Imágenes en vivo de<em> Drosophila</em> larvales neuroblastos

Las células madre mantienen un equilibrio de la diferenciación y autorrenovación para generar diversidad celular durante el desarrollo temprano y reemplazar las células dañadas en los tejidos adultos. Reglamento de esta homeostasis impide que tanto la pérdida como la expansión excesiva de la población de células madre, lo cual puede resultar en la degeneración del tejido perjudicial o tumorigénesis.

Los neuroblastos (NBS) son las células madre neurales ampliamente estudiadas del sistema nervioso central de Drosophila (Figura 1A) que primero forma durante las etapas embrionarias ^{1, 2.} RN sometidos a rondas repetidas de división celular asimétrica (ACD) para producir dos células desigual predestinados: una célula madre de autorrenovación y diferenciación celulares. ACD es guiado por centrosomas, los orgánulos no membranosos que actúan como los centros de organización de microtúbulos de la mayoría de las células ^3. Durante la mitosis, los centrosomas NB organizan y orientan el huso mitótico bipolar a lo largo del polo apical-basaleje dad. Tras la escisión de la división de NB, determinantes destino apicales que especifican el destino de células madre, y los determinantes del destino basales que especifican la diferenciación, son segregados en las células hijas desiguales.

En el cerebro central de las larvas, dos tipos de RN se pueden distinguir por su número, la posición, la expresión del factor de transcripción, y el linaje celular (Figura 1 A) ^4-6. Tipo I NBS son los más abundantes, y sobre 90 de los pueblan los lados anterior y posterior de cada lóbulo óptico del cerebro ^7. Estos NBS expresan el factor de transcripción Asense (ASE), y que característicamente se dividen en una auto-renovación NB y uno ganglio de células madre más pequeña (GMC; Figura 1B). Cada GMC se somete a una sola división de terminal para generar dos neuronas o la glía (Figura 1B). Por el contrario, los RN ocho de tipo II que pueblan la parte posterior de cada lóbulo óptico carecen Ase expresión ^5. Se someten a ACDpara producir un auto-renovación NB y uno progenitoras neurales intermedio (INP).

El INP, a su vez, divide asimétricamente tres a cinco veces. Cada una de estas divisiones resultados en la regeneración de la INP y la producción de un solo GMC ^4. En conjunto, la identidad específica NB y el orden temporal de GMC nacimiento da lugar a la diversidad neuronal asombrosa del sistema nervioso central adulto.

La comprensión de la biología celular que subyace NB ACD se ha mejorado enormemente mediante el uso de técnicas de imágenes de células vivas. Publicado protocolos utilizados por los investigadores a imagen RN vivos varían ampliamente. En general, sin embargo, estos métodos se pueden agrupar en dos categorías generales que se distinguen por si el cerebro de larvas se deja intacta o mecánicamente disociado. Ambas técnicas tienen ventajas y desventajas, dependiendo de la solicitud del investigador.

Los primeros informes que revelan vivo división celular NBnes implican algún grado de disociación manual de la cerebro de larvas. Estos protocolos de detalle se corra ⁸ o burlas aparte ⁹ del cerebro para crecer cultivos primarios a corto plazo de la RN sobre cubreobjetos de vidrio. Para mejorar la imagen, las NBS redondas son generalmente aplanados en los cubreobjetos, ya sea con placas de vidrio ⁸ o almohadillas de agarosa ^9. Aunque las células aplanadas han mejorado la óptica, estas técnicas conducen a menudo a defectos mitóticos NB, incluyendo la regresión del surco de segmentación y la incapacidad para dividir más de una vez. Por lo tanto, los protocolos que implican tanto la disociación manual y distorsión física del tejido cerebral de larvas generalmente sólo se adaptan a muy corto plazo (es decir., Ciclo de una célula o menos) aplicaciones. Del mismo modo, semi-aplastamiento o aplanar completamente cerebros intactos entre las diapositivas de cristal y cubreobjetos limita el tiempo que uno puede pasar la imagen de una modelo que figura como a un período de aproximadamente 30 min ^10. A pesar de esta limitación, this enfoque ha sido utilizado con éxito ^11-14.

Los recientes esfuerzos para vivir imagen disocian límite RN distorsión física de las células aisladas. Estas técnicas son particularmente útiles para aplicaciones en las que es necesario para mantener cultivos de células para múltiples ciclos de división celular. Por ejemplo, las células dispersas de cerebros disociados manualmente pueden estar parcialmente incrustadas en un coágulo a partir de la mezcla de fibrinógeno y trombina ¹⁵ para formación de imágenes a largo plazo ^16. Alternativamente, los cerebros explantados pueden ser primero químicamente disociado con la enzima colagenasa, junto interrumpido manualmente por el paso repetido a través de una punta de pipeta, y posteriormente se sembraron en platos de fondo poli-L-lisina-revestido de vidrio ^{17, 18.} Revestimiento de platos de vidrio, ya sea con el fibrinógeno o poli-L-lisina promueve el apego y ligera propagación de células redondas, llevándolos tan cerca del cubreobjetos posible sin distorsión importante físico. En additien adelante, estos métodos implican el cultivo de la NBS en medio que puede intercambiarse fácilmente para los experimentos de perturbación farmacológicas ^18. En general, enchapado directamente dispersados ​​RN mejora óptica de imagen sin sacrificar la capacidad de imagen a largo plazo. Recientemente, un protocolo que describe el cultivo a largo plazo de NB disociada se ha detallado ^19.

Sin embargo, este enfoque no es sin sus limitaciones. Hay varias advertencias a las imágenes RN disociadas en vivo. En un campo de células dispersas, por ejemplo, es difícil identificar linajes NB específicos que se organizan espacialmente en el cerebro intacto ^1. Del mismo modo, distinguir el tipo I frente II NB dentro del tejido disociado tipo también es difícil sin la expresión de marcadores de linaje o transgenes específicos de subtipo, tales como Worniu-GAL4, GAL80-aSENSE ^20. Aunque estos transgenes son muy útiles para algunas aplicaciones, no se limitan a los investigadores a los transgenes expresionado bajo el control del elemento promotor de UAS ²¹ y requieren esquemas genéticos más complejos. Los estudios que se refieren al desarrollo espacial o temporal de los RN, por lo tanto, requieren de imágenes in vivo, en el contexto de un tejido intacto.

Por otra parte, los estudios de NBS embrionarias disociadas indican que el contacto físico de las células adyacentes es crítica para la localización de la interfase polaridad clave determinantes ^{22, 23.} Estos estudios muestran completamente aislado RN ya no mantener el eje del huso mitótico invariante. En su lugar, estas células presentan un eje de husillo más aleatorios y amplios ángulos de separación entre los sucesivos brotes de GMC, tal vez debido a la pérdida de posicionamiento del centrosoma apical ^22. Aunque la relación entre el BNE larvales y sus células vecinas no ha sido ampliamente estudiado, vale la pena considerar que el microambiente de células madre de larvas puede incidir en la polaridad celular u otrocomportamientos. Para mantener el contexto fisiológico de larvas NBS, que la imagen de ACD a partir de cerebros enteros.

Dadas las limitaciones inherentes asociados con la formación de imágenes disociadas RN, nuestro laboratorio y otros han establecido protocolos para imágenes sucesivas rondas de NB ACD de cerebros larvales enteros. Técnicas a la imagen cerebros intactos a menudo sustituyen la superficie rígida de vidrio en un lado de la cámara de cultivo con una membrana flexible para evitar la distorsión o daño de tejido y permitir el intercambio de gases. Algunos métodos implican montaje cerebros explantados en una mezcla de medio de insecto de cultivo, suero, y ácido ascórbico con los cuerpos grasos aislados de diez larvas ^24. Los cuerpos grasos aislados se añaden porque secretan un mitógeno sabe que estimula la división celular NB ^25. Este protocolo preserva la integridad de los tejidos durante más de 3 horas y es, por lo tanto, susceptibles de formación de imágenes a largo plazo ^{24, 26-28.} Recientemente, un protocolo que describe la lonimágenes g plazo de cerebros larvas intactas en presencia de ácido ascórbico, suero y los órganos de grasa se ​​ha detallado ^29. Es importante destacar que, debido a que el tejido está expuesto ni tampoco inmovilizado, este enfoque es menos útil para aplicaciones en las que se intercambia medio de cultivo (por ejemplo, estudios de la droga, la inmunodepleción, etc.).

Nuestro laboratorio ha simplificado todo el monte de la preparación de los cerebros de larvas vivas para la imagen a largo plazo ^{30, 31.} La principal ventaja de nuestro protocolo sobre los demás es su simplicidad: nuestras observaciones indican ni el suero, el ácido ascórbico, la insulina, ni cuerpos gordos son aditivos necesarios a imagen de rondas sucesivas de NB ACD. Aunque aditivos, tales como la insulina, han sido útiles para la formación de imágenes prolongada de divisiones celulares vástago ³² y la migración celular colectiva en los ovarios de Drosophila ^33, que parecen ser prescindible para NB de ACD, como nuestro medio de formación de imágenes se compone de una mezcla simple de Standard medio de cultivo de células de insecto suplementado con antibiótico-antimicótico para evitar la contaminación. Mediante el uso de placas de cultivo de fondo permeable al gas o de vidrio reutilizables, hemos sido capaces de sostener varias rondas sucesivas de ACD NB. Las mismas muestras explantados fácilmente se pueden utilizar para inmunofluorescencia y otros procedimientos con tejido fijado. En este protocolo, detallamos la disección del cerebro de larvas intactas, así como la preparación de los cerebros para el análisis tanto en directo como fijo.