生产单倍体斑马鱼的胚胎通过<em>体外</em>施肥

单倍体胚的生产可以实现识别隐性突变在F2时产生单倍体从成熟的雌性斑马鱼是诱变的父母的后代（ 图1）获得的。这样可以节省时间和空间相对于传统二倍体屏幕，其中研究人员需要提高F2家庭的二倍体后代，然后评估感兴趣的表型（ 图1）。 在该协议中的主要步骤在上述步骤1-5中所述，通过体外受精获得单倍体斑马鱼胚胎图式为流程图（ 图2）。这些步骤需要准备的解决方案和女性的暴露在男性荷尔蒙在交配坦克（第1天）吸，其次是精子和卵子的采购和体外受精 （2日），终于育成了单倍体（3-5天） （ 图2）。当COMbined与遗传筛选，在斑马鱼的共同诱变过程包括斑马鱼雄性野生型的成人以前暴露于诱变剂（ 例如 ，像ENU化学诱变剂，尽管其它程序，例如基于逆转录病毒的诱变可以实现这也便利的染色体缺陷克隆），其次为繁殖与雌性野生型创建诱变子代。这类制剂需要几个月的工作（约6个月）的基础上需要后野生型的世代时间，进行诱变，和后面的后续诱变F1 15,17,22。 考虑在采用单倍体的屏幕再大点是斑马鱼品系的选择。对AB *（AB星级）菌株已成为众所周知的生产单倍体胚胎比其他菌株15更好的整体性能和健康。然而，在图宾根派生应变孕育在我们的实验室保守党，我们最近观察到，已成功启用屏幕的肾脏系统（G.格拉赫和R.格特，未发表）的发育异常胚胎的功能。成年斑马鱼图宾根株男性由一系列的三个ENU诱变处理，然后和野生型杂交图宾根的女性产生的F1代进行筛选。 F1的女性被挤压，得到鸡蛋和这些F2卵子受精，用紫外灭活的精子。相比于野生型图宾根的父母（ 图3A）自然交配获得二倍体离合器，在这些单倍体图宾根株离合器胚胎显示的单倍体状态较短，树干粗壮特性（ 图3B，C）。进一步，单倍体离合器通常包括用于显示一系列缺陷，其中我们观察到，以及（ 图3B，C）中，这是已知的菌株内变化，如下面进一步讨论15,17胚胎兄弟姐妹。 </p> 以前的研究已经建立了规范的分级系列，经过D对应等级A，进行分类的单倍体型缺陷15,17的范围内，另外单倍体也被提到的形容词好，中，差的质量的22方面。 A级单倍体，对应高品质的单倍体，是最正常的外观，用短而粗壮的身体，但总体表现出外观形态相似的二倍体15,17,22（以单倍体A级（标有比较二倍体的兄弟姐妹（四） A）兄弟姐妹， 图3B）。单倍体A级胚胎还制定适度的心包水肿，这是单倍体斑马鱼发育15,17,22（ 图3B）的典型特征。相较于A级单倍体，中间或所谓的B级单倍体胚（标记为B， 图3B，C）是通过进一步缩短或扭结/ TWIS的发展区别特德躯干，虽然头部和尾部的特征是清晰可辨15,17,22。最后，C级或质量差单倍体（也列在一些参考文献为C / D）15,17,22是非常有缺陷的，并在协会与卵黄球（标记为C， 图3C）显示细胞排列紊乱质量。甚至其中一脉相承，单倍体离合器在A，B和C表型的人会观察到的分布有所不同。例如，相对于从第二蒂宾根女，其离合器由众多C级单倍体后代，以及获得单倍体从一个女性的蒂宾根大学的单倍体离合器显示整体更好的发展，主要是A和B级单倍体后代（ 图3B）和B单倍体表型（ 图3C）。单倍体胚档次的同类菌株的变异已在AB和AB *应变鱼以前观察到的以及15。 尽管有这些铁道部phological差异，许多结构的器官进行比较正常的单倍体胚胎。尽管它们具有较短的身体躯干，发展像眼睛和心脏相对类似于野生型二倍体胚和细胞类型，如色素细胞（黑色素细胞和xanthophores）也可以评价15器官。此外，我们最近记录的鱼头，或肾胚胎，是1天受精后在野生型单倍体开发，类似于野生型二倍体。作为这方面的证据，鱼头肾细胞类型图案显示段的原型模式（ 图4）。另外，该改变鱼头发展，如解放突变，降低视黄酸产隐性突变的表型，显示了类似的模式在单倍体状态相比，二倍体状态（ 图4）23,24。这个观察是符合其他的衰退中它们以保存大量的突变，导致类似的表型在两个单倍体和二倍体状态，虽然这并不总是与所有突变的情况下，应牢记，如果评估这种类型的屏幕策略15。 许多组织和器官通常是不正常的单倍体。例如，单倍体显示在流通的缺陷，通常表现出的血池，这可能使他们的研究血管生成的某些方面能力的限制15。此外，已经注意到，单倍体可以有不规则耳发展，使得它们可以用于突变，防止耳泡形成完全被评估，但不适用于影响涉及这个结构15的形态发生微妙过程的突变。作为另一个例子，大脑形态异常的单倍体，从而单倍体筛选，以确定所需的大脑发育途径是有限的15。尽管有这些限制，我们一肾脏在发育单倍体状态（ 图4）nalysis加入这个机关的“遮”胚胎结构的列表。这一发现突出了一个单倍体屏幕的方法可以用来解剖肾祖图案的遗传成分，并增加了重点的情绪，巧妙屏幕的方法可以规避的单倍体胚胎个体发育的局限，发掘有价值的新突变模型来研究脊椎动物发育15。 图1原理图中的斑马鱼模型二倍体和单倍体屏幕策略。继亲代的诱变，F1代可提出并使用，也可以产生用于筛选的F3代的二倍体状态（左F2突变体的家庭）或直接屏幕编在一个单倍体的策略（右）。在一个单倍体的屏幕，性成熟的F1代雌性用于收集单倍体F2离合器进行基因分析。女性杂合子携带者被确定，如果大约一半的F2单倍体显示突变体的表型（红色胚胎）相比野生型单倍体的兄弟姐妹（黄色胚胎）。 图2。单倍体胚胎生产流程图。 体外受精产生单倍体胚胎的主要步骤是系统化的任务，第1天（粉红色框）进行准备精子的解决方案，并在第2天（橙盒进行总理成年雌性斑马鱼，任务）收集和紫外线灭活的精子，收集鸡蛋，受精蛋用紫外线灭活精子生成单倍体，然后重振女的母亲，和finallŸ任务在随后的日子里进行3-5（黄色框），当离合器培养至所需时间点（s）的观察和分析。 图3。二倍体和单倍体图宾根株斑马鱼胚胎的比较。 A）二倍体野生型胚胎是由自然产卵产生的，然后孵育，直到大约30 HPF，B，C）单倍体野生型胚胎体外受精从F1代雌性诱变用紫外线灭活的精子得到的离合器生产的，直到培养约30 HPF。单倍体展出了一系列的发育异常与二倍体野生型胚胎（黑色箭头，d来表示二倍体）进行比较。相对正常的单倍体有缩短，更多的股票的身体类似的评级制度一个A单倍体15（红色箭头，标记为A），而单 ​​倍体与严重畸形表现出严重截短体轴（紫色箭头，标记为B）对应于B级，最后C级（蓝色箭头，标记为C）的基础上出版说明15。所有的胚胎在2.5倍的放大倍率拍摄现场。 这包括在单倍体菌株蒂宾斑马鱼的鱼头胚胎肾器官的细胞类型的图4。发育构图。单倍体野生型显示细胞类型的正常模式中的胚胎肾结构（顶行）。胚胎肾由一对被称为肾分段功能单元组成。存在于肾单位的离散细胞类型的分割图案可以基于整个山被可视化<e米>在基因转录所特有的分化肾细胞类型，其中包括标记的wt1b和肾病蛋白的足细胞（P）的原位杂交表达模式，该近曲小管（PCT）的标记slc20a1a，近端小管直（PST ）标记TRPM7，远侧早期（DE）标记SLC12A1和远端肾小管晚（DL）的标记SLC12A3。解放单倍体突变体胚胎（底行）显示减少足细胞，PCT和一个缺席PST，以及一个扩展DE和DL段，类似于二倍体胚胎库 18。胚胎被拍到在背视图，与前左侧，在10倍的放大倍率。