차 소장 Organoid 문화에서 레트로 바이러스 감염의 비디오 프로토콜

다음 프로토콜에 사용 된 모든 마우스는 무균 상태를 유지하고, 모든 절차는 영국 홈 오피스 규정에 따라 수행되었다. 1 준비 사용에 앞서 미디어 1 시간을 준비 적어도 10 분 사용하기 전에 37 ° C의 물을 욕조에 사전 따뜻한 (표 1 및 재료 목록 자세한 내용 참조). 2 배양 소장 (SI) Organoids 참고 : 달리 명시되지 않는 한, 모든 인큐베이션은 가습 배양기에서 37 ° C, 5 % CO 2에서 수행됩니다. 살아있는 세포와 접촉 장비 및 시약은 멸균해야합니다. 사전 예열이 지하 매트릭스 (마트 리겔 또는 BME)이 시드 때 퍼지는에서 드랍 방지로 조직 배양 플레이트 것이 중요합니다. 또한, 지하 행렬은 항상 얼음에 보관해야합니다. -20 ° C와 해동에서 보관사용하기 전에 얼음에. 납골당을 분리 소장의 격리를 위해 그 때, 국가 규칙 및 규정에 따라 마우스를 희생의 뒷면에 동물을 배치하고 70 % 에탄올로 복부를 씻는다. 흉골에 사타구니에서 길이 중간 선 절개를 수행합니다. 먼저, 피부 후 피하 조직을 잘라. 위장 맹장에서 소장을 제거합니다. 십이지장, 소장 및 회장에서 분리 된 납골당은 organoid 문화에 사용할 수 있습니다. 칼슘 또는 마그네슘 (PBS0)없이 미리 냉각 된 인산염 완충 식염수와 격리 소장을 씻으십시오. 3~5cm 긴 조각으로 조직을 절단하고 길이 방향으로 자르면 가위를 사용합니다. 집게를 사용하여 조직을 확산. 커버 슬립을 사용하여 융모를 다 쳤어요. 주의, 너무 많은 힘이 찢어 조직의 원인이됩니다 및 단계는 다음의 지하실의 수율을 감소시킬 것이다. 미리 냉각 된 PBS0 날기를 함유 50ml를 튜브에 조직을 이동시켜g 집게. 격렬 통해 조직 조각을 씻고 PBS0을 변경합니다. 2 ~ 3 배를 반복하거나 PBS0 덜 흐린 꺼질 때까지. 튜브 롤러에 4 ° C에서 30 분 동안 1 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)와 PBS0의 30 ML을 포함하는 50 ML 튜브에서 조직을 품어. 적극적으로 튜브를 흔들 5 mM의 EDTA와 PBS0의 30 ML을 포함하는 또 다른 50 ML 튜브에 조직을 전송합니다. (이전에 조직 포함)을 1 mM의 EDTA 용액 소낭 및 융모의 혼합물을 포함 할 것이다. 종종 융모의 높은 비율로 포함 분획이 organoids의 시드에 적합하지 않다. 튜브 롤러에 4 ° C에서 1 시간 동안 조직을 더 품어. 적극적으로 튜브를 흔들 깨끗한 50 ML 튜브에서 솔루션을 수집합니다. 지하실의 존재를 확인하고 광학 현미경에 의해 50 μL의 지하실을 계산하여, 예를 들어 수를 추정한다. 50-100 지하실을 구하여 1.5 ML의 t에 전송하는 데 필요한 양을 계산우베. 5 분 동안 300 XG에 스핀. 상층 액을 버리고 미리 예열 24 웰 플레이트에 지하 행렬의 50 μL에서 펠렛 종자를 재현 탁. 지하 행렬은 중합 있도록 5 ~ 15 분 동안 조직 문화 인큐베이터에서 접시를 품어. 500 μL ENR 매체와 오버레이 (표 1 참조). 작은 원형 낭성 모양을 보여줍니다 organoids 파종 후와 구조 신진 다른 2-3일 후 약 24 시간이 표시됩니다. 3 일마다 신선한 ENR 미디어로 변경합니다. 항로는 7 일마다 문화를 organoid. 계대 및 유지 Organoids 매 3 일 통과 한 미디어를 새로 고쳐 organoids 유지 : 루멘은 죽은 세포, 약 7 일마다 가득 채워져 5로 : 3 일. 1 ml의 pipetman 팁을 사용하여 매체 지하 매트릭스 돔 휴식 및 1.5 ML 튜브에 잘에서 전송합니다. 기계적 피펫을 통해 organoids을 떼어 놓다pproximately 50 배 벌금 (예를 들어, 200 μL) 팁을 사용. 5 분 동안 300 XG에 스핀. 뜨는을 취소하고 지하 행렬의 150 ~ 250 μL에 펠렛을 재현 탁. 씨앗 24 웰 플레이트 (/ 웰 지하 행렬의 50 μl를) 사전은 따뜻하게. 코팅 한 지하 행렬 상하 팁의 벽을 피펫 파종 전에. 피펫은 천천히 확산 지하 행렬을 방지하기 위해 잘 중간에 거품과 씨앗을 방지 할 수 있습니다. 이 웰의 중심에 지하 행렬의 돔을 얻는 것이 바람직하다. 지하 행렬은 중합 있도록 5 ~ 15 분 동안 조직 문화 배양기에서 배양한다. 물론 당 500 μL의 ENR 미디어와 오버레이. 3 전 감염 SI Organoids의 치료 NOTE도 1은 형질 도입 절차를 도시한다. ENRWntNic에 환율 ENR은 중간 (표 1 참조) t에 organoids 성장삼일 또는 그들이 낭성 형태를 채택 할 때까지 최소 자신의 매체. 니코틴 아미드 (닉) 문화 효율을 개선하면서 Wnt3a는 줄기와 Paneth 세포의 수를 증가시킨다. 4 바이러스 생산 플래티넘-E 세포 중 하나 150mm의 요리는 감염에 필요한이. 종자 약 퓨로 마이신 (1 μg / ml) 및 블라스트 (10 μg / ㎖)의 존재 하에서 15 ~ 18 ㎖의 매체 (DMEM + 10 % FBS) 5 × 106 세포. 그들은 70~80%의 포화 상태에 도달 할 때 2 ~ 3 일 후에 세포를 형질. 퓨로 마이신없이 형질 전환 이전에 블라스트 DMEM + 10 % FBS에 매체를 변경합니다. OPTI-MEM 1 ㎖를 포함하는 튜브를 분리하는 폴리에틸렌 이민 (PEI)의 레트로 바이러스 DNA 구조의 30 μg과 240 μl를 추가합니다. 혼합하고 5 분 동안 실온에서 배양한다. 이 솔루션을 수영장과 20 ~ 30 분 동안 실온에서 배양한다. 플래티넘-E 세포의 매체에 완전한 혼합물을 추가하고 조심스럽게 작은지면을 흔들전자는 DNA-PEI 단지의 동등한 분배를 보장합니다. 밤새 형질 전환 혼합물과 백금-E 세포를 품어 매체에게 다음과 같은 일을 새로 고칩니다. 이일을 위해 새로운 매체의 세포를 유지합니다. , 50 ML 팔콘 튜브 만 매체를 수집 12-16 시간 동안 4 ° C에서 8,000 XG에서 0.45 μm의 필터와 원심 분리기를 통해 전달합니다. 상등액을 버리고 전달 매체의 250 μL에 펠렛을 재현 탁 (표 1 참조). 5 Organoid 조각 준비 한 감염은 24 웰 플레이트에서 잘 하나가 필요합니다. 1 ml의 pipetman 팁을 사용하여 매체 지하 매트릭스 돔 휴식 및 1.5 ML 튜브로 전송할 수 있습니다. 미세한 볼륨 팁 (예를 들어, 200 μL 팁) 피펫 (30-50x)를 통해 organoids를 기계적으로 방해하기 위해 사용합니다. 이 솔루션은 흐린 될 것입니다 더 전체 organoids는 볼 수 없습니다. 5 분 동안 실온에서 원심 분리, 900 XG . 상층 액을 제거하고 세포 배양 등급 재조합 단백질 분해 효소 (예를 들어, TrypLE)의 500 μL에 펠렛을 재현 탁. 5 분 동안 37 ° C에서 품어. 배양 한 다음 프래그먼트 당 세포의 수를 세고, 광 현미경을 사용하여 organoid 단편의 크기를 확인한다. 5-10 세포를 포함하는 단편은 이상적이다. 단편의 대부분은 세포의 더 높은 번호를 포함하는 경우 배양 시간은 시간에 2 분으로 증가 될 수있다. ENR 배지 500 μl를 첨가하여 분해 처리를 종료한다. 실온에서 원심 분리기, 5 분 동안 900 XG. 상층 액을 제거하고 얼음 또는 4 ° C에서의 펠렛을 유지합니다. 6 레트로 바이러스 형질 도입 48 웰 플레이트 잘 하나에서 (4.5부터) 레트로 바이러스 솔루션의 250 μL와 organoid 조각을 결합합니다. 1 ㎖의 pipetman 팁을 사용하여 천천히 피펫으로 가볍게 섞는다. 파라 필름과 판을 밀봉합니다. 전자 "> 7. Spinoculation 및 도금 1 시간 동안, 32 ° C, 600 XG에서 접시를 원심 분리기. 조심스럽게 파라 필름을 제거하고 6 시간 동안 조직 문화 인큐베이터에서 접시를 품어. 감염 Organoid 조각의 8 시드 5 분 동안 900 XG에 1.5 ML 튜브, 스핀에 우물에서 감염된 organoid 조각 및 전달 매체를 전송합니다. 뜨는을 취소하고 멋진 5 분 동안 얼음에 펠렛을 포함하는 튜브를 넣어. 지하 매트릭스의 100 μl를 추가하고 위아래로 천천히 피펫 팅하여 펠렛을 재현 탁. 새로운 24 웰 플레이트에 50 ㎕의 '혼합 -cell 지하 매트릭스'의 종자 삭제합니다. 지하 매트릭스 응고 될 때까지 5 ~ 15 분 동안 37 ° C에서 접시를 품어. 우물에 폴리 브렌없이 전달 매체를 추가하고 조직 문화 인큐베이터에서 접시를 품어. 2-3 일마다 미디어를 변경합니다. 9 선택 시작 자체미디어에 퓨로 마이신 (1 μg / ml)에 추가하여 2~3일 후 성귀. 조각이 형성 organoids 퓨로 마이신 (1 μg / ml)로 보충 ENR 매체와 전달 매체를 대체하기 시작합니다. (10) 후 감염 SI Organoids의 치료 문화에 따라 "과 Passaging 및 organoids을 유지"프로토콜 (2.2.1) organoids 형질. 1~2주 후 SI의 organoids는 신진 구조를 되 찾을 것입니다. 1 μM의 농도로 작동 hydroxytamoxifen 4-(4-OHT)를 추가하여 miRNA의 또는 cDNA의 발현을 유도 신진 구조물의 모양에 따라. 이 단계가 Addgene (pMSCV -에 loxP-DsRed의 -에 loxP-eGFP는 – 순수하지 않아-WPRE (32702), pMSCV -에 loxP-DsRed의 -에 loxP-3xHA – 순수하지 않아-WPRE (32,703), 그리고 pMSCV에서 레트로 바이러스 벡터를 사용하는 경우에만 유효합니다 차 돌려 – 순수하지 않아-DsRed의-GFP-miRNA가 (32704)) 먹어 치운다-ERT2을 표현 organoids. 감염 및 EXPR의 11 확인관심의 유전자의 ession / 억제 Addgene (32702, 32703 및 32704)에서 레트로 바이러스 벡터를 사용하는 경우 전달 효율은 DsRed의 발현의 관찰에 의해 확인 될 수있다. 쿠 외 4에 예시 된 바와 같이 또한, 관심의 유전자의 발현 또는 억제는 GFP 또는 (유전자 녹다운을위한) 3xHA의 (유전자 과발현) 에피토프 및 qPCR에를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 확인 될 수있다.