Cell Analyzer a base di impedenza in tempo reale come strumento per delineare molecolari meccanismi coinvolti nella neurotossicità e neuroprotezione in una linea cellulare neuronale
Summary
Improved in vitro neurotoxicity assays would aid the identification of new neuroprotective compounds. The utility of a real-time impedance-based cell analyzer to determine cytotoxicity and cytoprotection in neuronal cell lines and to delineate the involvement of second messenger pathways, thus gaining insight in the mechanism of neuroprotection is presented.
Abstract
Molti disturbi cerebrali connesse sono morte delle cellule neuronali coinvolti nella loro fisiopatologia. Migliorata di modelli in vitro per studiare gli effetti neuroprotettivi o neurotossici di farmaci e vie a valle coinvolti aiuterebbe ottenere informazioni sui meccanismi molecolari di neuroprotezione / neurotossicità e potrebbe potenzialmente facilitare lo sviluppo di farmaci. Tuttavia, molti saggi di tossicità esistenti in vitro hanno importanti limitazioni – più valutare neurotossicità e neuroprotezione in un unico punto di tempo, non permettendo di osservare il tempo-corso e cinetica dell'effetto. Inoltre, la possibilità di raccogliere informazioni sulle vie di segnalazione a valle coinvolti nella neuroprotezione in tempo reale sarebbe di grande importanza. Nel protocollo corrente viene descritto l'uso di un analizzatore di cellule di impedenza-based in tempo reale per determinare gli effetti neuroprotettivi di serotonina 2A (5-HT 2A) agonisti dei recettori in una linea cellulare neuronale sotto senza etichetta e in tempo reale Conditioni che utilizzano misure di impedenza. Inoltre, abbiamo dimostrato che gli inibitori di secondi messaggeri percorsi possono essere usate per delineare molecole a valle che l'effetto neuroprotettivo. Noi descriviamo anche l'utilità di questa tecnica per determinare se un effetto sulla proliferazione cellulare contribuisce ad un effetto neuroprotettivo osservato. Il sistema utilizza piastre microelettronici speciali denominati E-tavole che contengono alternati matrici di microelettrodi d'oro sulla superficie inferiore dei pozzetti, che servono come sensori cellulari. La lettura impedenza viene modificato dal numero delle cellule aderenti, la vitalità cellulare, morfologia e adesione. Un parametro adimensionale chiamato cella indice è derivato dalle misure di impedenza elettrica e viene utilizzato per rappresentare lo stato delle cellule. Nel complesso, l'analizzatore di cellule di impedenza-based in tempo reale permette in tempo reale, la valutazione libero-label di neuroprotezione e neurotossicità, e la valutazione dei percorsi di coinvolgimento secondo messaggero, contribuendo a piùvalutazione dettagliata e high-throughput di potenziali composti neuroprotettivi in vitro, per la selezione dei candidati terapeutici.
Introduction
Morte cellulare neuronale svolge un ruolo critico nella fisiopatologia di molti disturbi cerebrali correlati 1. La disponibilità di throughput elevato e affidabile nelle prove di tossicità in vitro è fondamentale per ottenere una migliore comprensione dei meccanismi di neurotossicità e per contribuire a selezionare le molecole neuroprotettive come candidati terapeutici in sviluppo dei farmaci 2. Tuttavia, ci sono molte limitazioni per più utilizzato in vitro neurotossicità assays.They valutare neurotossicità / neuroprotezione in una sola volta punto di non consentire la risoluzione cinetica; spesso utilizzare l'etichetta o la sonda che può interferire con le vie di segnalazione e limitare ulteriori studi nella stessa popolazione di cellule, e sono spesso ad alta intensità di manodopera, e in molti casi non forniscono informazioni meccanicistica. Nel presente studio abbiamo dimostrato l'utilità di un analizzatore di cellule di impedenza-based in tempo reale per determinare neurotossicità e neuroprotezione in una linea cellulare neuronale in tempo reale e sotto libero-labelcondizioni e forniscono informazioni sui meccanismi a valle attraverso l'analisi delle seconde vie messaggeri coinvolti nell'effetto.
Precedenti studi hanno confermato la validità dell'analizzatore cella in tempo reale per determinare la citotossicità nonché effetti sulla proliferazione cellulare in linee cellulari in confronto con tecniche standard 3,4,5,6. Ad esempio, una buona correlazione è stata osservata tra le letture della norma vitalità cellulare WST-1 test e cellulari valori dell'Indice in diversi punti del tempo in condizioni di proliferazione basali e dopo due diversi paradigmi tossici nelle cellule HeLa 3. In A549 e MDA-MB-231 cellule proliferazione e citotossicità provocato con il paclitaxel stabilizzatore microtubuli hanno mostrato valori molto simili quando valutati da misurazioni dell'indice cellulare e il modo standard utilizzato solforodamina B (SRB) test 4. Nella linea cellulare neuronale dei neuroni dell'ippocampo immortalati HT-22 cellule Indice misurazioni sono stati convalidati per la loro capacità to rilevare la proliferazione cellulare, glutammato citotossicità e citoprotezione contro il diffuso 3 (4,5-dimethylthiazol-2-yl) 2,5-diphenyltetrazolium-bromuro (MTT) 5. Nello stesso studio i risultati del test MTT e misurazioni Indice cellulare anche correlati bene in misura neuronale cellule progenitrici proliferazione, citotossicità dopo fattori di crescita deprivazione e salvataggio di citotossicità dal pan-caspasi inibitore QVD 5. Citotossicità indotta in cellule NIH 3T3 da Vandetanib (vascular endothelial growth factor recettore e inibitore del recettore del fattore di crescita epidermico) ha mostrato risultati simili misurati con i valori dell'Indice cellulare o neutro saggio di uptake rosso 6.
Abbiamo recentemente usato il sistema analizzatore di cellule in tempo reale per valutare gli effetti neuroprotettivi della 2A della serotonina (5-HT 2A) agonista del recettore cloridrato (±) -2,5-dimetossi-4-iodoamphetamine (DOI) in una linea cellulare neuronale ( cellule SK-N-SH) e screening per il coinvolgimento di second percorsi Messenger tramite il monitoraggio dell'effetto della loro inibizione chimica sulla neuroprotezione osservata 7. È interessante notare che il recettore 5-HT 2A ha agonisti sia allucinogeni e nonhallucinogenic (come il DOI e lisuride, rispettivamente), che possono attivare sia secondo percorsi comuni e distinte Messenger 8.
I vantaggi della tecnica sono presentati che permette di raccogliere informazioni in tempo reale sulla sopravvivenza cellulare nel corso dei giorni, per delineare percorsi di secondo messaggero coinvolti, per valutare il possibile contributo degli effetti proliferazione a neuroprotezione, e per selezionare un tempo ottimale per ulteriori studi end-point sulla stessa popolazione cellulare. Un diagramma schematico del flusso di lavoro nel protocollo attuale è presentato in figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo attuale presenta l'utilità di un analizzatore di cellule in tempo reale per valutare in modo continuo e in condizioni di libera-label / gli effetti neurotossici neuroprotettivi dei composti in linee cellulari neuronali e al fine di conoscere le seconde vie messaggeri coinvolti nell'effetto.
Anche se l'utilità analizzatore di cellule in tempo reale di studiare la citotossicità e gli effetti dei farmaci sulla proliferazione cellulare è generalmente riconosciuto, s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financial support for the experiments presented in the study was provided by the Marie Heim-Vögtlin program of the Swiss National Science Foundation.
We thank Ms. Johanna Nyffeler for developing a set of modified MATLAB programs for screening for statistically significant differences in real-time cell analyzer’s data and Dr. Yama Abassi for helpful discussion.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| xCELLigence RTCA SP system bundle | ACEA Biosciences | No: 00380601030 | consists of RTCA Analyzer, RTCA SP Station and RTCA Control Unit |
| E-plate 96 | ACEA Biosciences | No: 05232368001 | for culturing the cells, inserted in the RTCA SP Station |
| SK-N-SH cells | ATCC – (in partnership with LGC Standards) | HTB-11 | can be replaced by another adherent neuronal cell line of interest |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D8437 | cell culture medium |
| fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-063 | supplements proliferation, but not serum deprivation medium |
| tisue culture flask T175 | Sarstedt | 83.1812.302 | for culturing cells, which will be later plated on the E-Plate 96 |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | for trypsinization of cells cultured in tissue culture flasks |
| Scepter 2.0 cell counter | Merck Millipore | PHCC20060 | automated cell counter |
| phosphate-buffered saline | Life Technologies | 10010-015 | for washing the cells |
| (±)-DOI hydrochloride | Sigma-Aldrich | D101 | 5-HT2A agonist for cell culture treatment |
| LY-294,002 hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9908 | PI3-K inhibitor for cell culture treatment |
| lisuride maleate | Tocris Bioscience | 4052 | compound with 5-HT2A agonistic activity for cell culture treatment |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | for dissolving LY-294,002 and lisuride maleate |
Riferimenti
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