ماركر الخلايا السطحية تنقية بوساطة من الجذع الوسطيات خلية من نموذج قابل للبرمجة ماوس
Summary
Mouse embryonic fibroblast can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells at low efficiency by the forced expression of transcription factors Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. The rare intermediates of the reprogramming reaction are FACS isolated via labeling with antibodies against cell surface makers Thy-1.2, Ssea-1, and Epcam.
Abstract
Mature cells can be reprogrammed to a pluripotent state. These so called induced pluripotent stem (iPS) cells are able to give rise to all cell types of the body and consequently have vast potential for regenerative medicine applications. Traditionally iPS cells are generated by viral introduction of transcription factors Oct-4, Klf-4, Sox-2, and c-Myc (OKSM) into fibroblasts. However, reprogramming is an inefficient process with only 0.1-1% of cells reverting towards a pluripotent state, making it difficult to study the reprogramming mechanism. A proven methodology that has allowed the study of the reprogramming process is to separate the rare intermediates of the reaction from the refractory bulk population. In the case of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we and others have previously shown that reprogramming cells undergo a distinct series of changes in the expression profile of cell surface markers which can be used for the separation of these cells. During the early stages of OKSM expression successfully reprogramming cells lose fibroblast identity marker Thy-1.2 and up-regulate pluripotency associated marker Ssea-1. The final transition of a subset of Ssea-1 positive cells towards the pluripotent state is marked by the expression of Epcam during the late stages of reprogramming. Here we provide a detailed description of the methodology used to isolate reprogramming intermediates from cultures of reprogramming MEFs. In order to increase experimental reproducibility we use a reprogrammable mouse strain that has been engineered to express a transcriptional transactivator (m2rtTA) under control of the Rosa26 locus and OKSM under control of a doxycycline responsive promoter. Cells isolated from these mice are isogenic and express OKSM homogenously upon addition of doxycycline. We describe in detail the establishment of the reprogrammable mice, the derivation of MEFs, and the subsequent isolation of intermediates during reprogramming into iPS cells via fluorescent activated cells sorting (FACS).
Introduction
وتستمد الجذعية الجنينية (ES) خلايا من الكتلة الخلوية الداخلية من الكيسة مرحلة الأجنة 1. تحت ظروف التربية المناسبة التي تجديد الذات والبقاء المحفزة. في عام 2006 أظهرت ياماناكا وزملاؤه أن الخلايا الناضجة يمكن برمجتها إلى ما يسمى الجذعية المحفزة (آي بي إس) الخلايا عن طريق التعبير القسري للعوامل النسخ أكتوبر 4، KLF-4، سوكس-2، C-MYC (OKSM) 2. خلايا الجذع، مثل خلايا ES، يمكن أن تؤدي إلى كل أنواع الخلايا في الجسم، ومع ذلك، لأنها خالية من القيود الأخلاقية المحيطة توليد خلايا ES 3. وعلاوة على ذلك، خلايا الجذع تحمل الوعد شخصية الطب التجديدي وعقد إمكانات هائلة لتطبيقات مثل النمذجة المرض والمخدرات في المختبر فحص 4،5. من أجل إعادة برمجة التكنولوجيا لتحقيق هذه الإمكانات، والآلية الأساسية لإعادة برمجة النووية يحتاج إلى أن يفهم بشكل كامل. ومع ذلك، فإن الجهود لتشريح بات برمجةوقد أعاق hway من حقيقة أنه ليس هناك سوى عدد قليل جدا من الخلايا إعادة برمجة (0.1-1٪). وقد تم الإبلاغ عن إعادة برمجة الخلايا الليفية بنجاح للخضوع لسلسلة متميزة من الأحداث بما في ذلك الوسيطة إلى انتقال الظهارية 6-10، وفي المراحل النهائية من إعادة برمجة، وتفعيل الشبكة الأساسية تعدد القدرات الذاتية 11-14. نحن وغيرنا 12،13،15-17 قد حددت مؤخرا مجموعة من علامات سطح الخلية التي تسمح للفصل بين سيطة نادرة من السكان بالجملة الحرارية. إعادة برمجة الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFs) يحدث لها تغيرات في التعبير عن خاصتك-1.2، Ssea1 وEpcam (وغيرهم) خلال عملية إعادة برمجة 2 أسابيع طويلة 15. في وقت مبكر خلال إعادة برمجة مجموعة فرعية من MEFs أسفل تنظيم التعبير عن علامة هوية الخلايا الليفية (خاصتك 1.2) ثم قم بتشغيل التعبير عن تعدد القدرات المرتبطة علامة SSEA-1 12. خلال المراحل النهائية من إعادة برمجة خلايا Ssea1 إيجابية reactivأكل الجينات تعدد القدرات الذاتية مثل أكتوبر 4 10-13،15. ويتميز هذا التحول الأخير على سطح الخلية التعبير كشفها من Epcam (انظر الشكل 1) أو في مرحلة لاحقة PECAM 15. مؤخرا، ذكرت أومالي آخرون استخدام CD44 وiCAM1 كبدائل أو مكملة لدنك 1.2 وSSEA-1 لتحديد سيطة إعادة برمجة. لقد سبق FACS استخراج سيطة إعادة برمجة من يوم 0، 3 يوم، يوم 6 والثقافات ويوم 9 يوم 12 إعادة برمجة، وكذلك من خطوط الخلايا المحفزة أنشئت على أساس هذه العلامات سطح الخلية 15،18. لإعادة برمجة النظام والشروط الموضحة أدناه أظهرنا على مستوى خلية واحدة على الرغم من أن السكان هادئة متجانسة، هناك درجة معينة من عدم التجانس في السكان وسيط تحديدها. تجدر الإشارة إلى أن مجموعة فرعية فقط من الخلايا داخل هؤلاء السكان هي قادرة على التقدم إلى ستا المقبل منهاجنرال الكتريك لعملية إعادة برمجة وتؤدي إلى مستعمرات الخلايا المحفزة على الكفاءات المختلفة، التي تميزت على نطاق واسع في وقت سابق 15،19. وعلاوة على ذلك، فإن كفاءة إعادة برمجة هؤلاء السكان يعتمدون كذلك على إعادة الطلاء وثقافة الظروف. لزيادة استنساخ التجريبي نستخدم سلالة الماوس قابل للبرمجة التي تم تصميمها للتعبير عن transactivator النسخي (m2rtTA) تحت سيطرة موضع Rosa26 وكاسيت OKSM متعدد المقارين تحت سيطرة الدوكسيسيكلين المروج استجابة 20،21. باستخدام هذا نموذج الفأر تلتف الآثار الجانبية غير المرغوب فيها من أساليب الفيروسية التقليدية من جيل خلية الجذع، أي السكان غير متجانسة مع انطلاق الخلية إلى خلية التغير في عدد وموقع من المواقع دمج إدراج الفيروسية. وأن عبرت سلالتين الماوس المعدلة وراثيا (OKSM، m2rtTA)، المتاحة كحيوانات مؤسس متماثلة اللواقح في مختبر جاكسون، من أجل إنشاء reprograنموذج الفأر mmable (انظر الشكل 2). في هذا المخطوط ونحن تصف بالتفصيل كيفية اشتقاق MEFs، وتوليد خلايا الجذع، وعزل سيطة إعادة برمجة في مراحل مختلفة من عملية التحويل من نظام مراقبة الأصول الميدانية.
Protocol
Representative Results
Discussion
من أجل إعادة برمجة بنجاح MEFs إلى خلايا الجذع لتنقية وسيطة في إعادة برمجة كمية عالية من الضروري أن يكون على بينة من العوامل التي لها تأثير على الكفاءة بوجه عام. ولا سيما دفعة من FBS تستخدم لتكملة الإعلام الجذع يمكن أن يكون لها تأثير ضار. في التجارب الإيجابية العامة قدمت مع الجذعية الجنينية FBS المؤهلة (ES) الخلية ولكن الاختبار دفعة من الأمصال من مجموعة متنوعة من البائعين قد تحدد بديلا أرخص.
وثمة عامل آخر يؤثر على كفاءة إعادة برمجة هي من النمط الجيني MEFs 15،20. على الرغم من MEFs المستمدة من الفئران متخالف (هيت) لكل من OKSM وموضع m2rtTA لا إعادة برمجة، homozygousity في واحد أو كلا مواضع النتائج في إعادة برمجة الكفاءة العالية. في الواقع، MEFs المشتقة من نسل OKSM وm2rtTA الصلبان تظهر زيادة في كفاءة إعادة برمجة بالترتيب التالي (OKSM / m2rtTA): هيت / هيت <وطي / هيت <هيت / وطي <وطي /وطي (يرجى ملاحظة أن الأرقام الواردة في الجدول 1 هي للحيوانات هيت / هيت). بمناسبة نادرة يتم التعرف على الذكور وطي / وطي الحيوان، يمكن تعيين الحريم التزاوج مع الإناث متعددة m2rtTA المباراة. سيتم هيت جميع النسل من هذه الصلبان / وطي لOKSM / m2rtTA مواضع، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك، أوصى التنميط الجيني السريع من الفضلات ويتم الحصول على الفضلات أكبر عند استخدام الفئران الأصغر سنا للتربية (6-15 أسابيع من العمر).
علاوة على ذلك، أكد استخدام MEFs مرور منخفضة لإعادة برمجة 23. إذا تم اشتقاق MEFs وتوسعت في normoxic حاضنة زراعة الأنسجة نحن نوصي بشدة لاستخدام هذه الخلايا فقط حتى مرور 2. ومع ذلك، إذا المجرب ديه حق الوصول إلى حاضنة انخفاض الأكسجين (5٪ أكسجين) لاشتقاق وتوسيع MEFs، أرقام مرور تصل إلى 3 لا تزال تسفر عن نتائج جيدة 23.
في حالة المجرب اجه المشاكل المرتبطة برمجة، كما هو مبين، والتفسيرات الأكثر احتمالا أرقام مرور عالية في وقت بالإضافة دوكس، راثى غير صحيح من الفئران أو استخدام FBS التي لا تساعد في توليد خلايا الجذع. ومع ذلك، في بعض الحالات النادرة لاحظنا أن MEFs لم تكن قادرة على إعادة برمجة حتى في ظل ظروف مثالية. في هذه الحالات تم تحديد عفوية دي نوفو حذف ضمن إطار القراءة المفتوح في m2rtTA باعتبارها السبب الكامن.
وقد تم تكييف هذه المنهجية بنجاح لاستخراج SSEA-1 + سيطة عبر عزل الخلايا المغناطيسية (MACS). هناك ميزة زمنية واضحة في استخدام أجهزة ماكينتوش، ومع ذلك، يتم تقليل نقاء SSEA-1 + السكان الخلية إلى 80-90٪، وليس أكثر من 95٪، والتي تبعا لنوع التجربة تتجه الخلايا لمدة قد تشكل مشكلة. وهكذا، وهو خيار هو استخدام MACS لإثراء لSSEA-1 + خلايا تليها FACS لزيادة نقاء و / أو جزء منها الى SSEA-1 + / + Epcam وSSEA-1 + / خلايا Epcam-.
"> في حين أن خلايا الجذع التي تنتجها بروتوكول المبين ونموذج الفأر وقد ثبت أن تكون المحفزة والمساهمة بشكل فعال إلى جميع أنسجة حيوانات خيالية 15،20، كان خفض القدرة على إنتاج أجنة مؤلفة بكاملها من هذه الخلايا المحفزة عبر تكامل رباعي الصيغة الصبغية تظاهر 24. وقد تم تحديد أنماط مثيلة الشاذة في الكتلة الجين دلك-Dio3 والسبب الكامن وراء 24. ومع ذلك، فإن إضافة حمض الاسكوربيك في تركيز 50 ميكروغرام / مل إلى وسائل الإعلام خلال إعادة برمجة تكامل رباعي الصيغة الصبغية تنتج خلايا الجذع المختصة 24. يرجى العلم أن الفأر نموذج قابل للبرمجة بديل هندسيا للتعبير عن عوامل إعادة البرمجة في رياضيات الكيمياء مختلفة يمكن أن تنتج خلايا الجذع المختصة رباعي الصيغة الصبغية حتى في غياب العلاج حمض الاسكوربيك 25، ولكن في خلايا أيدينا من هذه السلالة في إعادة برمجة حد كبير انخفاض وتيرة مقارنة إلى هنا استخدام وضع الماوسلتر.المنهجية الموضحة في هذه المخطوطة تسمح للفصل سيطة الجزء الأكبر من إعادة برمجة الحرارية من السكان، وينبغي أن ينظر إليها على أنها أداة قيمة لتشريح وفهم عملية إعادة البرمجة، وإزالة القيود السابقة من الحاجة إلى استخدام السكان unfractioned عن التنميط (على سبيل المثال، الضوضاء إشارة عالية من الخلايا الحرارية). مزيج الأجسام المضادة الموصوفة هنا يسمح العزلة وسيطة من خلايا فأر في نقاء عالية، ومع ذلك فمن الممكن أن علامات إضافية سطح الخلية سيتم كشف في المستقبل من شأنها أن تسمح للحصول سيطة في أعلى نقاء. يرجى ملاحظة أن SSEA-1 التعبير ليس السمة المميزة للخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان وعلى هذا النحو هذا البروتوكول لا يمكن أن تستخدم في إعادة برمجة خلايا المنشأ البشرية. في الختام، وسيطة إعادة برمجة معزولة مرة واحدة مع الطريقة الموصوفة يمكن استخدامها لالتحليلات الجزيئية بما في ذلك التعبير profilinز، لونين مناعي، methylome التحليل، والبروتين المقايسات.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشيد بالدعم المالي من برنامج فإصابة موناش وكذلك من NHMRC CDF ومنحة مشروع NHMRC. وعلاوة على ذلك، نود أن نشكر سو مي ليم لها اقتراحات بناءة، إدوينا McGlinn لدعمها وفريق موناش Flowcore (ولا سيما آدم Dinsdale) لمساعدتهم في إنتاج الفيديو.
Materials
| Anti-mouse CD90.2 (Thy1.2) Pacific Blue | eBioscience | 48-0902-82 | |
| Anti-Human/Mouse SSEA-1 Biotin | eBioscience | 13-8813 | |
| Streptavidin PE-Cy 7 | eBioscience | 25-4317-82 | |
| Anti- Mouse CD326(Epcam) Fitc | eBioscience | 48-5791-82 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| Embryonic Stem Cell qualified Foetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10439024 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-070 | |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140 | |
| Propidium Iodide solution (PI) | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | |
| Gelatine from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Doxycyclin hyclate | Sigma-Aldrich | 33429-100MG-R | |
| Leukemia Inhibitory Factor (LIF) | Millipore | ESG1107 | |
| DMEM High Glucose | Life Technologies | 11960-044 | |
| DPBS (Dulbecco s phosphate buffer saline) | Life Technologies | 14190-144 | |
| KnockOut DMEM | Life Technologies | 10829-018 | |
| Irradiated MEFs | Life Technologies | S1520-100 | |
| 75-cm2 Tissue culture flasks | Corning/BD Bioscience | 430641 | |
| 15-ml centrifuge tubes | Corning/BD Bioscience | 430791 | |
| 50-ml centrifuge tubes | Corning/BD Bioscience | 430829 | |
| Disposable surgical blades | Disposable surgical blades | 201 | |
| Cryogenic vials | Corning/BD Bioscience | 430487 | |
| 70 µm Cell strainer | BD Bioscience | 352340 | |
| Taq DNA Polymerase | Life Technologies | 10342-020 |
Riferimenti
- Matsui, Y., Zsebo, K., Hogan, B. L. Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture. Cell. 70, 841-847 (1992).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Stadtfeld, M., Maherali, N., Borkent, M., Hochedlinger, K. A reprogrammable mouse strain from gene-targeted embryonic stem cells. Nature Methods. 7, 53-55 (2010).
- Ebert, A. D., Svendsen, C. N. Human stem cells and drug screening: opportunities and challenges. Nature Reviews. Drug Discovery. 9, 367-372 (2010).
- Zhang, J., et al. A human iPSC model of Hutchinson Gilford Progeria reveals vascular smooth muscle and mesenchymal stem cell defects. Cell Stem Cell. 8, 31-45 (2011).
- Samavarchi-Tehrani, P., et al. Functional genomics reveals a BMP-driven mesenchymal-to-epithelial transition in the initiation of somatic cell reprogramming. Cell Stem Cell. 7, 64-77 (2010).
- Celià-Terrassa, T., et al. Epithelial-mesenchymal transition can suppress major attributes of human epithelial tumor-initiating cells. The Journal of Clinical Investigation. 122, 1849 (2012).
- Liao, B., et al. MicroRNA cluster 302–367 enhances somatic cell reprogramming by accelerating a mesenchymal-to-epithelial transition. Journal of Biological Chemistry. 286, 17359-17364 (2011).
- Cieślik, M., et al. Epigenetic coordination of signaling pathways during the epithelial-mesenchymal transition. Epigenetic., & Chromatin. 6, 1-22 (2013).
- Golipour, A., et al. A late transition in somatic cell reprogramming requires regulators distinct from the pluripotency network. Cell Stem Cell. 11, 769-782 (2012).
- Maherali, N., et al. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
- Stadtfeld, M., Maherali, N., Breault, D. T., Hochedlinger, K. Defining molecular cornerstones during fibroblast to iPS cell reprogramming in mouse. Cell Stem Cell. 2, 230-240 (2008).
- Brambrink, T., et al. Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of mouse somatic cells. Cell Stem Cell. 2, 151-159 (2008).
- Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
- Polo, J. M., et al. A molecular roadmap of reprogramming somatic cells into iPS cells. Cell. 151, 1617-1632 (2012).
- Wright, A. J., Andrews, P. W. Surface marker antigens in the characterization of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 3, 3-11 (2009).
- O’Malley, J., et al. High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells. Nature. , (2013).
- Hansson, J., et al. Highly coordinated proteome dynamics during reprogramming of somatic cells to pluripotency. Cell Reports. 2, 1579-1592 (2012).
- Stadtfeld, M., Maherali, N., Breault, D. T., Hochedlinger, K. Defining molecular cornerstones during fibroblast to iPS cell reprogramming in mouse. Cell Stem Cell. 2, 230-240 (2008).
- Stadtfeld, M., Maherali, N., Borkent, M., Hochedlinger, K. A reprogrammable mouse strain from gene-targeted embryonic stem cells. Nature Methods. 7, 53-55 (2009).
- Sommer, C. A., et al. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 27, 543-549 (2009).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2, 3081-3089 (2007).
- Utikal, J., et al. Immortalization eliminates a roadblock during cellular reprogramming into iPS cells. Nature. 460, 1145-1148 (2009).
- Stadtfeld, M., et al. Ascorbic acid prevents loss of Dlk1-Dio3 imprinting and facilitates generation of all-iPS cell mice from terminally differentiated B cells. Nature Genetics. 44, 398-405 (2012).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 9, 588-598 (2011).
