Productie van Haploid zebravis embryo's door<em> In Vitro</em> Bemesting
Summary
The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.
Abstract
De zebravis is uitgegroeid tot een mainstream gewervelde model dat relevant is voor vele disciplines van de wetenschappelijke studie is. Zebravis zijn bijzonder goed geschikt voor voorwaartse genetische analyse van ontwikkelingsprocessen vanwege hun externe bevruchting, embryonale grootte, snelle ontogenie en optische helderheid – een constellatie van eigenschappen die de directe waarneming van evenementen, variërend van gastrulation in organogenese met een basis stereomicroscoop schakelen. Verder kan zebravis embryo overleven enkele dagen in het haploïde toestand. De productie van haploïde embryo's in vitro is een krachtig hulpmiddel voor mutatieanalyse, omdat kan worden vastgesteld recessieve mutante allelen aanwezig op eerste generatie (F1) draagsters na mutagenese in het ouderlijk (P) genereren. Deze aanpak elimineert de noodzaak om meerdere generaties (F2, F3, enz.) die fokprogramma van mutant gezinnen gaat verhogen, waardoor het opslaan van de onderzoeker tijd samen met het verminderende behoefte aan zebravis kolonie ruimte, arbeid, en de veeteelt kosten. Hoewel de zebravis zijn gebruikt om naar uit te voeren schermen voor de afgelopen decennia, is er sprake van een gestage uitbreiding van transgene en genoom editing tools. Deze instrumenten bieden nu een overvloed aan manieren om genuanceerde assays voor de volgende generatie schermen die kunnen worden gebruikt voor het verder ontleden het gen regulerende netwerken gewervelde ontogenie schijf. Hier beschrijven we hoe u haploïde zebravis embryo's voor te bereiden. Dit protocol kan worden toegepast voor nieuwe toekomstige haploïde schermen, zoals bij enhancer en suppressor schermen, de mechanismen van ontwikkeling platform voor een groot aantal processen en weefsels tijdens de vroege embryonale stadia vormen.
Introduction
De fundamentele processen die gewervelde ontwikkeling orkestreren zijn grotendeels behouden 1. Een krachtige manier om genen essentiële rollen in ontwikkeling om erfelijke mutaties die leiden tot fenotypische defecten in het proces van belang te isoleren. De zebravis, Danio rerio, is een klein zoetwater teleost soorten die behoren tot de karpers vissen familie die is uitgegroeid tot een veelgebruikt modelorganisme voor gewervelde ontwikkelingsgenetica in de afgelopen tientallen jaren 2. Zebravis eieren worden extern bevrucht, waardoor toegang tot de zygote vanaf het begin van bevruchting 3. Verder is het vroege embryo optisch transparant, waardoor visualisatie van ontwikkeling met een eenvoudige stereomicroscoop 3. Zebravis ontogenie is snel, het proces van splitsing, gastrulatie en organogenese van vele structuren, zoals het hart en nieren, grotendeels voltooid op de eerste dag van ontwikkeling 3. Thij tijd van larvale stadia tot seksuele rijpheid duurt 2-3 maanden, en de volwassenen zijn kleine gewervelde dieren ongeveer 3-4 cm in lengte, kan zo veel vis in een minimale ruimte 2 worden gehandhaafd. Bovendien zebravis volwassenen hoge vruchtbaarheid, waarbij elke vis kunnen honderden embryo per week 2 produceren. Deze attributen hebben de traceerbaarheid van zebravis voor vooruit en achteruit verleende genetische screens. Zebravis beschikken over een hoge mate van conservering in hun anatomie, celbiologie en fysiologie met meer geavanceerde gewervelde diersoorten zoals zoogdieren 2,4. In feite is recent sequentie analyse toonde dat de zebravis genoom homologen tot bijna 70% van menselijke genen 5. Dit behoud is voor onderzoekers mogelijk om de zebravis als model te gebruiken voor tal van menselijke ziekten, met inbegrip van zowel embryonale en volwassen voorwaarden 2,4. Tezamen hebben deze factoren zebravis een uitstekend systeem voor scherm ter identificatie van genen die gemaaktessentieel voor een normale gewervelde ontogenie.
Een aantal grootschalige schermen zijn uitgevoerd in zebravis uitgevoerd en hebben enkele duizenden mutaties geïdentificeerd in ontwikkelingsgenen 6-8. De zebravis volwassen mannetje is vatbaar voor mutagenese, en chromosomale afwijkingen kunnen worden gegenereerd met relatief hoge frequentie, waarbij de chemische mutageen ethylnitrosourea (ENU) 6,7 of retrovirale insertiemutagenese 9. Tot op heden hebben meer dan 9000 erfelijke mutaties zijn gemaakt, en omvatten genen die vrijwel alle aspecten van de embryogenese beïnvloeden. De zebravis gemeenschap heeft een centrale bank van deze mutanten vastgesteld op de zebravis International Resource Center (of Zirc) 10, waarvan ongeveer 5.000 mutant en transgene allelen heeft verzameld uit de hele wereld. Veel van deze mutaties zijn geanalyseerd en gekloneerd, waardoor onderzoekers door biologische disciplines waardevolle informatie die is gebruikt om plagen elkaar numeroons cellulaire en fysiologische paden door de inzichten uit met zebravissen experimenten.
Hoewel schermen uit een indrukwekkend aantal belangrijke genen geïdentificeerd veel moet nog duidelijk de genetische regulerende netwerken die een groot aantal processen mediëren. Veel schermen tot nu toe ondernomen hebben geen verzadiging bereikt, en dus naar voren evenals omgekeerde genetische screens zijn een hoeksteen om mechanismen van embryogenese te identificeren en te analyseren gebleven. Hoewel er enorme inzichten die kan worden afgeleid uit een enkele mutant zebravis lijn, heeft een belangrijke beperkende factor op het gebied van oudsher de tijdrovende inspanning bij de positionele klonering. Daarom is de identiteit van vele chemisch geïnduceerde mutaties een raadsel gebleven. Echter, met de recente komst van whole genome sequencing benaderingen die snelle klonen 11-14 vergemakkelijken, ongelooflijk efficiënte identificatie van genetische mutaties is nu feasible.
De prototypische vooruit scherm in de zebravis is een diploïde scherm dat recessieve mutaties kunnen identificeren binnen drie generaties 6,7 (Figuur 1, linkerkolom). Deze techniek omvat het genereren van mutaties in de geslachtscellen van de parentale (P) mannelijke, en koppelen deze man met een wildtype vrouwelijk. Elk van de eerste generatie (F1) nakomelingen van deze combinatie zal herbergen een of meer unieke mutaties door het chromosomale bijdragen van de gemuteerde vaderlijke genoom. De F1 nakomelingen zijn verhoogd en outcross met wilde soorten te F2 gezinnen te creëren. In de F2-familie, zal siblings of wild type of heterozygote dragers zijn en worden willekeurig incrossed F3 koppelingen die worden geanalyseerd op fenotype (s) van belang te genereren. De F3 klauwen van heterozygote dragers zal 25% wild-type, 50% heterozygoot, en 25% homozygote mutant vis bevatten. Deze multi-generationele screening schema is effectief, maar een groot nadeel aan dit eenAANPAK omvat de tijd die nodig is om voor te bereiden op het scherm: minimaal 1 jaar van vis veeteelt alleen betrokken is, omdat elke generatie vergt ongeveer 3 maanden geslachtsrijp. Andere beperkingen van dit soort diploïde scherm zijn het werk, ruimte en kosten van huisvesting deze generaties.
De haploïde screen is een alternatief dat kan worden gebruikt om recessieve mutaties te identificeren en vervolgens te isoleren met vergelijkbare mutagenese strategieën 15 (figuur 1, rechterkant). De productie van haploïde zebravis embryo werd eerst beschreven in 30 jaar geleden 16 en het vermogen van de normale diploïde zebravis ontwikkelen gedurende enkele dagen een haploïde chromosomale ploïdie is gebruikt voor tal van genetische studies sinds die tijd. Het grote voordeel van het haploïde scherm is dat deze methode niet gepaard gaat met het verhogen van F2 families om te screenen op recessieve mutant allelen. In plaats daarvan worden de F1-generatie vrouwtjes geëvalueerdheterozygotie van recessieve mutaties in het proces van belang zijn bij hun onderzoek F2 nakomelingen in een haploïde toestand (figuur 1, rechter kolom). Kortom, de stappen om haploïde embryo schaffen relatief eenvoudig (figuur 2). Na bereiding van de benodigde oplossingen sperma hanteren, zijn eieren van F1-generatie vrouwtjes verkregen door handmatige manipulatie teneinde extruderen (of "squeeze") de eieren van de buik. Nadat de eieren zijn verkregen, worden ze in vitro bevrucht door blootstelling aan ultraviolet (UV) geïnactiveerd sperma. De UV geïnactiveerde sperma staat dragen levensvatbare DNA om het ei te wijten aan het feit dat de korte golflengte UV verknoopt de vaderlijke DNA. Echter, het sperma nog in staat triggering ei activiteit en de gebeurtenissen in verband met zygotische ontwikkeling. Bij metabole activering, zal het ei voltooien meiose II, en ga verder te ontwikkelen met alleen de een de moeder afgezet exemplaar van elk chromome. Hierdoor 1N ploïdie, het embryo onder de ontwikkeling gevolgen van een recessief mutant allel, indien aanwezig op een moederlijke chromosoom. Dus elk F2 haploïde koppeling wordt 50% wildkleur en 50% mutant embryo's bevatten als de moeder is een heterozygote drager van een volledig penetrant recessief allel. Deze verdeling van embryonale genotypes kunnen betrekkelijk gemakkelijk voor het evalueren van de koppeling op de aanwezigheid van mutant fenotype (s) plaats. Indien een dergelijke fenotype wordt gedetecteerd, wordt de F1-generatie vrouwelijke oprichter vervolgens outcross wildtype male zebravis meer heterozygote dragers maken en te verhogen. Omdat het niet nodig is om meerdere generaties te verhogen om het scherm uit te voeren, kan de onderzoeker veel tijd, arbeid en aquarium ruimte te besparen, maar heeft nog steeds de mogelijkheid om een groot aantal van genomen op basis van het aantal F1-vrouwtjes onderzocht overzien. Zo haploïde schermen zijn bijzonder haalbaar voor kleine laboratoria of projecten gestart in de absence van aanzienlijke financiering.
Er zijn echter verscheidene beperkingen en nadelen aan het gebruik van haploïden. Eerste, haploïde zebravis embryo's leven slechts enkele dagen, en meestal sterven tussen de 3 en 5 dagen na de bevruchting (DPF) 15. Haploid zebravis embryo's kunnen worden onderscheiden van diploïde basis van verschillende karakteristieken, belangrijkste onder hen zijn kort en gedrongen lichaam dat niettemin is normaal aantal somite segmenten 15,17. Naarmate de ontwikkeling vordert, de hersenen vertoont verhoogde celdood en de circulatie is slecht, meestal geassocieerd met bloed pooling met 2-3 DPF en oedeem 15,17. Verder haploiden niet tot een zwemblaas 15,17 blazen. Ondanks deze morfologische verschillen meeste belangrijke organen en weefsels gevormd, waaronder het hart, oog en notochorda 15,17. Een kenmerk opgemerkt over haploïde koppelingen is dat ze bevatten een scala van fenotypen in termen van rassen van defecte embryo's & #8212; een functie waargenomen over zebravis stammen. Zo moet men controleren of het weefsel (s) en tijd bijzondere plaats blijkt redelijk normale ontwikkeling in het wildtype haploïde stam en derhalve het potentieel om te worden geëvalueerd voor genetische defecten in een scherm of ander onderzoek.
Ondanks deze uitdagingen, zijn haploïde schermen met succes geïmplementeerd om genen die nodig zijn voor de vroege ontwikkeling van processen in de zebravis te identificeren, en haploïde protocollen zijn goed ingeburgerd middelen in de gemeenschap voor vele jaren 15-19. Meer recent is het proces van het genereren haploïde visembryo's gebruikt door onderzoekers haploïde embryonale stamcellen (ES) celculturen van medaka vis 20,21 creëren. Na de productie van medaka haploïde embryo's in vitro, werden de embryo's die primaire celkweken die werden gepasseerd gedurende 15 weken gevolgd door een 5-8 weken zuivere klonen van haploïde cellen met genereren leidenES-cel eigenschappen 15-19. De generatie van vis haploïde ES cellijnen houdt brede belofte voor de toekomst voor het analyseren van recessieve fenotypes bij gewervelde cellijnen, en vertegenwoordigt een nieuwe benadering voor de genetische analyse in de komende jaren. Zo is het genereren van haploïde vis embryo is groeiende toepassingen in de biomedische onderzoeksgemeenschap. Deze video artikel geeft een visuele demonstratie van de stappen die betrokken zijn bij de productie van haploïde zebravis embryo's in vitro met behulp van UV-geïnactiveerd sperma op basis van vastgestelde protocollen 15-19,22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Haploïde screening is een nuttige techniek om essentiële genen vereiste voor de vroege ontwikkelingsstadia ontdekken. Verder is het kweken van haploïde cellen van de vis medaka gebruikt om ES-achtige cellijnen die talrijke onderzoekstoepassingen en potentieel, waaruit blijkt dat haploïde cellen een waardevolle toekomstige locatie kunnen andere soorten gewervelde genetische studies 20,21 isoleren. Dit protocol geeft een demonstratie van de betrokken bij het uitvoeren van de productie van haploïde zebravis embryo's door in vitro fertilisatie met UV geïnactiveerd sperma methoden. Deze methode kan worden gebruikt om naar haploïde schermen voeren met gemutageniseerde F1 vis, die kunnen worden gemaakt met wildtype of mutante transgene stammen voor enhancer / suppressor screening.
Hoewel de screening tijd met behulp van een haploïde strategie is sterk verkort in vergelijking met diploïde screening, zal het toch een aantal maanden in beslag nemen. Zoals we descrieerder bed, zijn er vele voordelen die bestaan bij het uitvoeren van een scherm met een haploïde schema, die kunnen helpen bij het maken van nieuwe bijdragen aan de huidige kennis over een aantal ontwikkelingsprocessen. De methodologie haploïde scherm is efficiënter voor de identificatie van recessieve mutant allelen dan diploïde schermen op door de vermindering van de tijd, ruimte en het aantal vissen dat nodig is. Er zijn verschillende valkuilen een haploïde scherm. Een haploïde scherm kan alleen mutanten te identificeren in de genen dat binnen de eerste paar dagen van de ontwikkeling actief zijn, als het embryo alleen kunnen overleven voor een beperkte tijd met een haploïde genoom. Genen die later in de ontwikkeling tot expressie zou moeten worden geïdentificeerd door een andere methode, zoals een diploïde scherm. Ook moet je sommige organen niet goed ontwikkelen in een haploïde organisme. Er kunnen anatomische afwijkingen, of een vertraagde tijd van ontwikkeling, die kan de mutatie te missen door de haploïde screening techniek. Ikn Daarnaast hebben sommige stammen van vis niet zo goed ontwikkelen in een haploïde toestand 15. Haploiden kunnen worden gecategoriseerd door een indeling reeks van goede, intermediaire en slechte embryonale eigenschappen, met een embryo is de meest normale, B om embryo's aan te wijzen met defecten in de as, maar een duidelijke kop en staart, en C / D om embryo's aan te wijzen met onherkenbare eigenschappen (massa van cellen bovenop dooier ballen) 15,17. De verhoudingen van embryo's binnen deze categorieën verschilt per zebravis stam, met verhoogde aantallen van betere kwaliteit haploiden vaker in het bijzonder genetische achtergronden 15,17. Vanwege deze factoren is het noodzakelijk om een goede stam van zebravis zodat de mutagenese en daaropvolgende kruisen voeren. In onze recente ervaringen het wildtype Tübingen stam geproduceerd levensvatbare haploïden voor screening (zie figuren 3 en 4) hoewel historisch zebravis onderzoekers AB en AB * stammen gebruikt voor haploïde experimentatie 15.
Naast deze genoemde problemen zullen niet alle geprimede volwassen zebravissen vrouwtjes een koppeling dat hij op het uitvoeren knijpen techniek. Bijvoorbeeld, in samenwerking met ENU-gemutageniseerde stam Tübingen vrouwtjes, ongeveer de helft van alle vrouwen produceerde een koppeling op knijpen, en sommige van deze fractie (typisch 10-30%) waren slechte embryokwaliteit of niet konden worden bevrucht. Dus, om een haploïde scherm uit te voeren moet men van plan om minstens twee keer zoveel vis als nodig is om het gewenste aantal van genomen (elk vrouwtje vertegenwoordigt een genoom gescreend) screenen verhogen. Ongeacht deze overweging, de voordelen van de haploïde werkwijze voor het screenen van grote aantallen genomen bestrijken zonder massieve dierenverblijf zijn inderdaad zeer belangrijk wanneer het assay vatbaar is voor de haploïde toestand. Er moet echter worden opgemerkt dat de verdere studie van de mutatie (s) die in de haploïde koppeling is volledig afhankelijk succes verhogen van eenn outcross van de vrouwelijke oprichter. Zoals bij elk scherm, 'raakt' aanvankelijk geïdentificeerd tijdens de screening proces moet opnieuw worden vastgesteld in de diploïde staat.
Ondanks de valkuilen van het gebruik van de haploïde scherm is aangetoond zeer succesvol in het identificeren van mutanten die zijn grondig bestudeerd duidelijke voordelen aan de wetenschap 15 zijn. Haploid schermen kunnen worden toegepast om andere slecht begrepen processen van gewervelde ontwikkeling te onderzoeken. Met behulp haploiden voor versterker en suppressor schermen is een manier om meer inzicht in de activiteiten en regelgevende netwerk van een gen van belang te krijgen. De haploïde screening techniek kan ook worden gebruikt om versterkers en onderdrukkers van mutanten die al zijn geïsoleerd door methoden zoals chemische of insertiemutagenese of reverse genetics benaderingen zoals bewerken, dan wel Talens identificeren. Kortom, het voorheen geïsoleerde mutant worden gemutageniseerd met ENU en gescreend op enhancers of suppressors van de oorspronkelijke mutant fenotype. De mutant moet kunnen adulte bereiken, zodat het noodzakelijk is om een dier heterozygoot of homozygoot mutant zwakke vis dit scherm worden echter recente ontwikkelingen in transgenese heeft onderzoekers toegestaan om dit probleem te omzeilen. Leren hoe om trajecten te manipuleren in ontwikkeling kan leiden tot veel spannende mogelijkheden, waaronder het vooruitzicht van storende wegen naar ziekten te behandelen.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door financiering RAW uit de volgende: NIH subsidies K01 DK083512, DP2 OD008470 en R01 DK100237; March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar Award # 5-FY12-75; opstarten fondsen van de University of Notre Dame College of Science and Department of Biological Sciences; en een gulle gift aan de Universiteit van Notre Dame van Elizabeth en Michael Gallagher namens de Gallagher Family ter bevordering van stamcelonderzoek. De financiers hadden geen rol in de onderzoeksopzet, gegevensverzameling en-analyse, besluit tot publicatie, of voorbereiding van het manuscript. Wij danken de medewerkers van de afdeling Biologische Wetenschappen voor hun steun, en het Centrum voor Onderzoek zebravis in Notre Dame voor hun uitstekende inzet in de zorg en het welzijn van onze zebravis kolonie. Wij danken GF Gerlach voor het nemen van de foto's die in figuur 4. Slot danken wij alle leden van ons onderzoek lab voor hun opmerkingen, discussies en INSIGhts over dit werk.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Hank's Stock Solution #1 | 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #2 | 0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #4 | 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #5 | 1.23 g MgSO4-7H2O in 50 ml ddH2O | ||
| Hank's Premix | Combine in the following order: (1) 10.0 ml HS#1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solutions and Premix at 4 degrees Celcius. | ||
| Hank's Stock Solution #6 | 0.35 g NaHCO3 in 10.0 mls ddH2O; make fresh on day of use. | ||
| Hank's Final working solution | Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6 | ||
| XX-Series UV Bench lamp | UVP | 95-0042-05 | Model XX-15S Bench Lamp |
| XX Bench Stand (Adjustable) | UVP | 18-0062-01 | Model XX-15 Stand |
| Embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
| 50 X E3 | 250 mM NaCl, 8.5 mM KCL, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination. | ||
| 1 X E3 | Dilute 50 X E3 in distilled water | ||
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ645; SMZ1000 |
Riferimenti
- Haffter, P., Nüsslein-Volhard, C. Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish. Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
- Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
- Haffter, P., et al. The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 1-26 (1996).
- Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-43 (1996).
- Eisen, J. S. Zebrafish make a big splash. Cell. 87, 969-977 (1996).
- Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).
- Bradford, Y., et al. ZFIN: enhancements and updates to the zebrafish model organism database. Nucleic Acids Res. 39, (2011).
- Bowen, M. E., et al. Efficient mapping and cloning of mutations in zebrafish by low-coverage whole-genome sequencing. Genetica. 190, 1017-1024 (2012).
- Leshchiner, I., et al. Mutation mapping and identification by whole-genome sequencing. Genome Res. 22, 1541-1548 (2012).
- Obholzer, N., et al. Rapid positional cloning of zebrafish mutations by linkage and homozygosity mapping using whole-genome sequencing. Development. 139, 4280-4290 (2012).
- Voz, M. L., et al. Fast homozygosity mapping and identification of a zebrafish ENU-induced mutation by whole-genome sequencing. PLoS ONE. 7, (2012).
- Walker, C. Haploid screens and gamma ray mutagenesis. Meth Cell Biol. 60, 43-70 (1999).
- Steisinger, G., et al. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291, 293-296 (1981).
- Westerfield, M. Chapter 2, Embryo Production by in vitro fertilization.”. The Zebrafish Book 4th ed. , (2000).
- Walker, C., et al. Making gynogenetic diploid zebrafish by early pressure. (28), (2009).
- Westerfield, M. Chapter 10: Recipes.”. The Zebrafish Book 4th ed. , (2000).
- Yi, M., Hong, N., Hong, Y. Generation of medaka fish haploid embryonic stem cells. Science. 326, 430-433 (2009).
- Yi, M., Hong, N., Hong, Y. Derivation and characterization of haploid embryonic stem cell cultures in medaka fish. Nat Protoc. 5, 1418-1430 (2010).
- Layton, J. E. . Undertaking a successful gynogenetic haploid screen in zebrafish.” Zebrafish, Methods and Protocols. 1st ed. , (2009).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals form retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
