半数ゼブラフィッシュ胚の生成により<em>体外</em>受精

半数体胚の生産は、一倍体は、突然変異誘発された親の子孫（ 図1）は、成熟したゼブラフィッシュ雌から得られた場合F2世代における劣性変異を同定するために実施することができる。これは研究者が、その二倍体子孫次いで、目的の表現型（ 図1）のために評価されたF2家族を調達する必要があった従来の二倍の画面と比較して、時間と空間を節約できます。 体外受精によってゼブラフィッシュ半数体胚を得るため、上記の手順1〜5に記載されているプロトコルの主な手順をフローチャート（ 図2）のように図式化している。これらのステップは、精子と卵子の調達によっておよび体外受精（2日目） に続いて、溶液の調製のと相手タンク（1日目）での男性ホルモンへの曝露による雌のプライミングに関与し、最終的に半数体の育成（3〜5日） （ 図2）。場合には、COM遺伝学的スクリーニングでbinedレトロウイルスベースの突然変異誘発などの他の手順は、実装することができますが、ゼブラフィッシュでは一般的突然変異誘発手順は、ENUのような化学的な変異原への変異原（ 例えば 、オスゼブラフィッシュの野生型成人の前の露出を含むも）染色体の欠陥のクローニングを容易に、突然変異誘発されたF1世代を作成するために、野生型の雌と繁殖させた。このような調製物は、その後の突然変異誘発された、F1 15,17,22の変異導入を行い、リア野生型に必要な世代時間に基づいて作業の数ヶ月（約6ヶ月）を必要とし、リア。 スクリーンのために半数体を採用した中での検討のための別の主なポイントは、ゼブラフィッシュ株の選択である。 AB *（A-Bスター）株は他の株15よりも優れた全体的な特徴や健康に半数体胚を生産するためによく知られるようになった。しかし、我々の実験室で飼育派生テュービンゲン株ではトーリー、我々は最近、（未発表G.ゲルラッハとR. Wingert、）腎臓系の発達異常を成功画面を有効にして発生学的な特徴を観察している。大人のゼブラフィッシュテュービンゲン株の雄は3 ENUの一連の処理により突然変異を誘発し、その後、スクリーニングのために、F1世代を生成するために、野生型テュービンゲン雌と交配させた。 F1雌が卵を得るために、圧迫され、これらのF2の卵は、UV不活性化精子と受精させた。野生型テュービンゲン両親（ 図3A）の自然交配して得られた二倍体のクラッチに比べて、これらの一倍テュービンゲン株クラッチ内の胚は半数体の状態（ 図3B、C）を短く、ずんぐりした体幹特性を示した。さらに、半数体は、典型的には、クラッチ15,17、さらに後述するように、株内で変化することが知られている（ 図3B、C）、我々は同様に観察され、欠陥の範囲を表示胚の兄弟からなる。 </p> これまでの研究では、半数体の表現型欠陥15,17の範囲を分類するために、AからDの等級Aに対応し、標準的なグレーディングシリーズを確立して、さらに一倍も形容詞良い、中間および低品質22の用語で呼ばれています。グレードAの半数は、高品質の半数に相当する、短くてがっちり体型で、外見はほとんど正常であるが、全体の半数体A級（ラベルに二倍体の兄弟（d）を比較する（二倍体15,17,22と類似の形態学的な外観を示しているA）兄弟、 図3B）。一倍グレードAの胚も半数体ゼブラフィッシュの開発15,17,22（ 図3B）の典型的な特徴である緩やかな心膜浮腫を発症する。グレードAの半数体と比較して、中間体、いわゆるグレードB半数体胚（ラベルB、3B、Cフィギュア ）をさらに短縮又はキンク/ twisの開発によって区別されるテッドトランク、頭と尾の特徴を明確に区別15,17,22であるけれども。最後に、（また、C / Dのようないくつかの参考文献に記載されている）グレードCまたは低品質半数は15,17,22非常に欠陥があると卵黄球（ラベルC、 図3C）との会合に、細胞の無秩序な質量を表示します。でも、同じ株の中で、一倍クラッチは1が観察する、A、B、Cの表現型の分布が異なります。例えば、1テュービンゲンの女性からの半数体のクラッチは、そのクラッチ数多くのグレードC半数体の子孫だけでなく、から成っ二テュービンゲン女性から得られた半数体に比べて、主にAとBグレード半数体の子孫（ 図3B）で、全体のより良い発展を表示とB半数体の表現型（ 図3C）。一倍体胚グレードの同じようなひずみの変動は、以前にも15 ABとAB *歪みの魚で観察されている。 これらのMORにもかかわらず、phological違いは、多くの構造の器官形成は、一倍体胚では比較的正常に進行。それらは短い体幹を有するが、目や心臓などの臓器の発達は、野生型二倍体胚のものと比較的類似しており、そのような色素細胞（メラニン保有細胞とxanthophores）のような細胞タイプはまた、15を評価することができる。加えて、我々は前腎、または胎児腎臓は、同様に、野生型二倍に、野生型の半数体で1日後の受精によって開発されていることが最近に文書化している。この証拠として、前腎細胞型のパターニングは、セグメントの原型パターン（ 図4）が表示されます。また、このようなレチノイン酸産生が減少し、LIB変異として前腎の開発を変える劣性突然変異の表現型は、二倍体の状態（ 図4）23,24と比べて半数体の状態で同様のパターンを示している。この観察結果は、他の不況のそれと一致しているこれは常に、すべての変異を有する場合ではないとスクリーン戦略15のこのタイプを評価する場合に留意すべきであるにもかかわらず、両方の半数体と二倍体の状態に類似した表現型を引き起こす変異をSIVE。 組織および器官の数は半数体で典型的に異常である。たとえば、半数体は血管形成のいくつかの側面を研究する能力が15を制限することがあり、一般的に血液のプールを示す循環の欠陥を、表示。また、半数体は、この構造体15の形態形成に関与する微妙なプロセスに影響を与える突然変異のためではない、それらが完全に耳胞の形成を防止する変異について評価することができるように、耳の開発に凹凸を有するができることが注目されている。これの別の例として、脳の形態形成は、半数体の異常であるため、必要な脳の発達経路を同定するためのスクリーニングは、半数体15が限定されている。これらの制限にもかかわらず、私たちのA半数体の状態（ 図4）における腎臓発生のnalysisは「スクリーニング可能な「胚性構造体のリストに、この器官が追加されます。この知見は、半数体スクリーンの方法論は、腎臓前駆細胞のパターニングの遺伝的要素を分析するために使用され、独創的なスクリーンのアプローチは脊椎動物の発生15を研究するための貴重な新しい変異体のモデルを明らかに半数体胚個体発生の制限を回避できることを感情に重点を追加することができることを強調しています。 図1。ゼブラフィッシュモデルでは二倍体と一倍スクリーン戦略の概略図。親世代の突然変異誘発の後、F1世代を上げ、二倍体の状態（左にF3世代をスクリーニングするために使用され、F2変異体ファミリーを生成するのにも使用することができます）または直接画面半数体戦略（右）に編半数体の画面では、性的に成熟したF1世代の雌を遺伝子解析のための半数体のF2クラッチを収集するために使用されています。 F2の半数の約半数が、野生型の半数体の兄弟（黄色の胚）に比べて変異体の表現型（赤胚）を表示した場合、女性のヘテロ接合キャリアが識別されます。 図2。半数体胚生産フローチャート。半数体胚を生成するために、体外受精の主なステップは、精子のソリューションおよびプライム大人のゼブラフィッシュの雌、2日目に実行されるタスク（オレンジ色のボックスを準備するために、1日目（ピンクボックス）で実行されるタスクとして図式化されている）を収集し、UV不活性化精子、卵を収集するために半数体を生成するために、UV不活性化精子と卵子を受精させる、その後、女性の母親を復活させる、と最終的に表示するYのタスクは、後続の日に行っ3-5クラッチを観察し、分析のために所望の時点（複数可）にインキュベートする（黄色のボックス）。 図3。二倍体と一倍テュービンゲンひずみゼブラフィッシュの胚の比較。 A）二倍体は、野生型の胚は、天然の産卵により製造し、次いで約30ゼブラまでインキュベートした。B、C）半数体は、野生型の胚は、UV不活性化精子とF1世代突然変異誘発雌から得られ、そしてまでインキュベートしたクラッチの体外受精により産生された約30 HPF。半数は二倍体の野生型胚（黒矢印、二倍体を示すD）と比較して、開発中の異常の範囲を示した。比較的正常半数は等級制度に類似した短縮、もっとストックボディを持っていた半数体15肉眼的異常を持つ半数体は、Bの等級に対応する深刻な切り捨て体軸（紫矢印、ラベルB）を示したが、（赤矢印は、Aと表示）、そして最後にグレードC（青矢印、ラベルC）に基づいて公表の記述15。すべての胚を2.5倍の倍率でのライブ写真撮影した。 半数体テュービンゲン株ゼブラフィッシュにおいて前腎胚腎臓器官を含む細胞型の図4発達パターニングは、野生型は半数体胚腎臓構造（最上行）に細胞型の正常パターンを示した。胎児腎臓はネフロンとして知られているセグメント化された機能ユニットのペアで構成されています。ネフロン中に存在する別個の細胞型のセグメント化されたパターンは、ホールマウントをもとにして視覚化することができる<ewt1b及びネフリンでマーク足細胞（P）を含む分化したネフロンの細胞型に固有の遺伝子転写産物のin situハイブリダイゼーションの発現パターン、slc20a1aによってマークされ、近位尿細管（PCT）、近位直細管（PSTにおけるm>拡張され、DEと共に）（デ）遠位早期slc12a1、およびslc12a3でマーク遠位尿細管後半（DL）でマーク、TRPM7でマーク。LIB半数体変異胚（下の行）の表示に減少足細胞、PCTおよび不在PST、二倍体胚LIB 18と同様とDLセグメント。胚を10倍の倍率で、左の前方で、背ビューで撮影した。