Marker cellulare superficiale Purificazione mediata di cellule iPS intermedi da un modello riprogrammabile mouse

1 Impostazioni Strumento / Preparazione dei reagenti / Genotipizzazione Preparare media delle cellule iPS: Supplemento 500 mezzi ml Knockout DMEM con 75 ml di siero fetale bovino (FBS), 5 ml di L-glutammina, 5 ml di aminoacidi non essenziali, 500 microlitri β-mercaptoetanolo, 5 x 10 5 unità leucemia fattore inibitorio ( LIF). Si prega di fare riferimento alla Lista dei materiali per il prodotto e acquisti per i reagenti utilizzati nel contesto di questo manoscritto. Preparare medio MEF: Supplemento 500 ml supporti DMEM con 50 ml di FBS, 5 ml di L-glutammina, 5 ml aminoacidi non essenziali, 5 ml di sodio piruvato, 500 microlitri β-mercaptoetanolo. Preparare congelamento media: Per 10 ml, combinare 9 ml di FBS con 1 ml di DMSO. Preparare la gelatina rivestito piatti Aggiungere 3-5 ml di 0,1% soluzione di gelatina suina ad un pallone T75, incubare a temperatura ambiente per almeno 10 minuti e aspirare a destra prima dell'uso. Preparare FACS media etichettatura: Per 10 ml, combinare 9,9 ml di PBS con 0,1 ml di FBS. Eseguireuna genotipizzazione PCR per il locus Rosa26 m2rtTA: Eseguire reazioni con DNA polimerasi Taq secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare una versione modificata MgCl 2 -concentration di 3,5 mm e 3 seguenti primer: oIMR8052: 5 'GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC 3', oIMR8545: 5'AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT 3 ', oIMR8546: 5' GGA GCG GGA GAA ATG ATG GAT 3 '. Condizioni Ciclismo: 94 ° C per 3 min; 35 cicli di (94 ° C per 30 sec, 65 ° C per 1 min, 72 ° C per 1 min); 72 ° C per 2 min; tenere a 12 ° C. Formato del prodotto previsto: 650 bp per l'allele wild type e 340 bp per l'allele mutante. Eseguire una genotipizzazione PCR per il locus collagene-StemCa / OKSM: Eseguire reazioni con DNA polimerasi Taq come da istruzioni. Utilizzare una versione modificata MgCl 2 -concentration di 2,5 mm e 3 seguenti primer: col / frt-B: 5 'CCCTCCATGTGTGACCAAGG 3', col / frtA1: 5 'GCACAGCATTGCGGACATGC 3', col / frtC1: 5 'GCAGAAGCGCGGCCGTCTGG 3 '. Condizioni Ciclismo: 95 ° C per 1 min: 2 cicli di (94 ° C per 30 sec, 70 ° C per 45 secondi), 6 cicli di (94 ° C per 30 sec, 68 ° C per 45 secondi) e 30 cicli di (94 ° C per 20 sec, 60 ° C per 1 min); 72 ° C per 5 min; tenere a 12 ° C. Formato del prodotto previsto: 331 bp per l'allele wild type e 551 bp per l'allele mutante. Eseguire tutte le fasi di centrifugazione a 400 xg per 3 min a 4 ° C. 2 Generazione di fibroblasti embrionali di topo Eseguire un accoppiamento a tempo tra un animale del ceppo OKSM con un membro del sesso opposto del ceppo m2rtTA. Embrioni Harvest a giorno embrionale 13.5 di abbattimento la madre e la rimozione del corno uterino. Prima della rimozione del corno uterino, spruzzare la regione addominale con una soluzione di etanolo al 80%, per evitare la contaminazione microbica. Trasferire il corno uterino in un piatto di coltura di tessuti 10 centimetri contenente 10 ml di sterile tampone fosfato (PBS). Usare le forbici sterilizzate grado chirurgico per tagliare il corno uterino in pezzi contenenti un embrione (vedere Figura 3A, B). Utilizzare un microscopio dissezione (idealmente collocato all'interno di una cappa di coltura tissutale) e pinze sterilizzate per rimuovere con attenzione la busta uterino e le membrane extra-embrionali circostanti ogni embrione. Trasferire ogni embrione di un piatto separato 10 centimetri con 10 ml di PBS. Procedere rimuovendo la testa dell'embrione, gli arti, la coda e gli organi interni (cuore, fegato, intestino, ecc) con la pinza (vedi Figura 3C). Trasferire testa dell'embrione in una provetta da 1,5 ml e congelare giù in modo che possa essere utilizzato per la genotipizzazione se necessario. Trasferire il torso dell'embrione in un 10 centimetri piatto vuoto e usare due lame chirurgiche per tritare l'embrione per 2 min. Aggiungere 200 ml di soluzione di tripsina / EDTA in cima dell'embrione tritato e incubare per 3-5 minuti a temperatura ambiente. Continuare macinazione per un ulteriore 2 minuti, aggiungere 2 ml di media MEF al attivare la tripsina, e poi trasferire in una provetta da 15 ml. Utilizzare una pipetta 1.000 microlitri di dissociare ulteriormente meccanicamente il tessuto delicatamente pipettaggio. Trasferire in un piatto di 10 centimetri di gelatina rivestito e aggiungere un ulteriore 10 ml di supporti MEF. Nota: Sia incubatori normossiche e ipossia possono essere utilizzati per la cultura, fare riferimento alla discussione per maggiori informazioni. Dopo 24-48 ore la piastra deve essere densamente coperto con MEF. In alternativa, le cellule possono poi essere ulteriormente propagate o congelati verso il basso. Per il congelamento delle cellule, rimuovere il supporto di cultura, sciacquare il piatto con 10 ml di PBS per rimuovere le tracce di media e sovrapposizione con 3 ml di soluzione / EDTA tripsina. Incubare per 3-5 minuti a 37 ° C, inattivare la tripsina digestione con l'aggiunta di 5 ml di media MEF e il trasferimento ad un tubo di centrifugazione 15 ml. Spin down e risospendere il pellet in 3 ml di congelamento dei media. Trasferimento a 3 cryovials e congelare giù in un contenitore di congelamento delle cellule. 3 Riprogrammazione del MEF ove_content "> NOTA: le cellule pellet per centrifugazione a 200 xg per 5 minuti a 4 ° C e utilizzare normossiche incubatori di coltura di tessuti per la riprogrammazione Può essere utile per derivare ed espandere MEF in condizioni di ipossia (5% di ossigeno, vedi la discussione per ulteriori informazioni. ). Scongelare rapidamente un esageratamente basso passaggio (P0-P1, 2-3 cellule Mio) in un bagno d'acqua (37 ° C) e trasferire il contenuto in una provetta con 10 ml di supporti MEF pre-riscaldato. Cellule pellet, risospendere in 12 ml di mezzi freschi MEF, trasferire in una gelatina rivestita cultura T75 nave, e permettono alle cellule di recuperare per 24-48 ore prima di procedere. Nota: MEF possono essere utilizzati anche direttamente dopo derivazione. Dopo la rimozione della coltura, lavare MEF con PBS e cellularize sovrapponendo con una soluzione di tripsina / EDTA (3 ml per 3-5 minuti a 37 ° C). Quench tripsina con l'aggiunta di 5 ml di media MEF e l'ulteriore dissociare le cellule delicatamente miscelazione con una pipetta 10 ml. Determinare il numero di cellule utilizzando un emocitometro. Per reprograesperimenti llo, MEF seme su gelatina rivestite fiasche T75 a densità di 6.7 x 10 3 cellule / cm 2 (~ 0,5 milioni di cellule per pallone) in mezzi IPSC contenente 2 mg / ml di doxiciclina. Fare riferimento alla Tabella 1 per quanto riguarda le raccomandazioni di semina per ottenere circa 2 Mio intermedi di riprogrammazione per ogni punto di tempo. Nota: Riprogrammazione inizia con l'aggiunta di doxiciclina (2 mg / ml) integrato multimediale Per i primi 6 giorni sostituiscono i media ogni giorno con doxiciclina fresca completato iPSC supporti (12 ml di supporto per bombola T75). Al di là di questo punto rinnovare la media su base giornaliera, se ci sono un numero elevato di cellule. Raddoppia il volume cultura se cambia media possono essere eseguite solo a giorni alterni. Intermedi Harvest riprogrammando in punti temporali richiesti (suggerimento: giorni 3, 6, 9, 12) rimuovendo i media, risciacquo con il volume appropriato di PBS (10 ml per un pallone T75) e la sovrapposizione con una soluzione di tripsina-EDTA (3 ml per un pallone T75). Covareper 3-5 minuti a 37 ° C e dissetare con l'aggiunta di 5 ml di iPSC supporti seguiti da dolce pipettaggio. Conte sospensione cellulare con un emocitometro (vedi sopra), pellet per centrifugazione, aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 10 ml di PBS per rimuovere eventuali tracce di tripsina. Agglomerare cellule ancora una volta, aspirare il surnatante e procedere con passo 4.1 per isolare gli intermedi di riprogrammazione. Nota: Le cellule in fase di riprogrammazione possono essere crioconservati e scongelati per l'isolamento FACS in una fase successiva. Per stabilire iPS culture completamente riprogrammati, crescere le cellule in libera-DOX iPSC supporti per altri 4-7 giorni. Nota: le culture riprogrammazione con successo conterrà un gran numero di colonie di giorno 12 (vedi Figura 4). Durante questo tempo, le cellule iPS aberranti che ancora richiedono espressione OKSM spariranno. In alternativa, per propagare le restanti iPS culture completamente riprogrammati: inizialmente, sementi MEF irradiati ad una densità di 15 x 10 3 cellule / cm 2 </sfino> in 12 ml di iPSC supporti su una gelatina rivestita T75 pallone di un giorno o 6 ore prima di esperimenti. Avanti, colture cellulari cellularize iPS rimuovendo i media, sciacquare il pallone T75 con 10 ml di PBS, sovrapposizione con 3 ml di soluzione di tripsina-EDTA e incubare per 3-5 minuti a 37 ° C. Quench tripsina con l'aggiunta di 5 ml di supporti IPSC seguita da miscelazione delicata, trasferire in un tubo da 15 ml, spin down e poi risospeso in 10 ml iPS media. Trasferire 500 ml di questa sospensione cellulare sulle MEF irradiati (pallone T75) e consentire alle culture di crescere per 4-5 giorni. Nota: iPS Fondata culture possono essere crioconservati o utilizzati per gli esperimenti. Linee cellulari clonali possono essere derivati ​​con la scelta di singole colonie IPSC sotto un microscopio da dissezione 22. Cryo preservare culture IPSC confluenti come descritto in 2.8 per MEF. 4 Antibody Etichettatura Pellet cellulari Risospendere di culture di riprogrammazione, come predisposto nella sezione 3, inFACS supporti etichettatura integrato con anticorpi (anti-Thy-1.2 Pacific Blue 1: 400, anti-SSEA-1 biotina 1: 400 e anti-EpCAM FITC 1: 400). Utilizzare 200 ml di miscela di etichettatura integrato per 5 milioni di cellule e incubare in ghiaccio. Dopo 10 min picchiettare delicatamente il tubo per risospendere le cellule e incubare per altri 10 minuti in ghiaccio. Aggiungere 10 ml di PBS freddo per tubi e spin down. Per ogni tubo deve essere macchiato preparare 200 ml di etichettatura supporto integrato con 1 ml streptavidina-PeCy7 (1: 200) per 5 milioni di cellule. Quando le cellule sono confettate, aspirare accuratamente il surnatante e risospendere in un volume adeguato di supporti di etichettatura integrati con streptavidina-PeCy7. Mantenere le cellule in ghiaccio per 10 minuti, toccare per risospendere, incubare per altri 10 minuti in ghiaccio, aggiungere 10 ml di PBS freddo per provetta, spin down e aspirare il surnatante. Pellet cellulari Risospendere in etichettatura dei media integrato con ioduro di propidio (PI) (2 mg / ml) a circa 1 x 10 7 cellule / ml. Rimuovere grumi di cellule facendo passare la sospensione attraverso un filtro 70 micron. Trasferire le cellule di un adeguato tubo FACS e tenerli su ghiaccio. Preparare i campioni separati con i singoli anticorpi (anti-Thy-1.2, anti-SSEA-1 e anti-EpCAM). NOTA: Questi sono tenuti a effettuare la compensazione del colore nei tre canali utilizzati nell'analisi. Inoltre, sono necessarie cellule senza etichetta per impostare le tensioni e le porte per l'ordinamento. Idealmente le cellule iPS sono utilizzate per la compensazione: le scorte di 0,5-1 x 10 6 cellule iPS mantenute sul MEF irradiati vengono memorizzati in cryovials in azoto liquido. La presenza di MEF è essenziale per ottenere un segnale nel canale Thy-1.2. Scongelare una esageratamente di cellule iPS come descritto per MEF (sezione 3). Dopo la centrifugazione, risospendere le cellule in 800 ml di buffer di etichettatura e 200 ml di questo campione viene messa da parte come controllo senza etichetta. Utilizzare le cellule rimanenti come controlli di compensazione. Le cellule si dividono tra tre tubi 15 ml e anticorpi aggiungerecome segue: Pacific Blue controllo della compensazione: aggiungere 0,5 ml di anticorpo anti-Thy-1.2 Blue Pacific. FITC tubo di compensazione: aggiungere 0,5 ml di anticorpo anti-EpCAM-FITC. Pe-Cy7 controllo della compensazione: 0,5 ml di anticorpo anti SSEA-1-biotina. Conservare i campioni di cellule-anticorpo in ghiaccio per 10 minuti, mescolare toccando e incubare per 10 minuti in ghiaccio. Campioni Lavare con 10 ml di PBS freddo per rimuovere l'anticorpo non legato, girare celle in basso e aspirare il surnatante. Pellet cellulari risospendere in 200 ml di FACS mezzi etichettatura. Per anti-SSEA-1-biotina campioni etichettati, aggiungere un coniugato streptavidina-PeCy7 (1 ml ogni 200 cellule microlitri). Cellule Label come descritto per l'anticorpo primario (SSEA-1-biotina). Passare tutti i campioni, tra cui il controllo senza etichetta attraverso un filtro 70 micron e aggiungere PI (2 mg / ml). Trasferire le cellule di tubi FACS e tenere in ghiaccio fino al momento. 5. FACS isolamento di intermedi Nota:Le cellule vengono ordinati utilizzando una fluorescenza attivato cell sorter con 405 nm, 488 nm e 560 nm laser di eccitazione e un ugello di 100 micron. Impostare le tensioni per scatter in avanti e laterale in modo che la popolazione cellulare viene visualizzato correttamente. Disegnare un cancello intorno alle cellule, come indicato in Figura 5A per escludere detriti. Nota: Il set up corretto di tensioni sul cell sorter può essere complessa e richiede un operatore esperto FACS. Utilizzare forward scatter (FSC) altezza rispetto zona FSC escludere aggregati (Figura 5B). Visualizza il canale PI rispetto FSC per cancello sulle pi negativo cellule vive (Figura 5C). Utilizzare le cellule senza etichetta per regolare le tensioni per i canali fluorescenti di PB, FITC / GFP, Pe-Cy7. Idealmente posizionare la popolazione di cellule in corrispondenza dell'estremità inferiore del rispettivo canale. Impostare cancelli con le cellule di controllo non marcati come mostrato in Figura 6A, B alla frazione sub culto riprogrammazioneUres in giorno 3, 6 e 9 popolazioni: SSEA-1-/ Thy-1.2 + cellule; SSEA-1-/ Thy-1.2- cellule; e la riprogrammazione di tramite SSEA-1 + / Thy-1.2- cellule. Inoltre suddividere il giorno 9 SSEA-1 + / Thy-1.2- frazione utilizzando il Pe-Cy7 contro FITC macchia; disegnare cancelli tutto il Sse-A1 + / EpCAM + cellule e le SSEA-1 + / cellule Epcam-. Impostare cancelli con le cellule di controllo non marcati come illustrato in Figura 6C, D. Prefill tubi di raccolta appropriati, con supporto di cellule iPS (1-2 ml) prima cernita delle sottopopolazioni desiderati (vedere la Figura 7 per i profili FACS rappresentativi MEF, Giorno 3/6 ° giorno / Giorno 9 / Giorno 12 culture e cellule iPS). Eseguire FACS smistamento secondo produce protocollo. Dopo l'isolamento FACS presentare alle cellule di profiling molecolare (RNA / estrazione di proteine, immunoprecipitazione della cromatina, il DNA methylome analisi, ecc). In alternativa, le varie frazioni cellulari possono essere coltivate.