Produção de Haplóide embriões Zebrafish por<em> In Vitro</em> Fertilização
Summary
The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.
Abstract
O peixe-zebra tornou-se um modelo de vertebrados dominante que é relevante para muitas disciplinas de estudo científico. Zebrafish são especialmente adequadas para a análise genética para a frente dos processos de desenvolvimento, devido à sua fecundação externa, tamanho embrionário, ontogenia rápida e claridade óptica – uma constelação de traços que permitem a observação direta de eventos que vão desde a gastrulação a organogênese com uma lupa básico. Além disso, os embriões de peixe-zebra pode sobreviver durante vários dias no estado haplóide. A produção de embriões haplóides in vitro é uma ferramenta poderosa para a análise mutacional, pois permite a identificação de alelos mutantes recessivos presente na primeira geração (F1) portadoras seguintes mutagênese no pais (P) geração. Esta abordagem elimina a necessidade de elevar várias gerações (F2, F3, etc), que envolve a criação de famílias de mutantes, assim poupando o tempo de pesquisa juntamente com a reduçãoas necessidades de espaço para zebrafish colônia, o trabalho e os custos de criação. Apesar de peixe-zebra foram usados para conduzir para a frente telas para as últimas décadas, tem havido uma expansão constante de transgênicos e genoma ferramentas de edição. Essas ferramentas oferecem agora uma infinidade de maneiras de criar ensaios nuances para as telas de próxima geração que podem ser usados para dissecar ainda mais as redes de regulação gênicas que impulsionam vertebrados ontogenia. Aqui, descrevemos como preparar embriões de peixe-zebra haplóides. Este protocolo pode ser implementado para novas futuras telas haplóides, tais como em telas intensificadoras e supressoras, para abordar os mecanismos de desenvolvimento de um largo número de processos e de tecidos que se formam durante estágios embrionários iniciais.
Introduction
Os processos fundamentais que orquestram o desenvolvimento dos vertebrados são amplamente conservadas 1. Uma forma poderosa para identificar genes com papel essencial no desenvolvimento é isolar mutações hereditárias que levam a defeitos fenotípicos no processo de interesse. O peixe-zebra, Danio rerio, é uma pequena espécie de teleósteos de água doce pertencente à família Cyprinidae peixe que se tornou um organismo modelo amplamente utilizado para a genética do desenvolvimento de vertebrados ao longo das últimas décadas 2. Ovos de peixe-zebra são fertilizados externamente, permitindo o acesso ao zigoto do início da fertilização 3. Além disso, o embrião é opticamente transparente, permitindo a visualização do desenvolvimento com uma lupa simples 3. Ontogenia do peixe-zebra é rápida, com os processos de clivagem, a gastrulação, e a organogénese das muitas estruturas, tais como o coração e os rins, praticamente concluída ao longo do primeiro dia de desenvolvimento 3. Tele tempo de estágios larvais de maturidade sexual leva 2-3 meses, e os adultos são pequenos vertebrados cerca de 3-4 cm de comprimento, tantos peixes podem ser mantidos em espaço mínimo 2. Além disso, os adultos zebrafish têm alta fecundidade, com cada peixe capaz de produzir várias centenas de embriões por semana 2. Estes atributos tornaram a rastreabilidade do peixe-zebra para frente e para trás telas genéticos. Zebrafish possuem um alto grau de conservação em sua anatomia, biologia celular e fisiologia, com mais espécies de vertebrados avançados, como os mamíferos 2,4. De facto, a análise da sequência recente demonstrou que o genoma do peixe-zebra contém homólogos a cerca de 70% dos genes humanos 5. Esta conservação tem possibilitado aos pesquisadores usar zebrafish como um modelo para inúmeras doenças humanas, incluindo tanto embrionárias e as condições de adultos 2,4. Tomados em conjunto, esses fatores fizeram zebrafish um excelente sistema para as telas o objetivo de identificar genes que sãoessencial para a ontogenia dos vertebrados normal.
Um certo número de telas de grande escala foram efectuadas no peixe-zebra e foram identificados vários milhares de mutações em genes de desenvolvimento 6-8. O macho adulto zebrafish é passível de mutagênese e alterações cromossômicas podem ser gerados com freqüência relativamente alta usando o etilnitrosoureia mutagênico químico (ENU) 6,7 ou retroviral mutagênese insercional 9. Até o momento, mais de 9.000 mutações hereditárias foram criadas, e incluem genes que afetam praticamente todos os aspectos da embriogênese. A comunidade zebrafish estabeleceu um banco centralizado desses mutantes no Centro Internacional de Recursos Zebrafish (ou Zirc) 10, que reuniu cerca de 5.000 alelos mutantes e transgênicas de todo o mundo. Muitas destas mutações foram analisadas e clonado, dando a pesquisadores em todas as disciplinas biológicas informações valiosas que tem sido usado para provocar uma separação numeronos caminhos celulares e fisiológicos através dos conhecimentos provenientes de experimentos de peixe-zebra.
Apesar de telas para a frente têm identificado um número impressionante de genes importantes, ainda tem muito a ser apreciado sobre as redes de regulação genética que medeiam uma infinidade de processos. Muitas telas realizadas até o momento não atingiu a saturação e, assim, para a frente, bem como telas genéticos reversa mantiveram uma pedra angular para identificar e analisar mecanismos de embriogênese. Embora existam perspectivas enormes que pode ser adquirida a partir de uma única linhagem mutante peixe-zebra, um importante fator de limitação no campo tem sido historicamente o esforço demorado envolvidos na clonagem posicional. Por esta razão, a identidade de várias mutações induzidas quimicamente tem permanecido um mistério. Contudo, com o advento recente de abordagens de sequenciamento do genoma inteiro que facilitam a clonagem rápida 11-14, identificação extremamente eficiente de mutações genéticas é agora feasible.
O ecrã para a frente prototípico no peixe-zebra é uma tela diplóide que pode identificar mutações recessivas dentro de três gerações 6,7 (Figura 1, coluna da esquerda). Esta técnica envolve a geração de mutações nas células germinativas dos pais (P) do sexo masculino e, em seguida, este macho acasalar com uma fêmea tipo selvagem. Cada um dos descendentes da primeira geração (F1) a partir deste acasalamento irá abrigar uma ou mais mutações únicas devido às contribuições cromossômicos do genoma paterno mutado. A progênie F1 são levantadas e outcrossed com tipos selvagens para criar famílias F2. Na família F2, irmãos vai ser do tipo selvagem ou portadores heterozigóticos, e são incrossed aleatoriamente para gerar garras F3 que são analisadas quanto ao fenótipo (s) de interesse. As embreagens F3 de portadores heterozigotos irá conter 25% do tipo selvagem, 50% de heterozigotos e 25% peixe mutante homozigoto. Esse esquema de triagem multi-geracional é eficaz, no entanto, uma grande desvantagem para isso umstratégia inclui o tempo necessário para se preparar para a tela: pelo menos 1 ano de criação de peixe sozinho está envolvido, uma vez que cada geração requer cerca de 3 meses para atingir a maturidade sexual. Outras limitações deste tipo de tela diplóide são obra, espaço e custo da habitação essas gerações.
A tela haplóide é uma alternativa que pode ser utilizada para identificar e subsequentemente isolar mutações recessivas utilizando estratégias de mutagénese semelhante 15 (Figura 1, coluna da direita). A produção de embriões de peixes-zebra haplóides foi descrita pela primeira vez há mais de 30 anos 16, e a capacidade de o peixe-zebra normalmente diplóide desenvolver durante vários dias com uma ploidia cromossómico haplóide foi utilizado para numerosos estudos genéticos uma vez que este tempo. A principal vantagem da tela haplóides é que este método não envolve cuidando das famílias F2, a fim de rastrear alelos mutantes recessivos. Em vez disso, as fêmeas geração F1 são avaliadas paraheterozigosidade de mutações recessivas no processo de interesse por análise da sua descendência F2 em estado haplóide (Figura 1, coluna da direita). Em geral, os passos para adquirir embriões haplóides são relativamente simples (Figura 2). Após a preparação das soluções necessárias para a manipulação de espermatozóides, os ovos são obtidos a partir de fêmeas de geração F1 por manipulação manual a fim de fazer a extrusão (ou "apertar") os ovos da barriga. Uma vez que os ovos são obtidos, eles são fertilizados in vitro por exposição à luz ultravioleta (UV) do esperma inactivado. O esperma inactivado UV são incapazes de contribuir DNA viável para o ovo, devido ao facto de o comprimento de onda UV curto reticula o DNA paterno. No entanto, o esperma ainda são capazes de desencadear a actividade de ovo e os eventos associados com o desenvolvimento zigótica. Após a ativação metabólica, o ovo vai completar a meiose II, e prosseguir para desenvolver apenas com a uma cópia de cada maternalmente depositado chromosome. Devido a esta ploidia 1N, o embrião está sujeita às consequências para o desenvolvimento de um alelo mutante recessivo, se ele estiver presente num cromossoma materno. Assim, cada embreagem haplóides F2 irá conter 50% do tipo selvagem e 50% de embriões mutantes se a mãe é portadora heterozigótica de um alelo recessivo totalmente penetrante. Esta distribuição de genótipos embrionárias permite relativa facilidade em termos de avaliação da embraiagem para a presença do fenótipo mutante (s) de interesse. Se um tal fenótipo é detectado, o fundador fêmea geração F1 é subsequentemente outcrossed de tipo selvagem de peixe-zebra macho para criar e levantar mais portadores heterozigóticos. Porque não é necessário levantar várias gerações para executar a tela, o pesquisador pode economizar tempo considerável, trabalho e espaço de aquário, mas ainda tem o poder de examinar um número significativo de genomas com base no número de fêmeas F1 examinado. Assim, as telas haplóides são especialmente viável para pequenos laboratórios ou projetos iniciados no absence de um financiamento substancial.
No entanto, existem várias limitações e desvantagens ao uso de haplóides. Primeiro, os embriões de peixe-zebra haplóides viver por apenas alguns dias, e, normalmente, morrem entre 3 e 5 dias após a fertilização (dpf) 15. Zebrafish embriões haplóides podem ser distinguidas de diplóides com base em várias características, acima de tudo entre eles, sendo um corpo curto e atarracado que, no entanto, tem o número normal de segmentos somito 15,17. Com o desenvolvimento, as exposições do cérebro aumentou a morte celular ea circulação é pobre, geralmente associado com o acúmulo de sangue por 2-3 dpf e edema 15,17. Além disso, haplóides não inflar uma bexiga natatória 15,17. Independentemente destas diferenças morfológicas, a maior parte dos principais órgãos e tecidos são formados, incluindo o coração, os olhos, e o notocórdio de 15,17. Uma característica notável sobre garras haplóides é que eles contêm uma variedade de fenótipos em termos de variedades de embriões defeituosos & #8212; uma característica observada em todo cepas peixe-zebra. Assim, deve-se verificar se o tecido (s) e no ponto de tempo de interesse apresentam desenvolvimento razoavelmente normal na estirpe haplóide tipo selvagem e, por conseguinte, tem o potencial para ser avaliada quanto a defeitos genéticos em uma tela ou outro projecto de investigação.
Apesar destes desafios, telas haplóides têm sido implementadas com sucesso para identificar genes necessários para os processos de desenvolvimento iniciais do peixe-zebra, e os protocolos de haplóides foram recursos bem estabelecido na comunidade por muitos anos 15-19. Mais recentemente, o processo de geração de embriões de peixes haplóides tem sido utilizado pelos investigadores para criar haplóide estaminais embrionárias (ES) a partir de culturas de células do peixe medaka 20,21. Após a produção de embriões haplóides medaka in vitro, foram utilizados os embriões para obter culturas de células primárias que foram passadas durante cerca de 15 semanas, seguidas por mais de 5-8 semanas, para gerar clones puros de células haplóides comPropriedades das células ES 15-19. A geração de linhagens de células haplóides peixes ES detém ampla promessa futura para analisar fenótipos recessivos em linhagens de células de vertebrados, e representa uma nova abordagem para a análise genética nos próximos anos. Assim, a geração de embriões de peixes haplóides tem aplicações crescente na comunidade de pesquisa biomédica. Este artigo de vídeo fornece uma demonstração visual dos passos envolvidos com a produção de embriões de peixes-zebra haplóides in vitro utilizando esperma inactivado por UV baseado em protocolos estabelecidos 15-19,22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Triagem Haplóide é uma técnica útil para descobrir genes essenciais necessárias para os estágios iniciais de desenvolvimento. Além disso, a cultura de células haplóides do peixe medaka foi utilizado para isolar as linhas de células ES semelhantes que têm inúmeras aplicações de investigação e de potencial, o que demonstra que as células haplóides pode proporcionar um local futuro valioso para outros tipos de estudos genéticos vertebrados 20,21. Este protocolo proporciona uma demonstração dos métodos envolvidos com a realização da produção de embriões de peixes-zebra haplóides por fertilização in vitro com esperma inactivado por UV. Esta metodologia pode ser utilizada para realizar telas frente haplóides com peixe F1 mutagenizado, o qual pode ser feito utilizando o tipo selvagem, transgénicos ou estirpes mutantes para o rastreio potenciador / supressora.
Embora o tempo de triagem usando uma estratégia haplóide é muito reduzido em comparação com o rastreio diplóide, será, no entanto, levar vários meses para ser concluído. Como nós descricama anteriormente, existem muitos benefícios que existem através da realização de uma tela usando um esquema haplóides, que pode ajudar a fazer novas contribuições para o conhecimento atual sobre qualquer número de eventos de desenvolvimento. A metodologia tela haplóides é mais eficiente para a identificação de alelos mutantes recessivos do que telas diplóides baseados em função da redução do tempo, do espaço e do número de peixes que são necessários. No entanto, existem várias armadilhas para uma tela haplóide. Uma tela haplóides só pode identificar mutantes em genes que estão ativos nos primeiros dias de desenvolvimento, como o embrião só pode sobreviver por um tempo limitado, com um genoma haplóide. Os genes que são expressos mais tarde no desenvolvimento terão de ser identificado por um método diferente, tal como uma tela de diplóide. Além disso, alguns órgãos não se desenvolvem adequadamente em um organismo haplóide. Pode haver anormalidades anatômicas, ou uma hora atrasada de desenvolvimento, que podem causar a mutação para ser desperdiçada pela técnica de triagem haplóides. Eun disso, algumas cepas de peixe não se desenvolvem bem em uma condição haplóide 15. Haplóides podem ser categorizadas por uma série de classificação de bons, intermediários e pobres características embrionárias, com embriões sendo o mais normal, B para designar embriões com defeitos no eixo, mas a cabeça limpa e cauda, e C / D para designar embriões com irreconhecível características (massas de células em cima de bolas de gema) 15,17. As proporções de embriões dentro destas categorias varia de acordo com a tensão peixe-zebra, com aumento do número de haplóides de melhor qualidade mais prevalentes em determinadas origens genéticas 15,17. Devido a esses fatores, é necessário encontrar uma cepa adequada de peixe-zebra para realizar a mutagênese e cruzes subseqüentes. Em nossa experiência recente, o tipo selvagem Tübingen tensão produzida haplóides viáveis para triagem (como mostrado na Figura 3 e 4), embora os pesquisadores historicamente zebrafish têm utilizado a AB ou ab * cepas para experim haplóidesentação 15.
Em adição a estes desafios acima mencionados, nem todas as fêmeas de peixe-zebra adultos com primário irá produzir uma embraiagem mediante realização da técnica de compressão. Por exemplo, no trabalho com ENU-mutadas fêmeas tensão Tübingen, cerca de metade de todas as fêmeas produziu uma embreagem após apertar, e uma fração deles (tipicamente 10-30%) eram de má qualidade ou embrião não poderia ser fertilizado. Assim, para executar uma tela haplóides deve-se planejar para levantar pelo menos duas vezes como muitos peixes como necessário para a tela o número desejado de genomas (cada fêmea representa um genoma filtrada). Independentemente desta análise, os benefícios do método haplóide de triagem para cobrir um grande número de genomas sem uma instalação para animais maciço são bastante significativa se o ensaio é favorável para o estado haplóide. No entanto, também deve notar-se que o estudo mais aprofundado da mutação (ões) identificada na embraiagem haplóide é totalmente dependente de um levantamento com sucesson outcross do fundador feminino. Como acontece com qualquer tela, 'bate' inicialmente identificados durante o processo de seleção deve ser re-identificado no estado diplóide.
Apesar das armadilhas de usar a tela haplóides, tem mostrado ser muito bem sucedido em identificar mutantes, que foram analisadas em profundidade com ganhos perspicazes para o campo científico 15. Telas haplóides podem ser implementadas para investigar outros processos mal compreendidos do desenvolvimento dos vertebrados. Usando haplóides para telas Enhancer e supressores é uma maneira de ganhar mais conhecimento sobre as atividades e rede de regulação de um gene de interesse. A técnica de rastreio haplóide, também pode ser utilizado para identificar potenciadores e eliminadores de mutantes que já tenham sido isolados por meio de métodos tais como mutagénese química ou por inserção ou genética reversa abordagens como Tilling ou TALENS. Em suma, o mutante previamente isolado pode ser mutado com ENU e rastreados para potenciadores ou suppressors do fenótipo mutante inicial. O mutante deve ser capaz de alcançar as fases adultas, por isso, é necessário ter um animal heterozigótica ou uma fraco de peixe mutante homozigótica para executar este ecrã, no entanto os recentes avanços na transgénicos permitiram aos investigadores saia este problema. Aprender a manipular os caminhos do desenvolvimento pode levar a muitas possibilidades emocionantes, incluindo a perspectiva de caminhos perturbadores para tratar estados de doença.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo financiamento para a RAW a partir do seguinte: NIH concede K01 DK083512, DP2 OD008470 e R01 DK100237; March of Dimes Basil O'Connor Iniciado Scholar Award # 5-FY12-75; arranque fundos da Universidade de Notre Dame Faculdade de Ciências e Departamento de Ciências Biológicas; e uma generosa doação para a Universidade de Notre Dame de Elizabeth e Michael Gallagher, em nome da família Gallagher para fomentar a investigação em células estaminais. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Agradecemos aos funcionários do Departamento de Ciências Biológicas, pelo seu apoio, e do Centro de Pesquisa em Zebrafish Notre Dame para a sua notável dedicação no cuidado e bem-estar de nossa colônia de peixe-zebra. Agradecemos a GF Gerlach para tirar as fotografias fornecidas na Figura 4. Finalmente, agradecemos a todos os membros de nosso laboratório de pesquisa para seus comentários, discussões e insights sobre este trabalho.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Hank's Stock Solution #1 | 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #2 | 0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #4 | 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #5 | 1.23 g MgSO4-7H2O in 50 ml ddH2O | ||
| Hank's Premix | Combine in the following order: (1) 10.0 ml HS#1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solutions and Premix at 4 degrees Celcius. | ||
| Hank's Stock Solution #6 | 0.35 g NaHCO3 in 10.0 mls ddH2O; make fresh on day of use. | ||
| Hank's Final working solution | Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6 | ||
| XX-Series UV Bench lamp | UVP | 95-0042-05 | Model XX-15S Bench Lamp |
| XX Bench Stand (Adjustable) | UVP | 18-0062-01 | Model XX-15 Stand |
| Embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
| 50 X E3 | 250 mM NaCl, 8.5 mM KCL, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination. | ||
| 1 X E3 | Dilute 50 X E3 in distilled water | ||
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ645; SMZ1000 |
Riferimenti
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