初代腸オルガノイド培養におけるレトロウイルス感染のビデオプロトコル

以下のプロトコールで使用される全てのマウスは、特定病原体を含まない条件下で維持し、全ての手順は、英国内務省の規制に従って行った。 の調製使用に先立ってメディア1時間を準備し、少なくとも10分間、使用前に37℃の水浴中および前加温（ 表1および材料のリスト詳細は参照）。 2培養小腸（SI）オルガノイド注：特に明記しない限り、全てのインキュベーションは、加湿インキュベーター中、37℃、5％CO 2で行われる。生きている細胞と接触する機器および試薬は、無菌でなければならない。 それは地下マトリックス（マトリゲルまたはBME）は播種時に広がるから落下防ぐように組織培養プレートを事前に温めることが重要です。また、基底行列は常に氷上で維持されるべきである。 -20℃と融解で保存使用前に氷上で。 陰窩の分離小腸を単離するために、その後、国の規則および規制に従って、マウスを犠牲にし、その裏に動物を配置し、70％エタノールで腹部を洗う。胸骨に足の付け根から縦正中切開を行います。まず、皮膚、次に皮下組織を切断する。胃に盲腸から小腸を取り出します。十二指腸、空腸および回腸から単離された陰窩はオルガノイド培養のために使用することができる。 カルシウムやマグネシウム（PBS0）することなく、予め冷却したリン酸緩衝生理食塩水と分離され、小腸を洗ってください。 3〜5センチメートル長い断片に組織を切断し、縦に開いて、それをカットするはさみを使用しています。鉗子を使用して組織を広げる。 カバーガラスを使用した絨毛を削り取る。注意、あまりにも多くの力が組織を引き裂くことになりますし、手順に従ってに陰窩の収量が減少します。 予備冷却PBS0を使うを含む50mlチューブに組織を移すグラム鉗子。激しく振盪を通して組織片を洗浄しPBS0を変更してください。 2〜3倍を繰り返したりPBS0はあまり濁って変わるまで。 チューブローラー上で4℃で30分間、1mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）でPBS0を30 mlを含む50mlチューブ中で組織をインキュベートする。 激しくチューブを振るおよび5mM EDTAでPBS0 30mlのを含む別の50ミリリットルチューブに組織を移す。 （以前に組織を含む）を1 mMのEDTA溶液は、陰窩および絨毛の混合物が含まれます。それはしばしば絨毛の高い割合が含まれているので、この画分は、オルガノイドの播種に適していない。 チューブローラー上で4℃で1時間、さらに組織をインキュベートする。 激しくチューブを振るときれいな50mlチューブ内の溶液を収集します。光学顕微鏡で50μl中陰窩をカウントすることで、 たとえば 、陰窩の存在を確認し、数を推定。 50-100陰窩を得るために必要な体積を計算し、1.5ml tにそれを転送するUBE。 5分間300×gでスピン。 、上清を捨て、予め温めておいた24ウェルプレート中の基底行列50μlのペレット、および種子を懸濁します。地下マトリックスが重合ので5〜15分間、組織培養インキュベーター中でプレートをインキュベートする。 500μlのENR培地でオーバーレイ（ 表1参照）。オルガノイドを播種した後の約24時間後には、小さな丸い嚢胞の形を示し、構造が見えるようになる新進さらに2〜3日後になります。 3日ごとに新鮮なENRメディアに変更します。 通過は7日ごとに文化をオルガノイド。 継代およびメンテナンスオルガノイド約7日ごとに、死んだ細胞で満たされたルーメンになるように5：3または1：3日おきにメディアをリフレッシュし、通路1によるオルガノイドを維持します。 1ミリリットルピペットマンチップを用いて媒体と地下行列ドームを破壊し、1.5mlチューブによくからそれを転送します。 機械的にピペッティングAを介してオルガノイドを解離pproximately 50倍細かい（ 例えば 、200μlの）チップを用いて。 5分間300×gでスピン。 上澄みを捨て、地下マトリックスの150〜250μlのペレットを再懸濁します。予め温め、24ウェルプレートにおける種子（地下行列/ウェルを50μl）。コー​​ティングするために一度地下行列を上下先端部の壁にピペットを播種する前に。ピペットでゆっくりと広がる基底行列を防ぐためにウェルの中央に気泡やシードを回避する。これは、ウェルの中央に基底行列のドームを得ることが望まれる。 基底行列が重合よう5-15分間組織培養インキュベーター中でインキュベートする。ウェルあたり500μlのENRメディアとのオーバーレイ。 3プリ感染SIオルガノイドの治療注： 図1は、形質導入手順を示す。 ENRWntNicへの交換ENR培地（ 表1参照）とtでオルガノイドを育てる3日以上または、彼らは嚢胞の形態を採用しているまで、彼のメディア。ニコチンアミド（NIC）が培養効率を向上させながら、Wnt3aは、幹やパネート細胞の数が増加します。 4。ウイルス産生プラチナ-E細胞の一つの150mmの皿は、感染ごとに必要とされる。シード約5×10 6ピューロマイシンの存在下で15〜18ミリリットルの培地（DMEM + 10％FBS）を有する細胞（1μg/ ml）およびブラストサイジン（10μg/ ml）を。これらは70〜80％のコンフルエンシーに達したときに、2〜3日後に細胞をトランスフェ。ピューロなしで+ 10％FBSのDMEMに培地を変更し、トランスフェクション前にブラストサイ。 OPTI-MEMの1ミリリットルを含むチューブを分離するポリエチレンイミン（PEI）のレトロウイルスDNA構築30μgの240を添加する。混合し、5分間室温でインキュベートする。 二つの溶液をプールし、20〜30分間室温でインキュベートする。プラチナ-E細胞の培地への完全な混合物を追加し、慎重にPLATを振るeは、DNA-PEI複合体の均等な分布を確保する。 一晩のトランスフェクション混合物とプラチナ-E細胞をインキュベートし、翌日培地をリフレッシュ。 2日間新しい培地中の細胞を保管してください。 、50mlのFalconチューブ内の培地のみを収集して12〜16時間、4℃で8,000×gで0.45μmのフィルターと遠心分離機を介して渡します。上澄みを捨て、形質導入培地250μlの中にペレットを再懸濁し（ 表1参照）。 5。オルガノイドフラグメント準備 1感染のため、24ウェルプレートからの1つのウェルが必要とされている。 1ミリリットルピペットマンチップを用いて媒体と地下行列ドームを破壊し、1.5mlチューブに移す。 機械的にピペッティング（30-50x）を介してオルガノイドを破壊するために細かいボリュームチップ（ 例えば 、200μlのチップ）を使用します。解決策は、曇っになり、全く全体オルガノイドは表示されません。 室温で5分間、900×gでの遠心分離 。 上清を捨て、細胞培養グレードの組換えプロテアーゼ（ 例えば 、のTrypLE）500μlにペレットを再懸濁します。 5分間37℃でインキュベートする。インキュベーションに続いてフラグメント当たりの細胞数をカウントし、光学顕微鏡を用いてオルガノイド断片のサイズを確認。 5-10細胞を含有するフラグメントが理想的です。断片の大部分は細胞のより高い数を含む場合、インキュベーション時間は、一度に2分することにより増加させることができる。 ENR培地500μlを添加することにより、解離プロセスを終了します。 室温で遠心し、5分間900×gで。上清を除去し、氷や4℃でペレットを保持します。 6。レトロウイルス形質導入 48ウェルプレートの1ウェル中（セクション4.5からの）レトロウイルス溶液を250μlのオルガノイドの断片を結合します。 1ミリリットルピペットマンチップを用いてゆっくりとピペッティングにより穏やかに混合します。 パラフィルムでプレートを密封。 E "> 7。ピノキュレーションとメッキ 1時間、32℃、600×gでプレートを遠心。慎重にパラフィルムを除去し、6時間、組織培養インキュベーター中でプレートをインキュベートする。 感染オルガノイドフラグメントの8播種 1.5mlチューブによくから感染オルガノイド断片及び伝達メディアを転送し、5分間900×gでスピン。 上澄みを捨て、冷却するために氷上で5分間ペレットを含むチューブを置く。地下マトリックスを100μlを加え、上下にゆっくりピペッティングすることによりペレットを再懸濁します。 新しい24ウェルプレートに50μlの「ミックス-cell地下マトリックス」の種子落下。地下の行列が固化するまで5〜15分間、37℃でプレートをインキュベートする。 ウェルにポリブレンなしに伝達メディアを追加し、組織培養インキュベーター中でプレートをインキュベートする。 2〜3日おきにメディアを変更します。 9。選択スタートSEメディアへのピューロ（を1μg/ ml）を添加することにより、2〜3日後にlection。 フラグメントが形成オルガノイドピューロ（1μg/ ml）を補充したENRメディアに伝達メディアを交換し始めています。 10感染後のSIオルガノイドの治療文化 "は継代およびオルガノイドの維持"プロトコル（セクション2.2.1）に従ってオルガノイド形質導入。 1〜2週間後のSIオルガノイドは、出芽の構造を取り戻すでしょう。 出芽構造の出現に続いて1μMの作用濃度で4 – ヒドロキシタモキシフェン（4-OHT）を加えることによってmiRNA又はcDNAの発現を誘導する。このステップはAddgene（のpMSCV-のloxP-DsRedを – のloxP-EGFP-ピューロ-WPRE（32702）のpMSCV-のloxP-DsRedを – のloxP-3xHA-ピューロ-WPRE（32703）、およびのpMSCVからのレトロウイルスベクターを用いた場合にのみ有効であることに注意してください-FLIP-ピューロ-DsRedを-GFP-miRNAは（32704））とのCre-ERT2を表現オルガノイド。 感染およびexprの11の確認目的の遺伝子のession /抑制 Addgene（32702、32703および32704）からのレトロウイルスベクターを使用している場合は形質導入効率は、DsRedの発現を観察することにより確認することができる。クーら 4に例示するようにさらに、目的の遺伝子の発現または抑制は、GFPまたは（遺伝子過剰発現用）3xHAエピトープおよび定量PCR（遺伝子ノックダウンのための）を使用して、ウエスタンブロットによって確認することができる。