wird, ist es auch wichtig, mehrere Schmelz Ereignisse zu berücksichtigen. Einige Daten zeigen deutlich Beweise für mehrere Übergänge, und in diesen Fällen sind die Ergebnisse wahrscheinlich einfacher zu interpretieren, wenn diese mehrere Schmelz Ereignissen modelliert. Im Rahmen dieses Protokolls ist es oft der Fall, dass die Zugabe des Liganden kann zu einem Protein von mit mehreren Schmelzübergänge zu einem einzigen Übergang ändern (zB durch Stabilisierung der meisten thermisch instabil Domäne) oder umgekehrt. Wir würden uns daher dafür ein, dass die Rohdaten zusammen vor der Prüfung, welcher Ansatz am besten zu nutzen sein wird, untersucht.
Nach der modelling der einzelnen Schmelztemperaturen können weitere Probleme bei der Anpassung dieser an die in dem Protokollabschnitt dargestellt Modelle ergeben. Es ist zwingend notwendig, sorgfältig zu prüfen, um die Passform der Dissoziationskonstante Gleichung einer logarithmischen Skala, wie diese Analyse oft betont Diskrepanzen zwischen den beobachteten Daten und dem Modell (e .B., Abbildung 3). Während die erhaltenen Ergebnisse sind in der Regel robust, Pflege in der Interpretation bietet die Möglichkeit, bessere Ergebnisse zu extrahieren, und die meisten Sinn, aus den Daten.
Ein besonderes Problem durch diese Daten erhoben ist die Interpretation, die auf Proteine, die Kooperativität zeigen oder mehrere Bindungsereignisse platziert werden soll, in DSF. Wir haben bis heute nur beobachtet, dieses Phänomen in Proteinen, die erwartet, mehrere spezifische Bindungsereignissen (zB WcbM, ein Protein, dessen beste Homolog ist ein Multimer 26 und die als Multimer von Grßenausschlußchromatographie wirkt [Daten nicht sindgezeigt]). Es ist überhaupt nicht klar, dass die in DSF Denaturierung beobachteten negativen Kooperativität zeigt an, dass das Enzym wird letztlich zeigen negativer Kooperativität: eher, kann dies ein Hinweis auf komplexe Bindung, die mehr gründlich mit einem breiteren Spektrum von Methoden erforscht werden müssen. Dies läßt darauf schließen, uns jedoch, dass umfangreichere Studien solcher Proteine wahrscheinlich, um interessante Effekte zu identifizieren.
Die für die Dissoziationskonstante dieser Methode bestimmten Werte sind in der Regel von der gleichen Größenordnung wie diejenigen, die durch andere Verfahren, wie beispielsweise isotherme Titrationskalorimetrie und Oberflächenplasmonresonanz ist. Jedoch sind die Absolutwerte beobachtet häufig höher als unter Verwendung dieser Verfahren beobachtet. Dies ist zumindest teilweise eine Folge der Tatsache, dass die Dissoziationskonstante wird bei der Schmelztemperatur des Proteins mit Liganden beobachtet. Diese K d ist im allgemeinen höher als die bei physiologischen Temperaturen. Die dissociation konstant bezogen auf die Temperatur der Reaktion, die durch die Gleichungen:
[1]
[2]
(Wobei θ c ist die Standard-Referenzkonzentration, Δ r G der Gibbs-Energie Veränderung der Reaktion ist, R die molare Gaskonstante ist, Δ H der Enthalpieänderung in dem Reaktions und Δ S die Entropie Änderung der Reaktions .)
Reaktionen mit Dissoziationskonstanten im messbaren Bereich dieses Verfahren im allgemeinen einen negativen Δ r G, so dass die Wirkung einer Erhöhung der Temperatur auf die Gleichung [1] wird die Dissoziationskonstante zu erhöhen. Sowohl die Δ H und Δ S Begriffe, die Gibbs-Energie darstellen (Gleichung [2]) sind Temperature abhängigen 27, und die Wirkung auf die Dissoziationskonstante wird von der Größe und dem Vorzeichen dieser Temperaturabhängigkeiten ab und wird notwendigerweise Interaktion abhängig ist. Folglich ist es nicht unerwartet, daß die nach diesem Verfahren ermittelte Dissoziationskonstanten sind manchmal größer als die Methoden, die bei Raumtemperatur betrieben werden bestimmt. Temperaturabhängigkeit ist natürlich auch eine Einschränkung der vielen anderen Verfahren, die dazu neigen, die Dissoziationskonstante bei Temperaturen unterhalb der physiologischen Temperatur bereitzustellen.
Weitere Einschränkung des DSF-Methode ist, daß es ein markiertes Verfahren, anders als ITC. Die Fluoreszenzmarkierung verwendet (SYPRO orange) ist hydrophob, und so in einigen Fällen mit der Bindung von Liganden an Proteine hydrophobe konkurrieren können. Folglich ist es wahrscheinlich, dass in einigen Fällen die Dissoziationskonstante erhalten werden künstlich durch die Konkurrenz mit der Bezeichnung angehoben werden. Jedoch für den Vergleich von verschiedenen Liganden (die primäre Verwendung vonDSF), sind die Unterschiede kaum signifikant genug, um die Rangfolge von Verbindungen, die durch Affinität beeinträchtigt zu sein.
Ein möglicher Nachteil dieser Methode ist die Nachweisgrenze, die erreicht werden kann. Im Prinzip sollte es nicht möglich sein, einen Wert für K d, die kleiner als 50% der Proteinkonzentration und sogar Werte in diesem Bereich wahrscheinlich von zweifelhafter Genauigkeit ist es genau zu messen. Während die Nachweisgrenze in diesem Ende des Bereichs kann ein wenig durch die Reduzierung der Konzentrationen von Protein und Farbstoff verlängert werden, wird die Empfindlichkeit des Instruments weitere Verringerung der Proteinkonzentration zu verhindern. In ähnlicher Weise wird das obere Ende der Empfindlichkeit durch die Löslichkeit des Liganden bestimmt werden. Eine mathematisch robuste Schätzung für K d zu erhalten, ist es sehr wichtig, um Daten mit 90% der in den Liganden-gebundenen Form vorliegt Protein, das Ligandenkonzentrationen erfordert als ca.-Angaben zu erhaltenly zehnmal K d (Annahme, dass keine Kooperativität). Die Nachweisgrenze wird daher notwendigerweise ein Zehntel der Löslichkeit des Liganden in der betreffenden Puffer sein. Dies bedeutet, daß die Nachweisgrenze der Methode liegt typischerweise im Bereich zwischen 1 um und zwischen 1 und 100 mm, abhängig von dem Protein und dem Liganden.
Zusammenfassend ist ein Differential-Scanning-Fluorimetrie vielseitige Technik für eine breite Palette von Proteinen. Verwendung der hier vorgestellten Verfahren ist es möglich, schnell und kostengünstig bestimmt die Affinität des Proteins für die verschiedenen Liganden. Dies hat ein großes Potenzial für die Anwendung in der Proteinreinigung und Stabilisierung, die Aufklärung der Funktion oder Spezifität von Enzymen aus Metagenomen, und in der Wirkstoffforschung, vor allem in kleinen Labors.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by grant from the BBSRC (grant number BB/H019685/1 and BB/E527663/1) to the University of Exeter.
Materials
| StepOne real time PCR instrument | Life Technologies | 4376357 | DSF can be performed with many other instruments. The StepOne instrument has very convenient software for data analysis. |
| Protein thermal shift software v1.0 | Life Technologies | 4466037 | |
| MicroAmp Fast optical 48-well plates | Life Technologies | 4375816 | |
| Optical sealing tape | Life Technologies | 4375323 | Bio-rad part no. 223-9444 is an alternative supplier |
| U-bottomed 96-well plates | Fisher | 11521943 | |
| SYPRO Orange | Life Technologies | S6650 | For a smaller volume supplier, use Sigma part no. S5692 |
| SPSS statistics version 20 | IBM | N/A | Other statistics packages will provide similar functionality |
| GraphPad Prism 6.02 | GraphPad | N/A | Other statistics packages will provide similar functionality |
| Hand applicator (PA1) | 3M | 75-3454-4264-6 | |
| Hexokinase from Saccharomyces cerevisiae | Sigma-Aldrich | H5000 | |
| Glucose | Fisher scientific | 10141520 |
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