إنتاج فرداني الزرد الأجنة عن طريق<em> في المختبر</em> التسميد
Summary
The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.
Abstract
أصبحت نموذجا الزرد الفقاريات الرئيسية التي هي ذات الصلة لكثير من التخصصات لدراسة علمية. الزرد هي مناسبة بشكل جيد خاصة للتحليل الجيني إلى الأمام من العمليات التنموية بسبب التسميد الخارجية، حجم الجنينية، تطور الجنين السريع، والوضوح البصري – كوكبة من الصفات التي تمكن الملاحظة المباشرة للأحداث بدءا من تكون المعيدة لتوالد الأعضاء مع stereomicroscope الأساسية. علاوة على ذلك، يمكن أن الأجنة الزرد البقاء على قيد الحياة لعدة أيام في ولاية فرداني. إنتاج أجنة في المختبر فرداني هو أداة قوية لتحليل طفرية، لأنها تتيح تحديد الأليلات الطافرة متنحية موجودة في الجيل الأول (F1) ناقلات الإناث التالية الطفرات في الأبوية (P) جيل. هذا النهج يلغي ضرورة تنشئة أجيال متعددة (F2، F3، الخ) التي تنطوي على تربية أسرة متحولة، وبالتالي توفير الوقت الباحث جنبا إلى جنب مع الحداحتياجات مساحة مستعمرة الزرد، والعمل، وتكاليف تربية. على الرغم من الزرد وقد استخدمت لإجراء شاشات على مدى العقود العديدة الماضية قدما، كان هناك توسع مستمر من المعدلة وراثيا والجينوم أدوات التحرير. هذه الأدوات نقدم الآن مجموعة كبيرة من الطرق لإنشاء المقايسات دقة لشاشات الجيل القادم والتي يمكن استخدامها لمزيد من تشريح الشبكات التنظيمية الجينات التي تدفع الفقاريات تطور الجنين. هنا، نحن تصف كيفية إعداد الأجنة الزرد فرداني. ويمكن تنفيذ هذا البروتوكول للشاشات فرداني المستقبل الرواية، كما هو الحال في شاشات محسن والقامع، لمعالجة آليات التنمية لعدد واسع من العمليات والأنسجة التي تشكل خلال المراحل الجنينية المبكرة.
Introduction
العمليات الأساسية التي تنسق تطوير الفقاريات يتم حفظها على نطاق واسع 1. وهناك طريقة فعالة لتحديد الجينات مع أدوار أساسية في التنمية هو عزل الطفرات الوراثية التي تؤدي إلى العيوب المظهرية في عملية الفائدة. الزرد، دانيو rerio، هو نوع مكتملة العظام المياه العذبة صغيرة تعود لعائلة Cyprinidae الأسماك التي أصبحت كائن نموذج المستخدمة على نطاق واسع لعلم الوراثة التنموية الفقاريات على مدى العقود العديدة الماضية 2. يتم إخصابها البيض الزرد خارجيا، والسماح بالوصول إلى البيضة الملقحة من بداية الإخصاب 3. علاوة على ذلك، الجنين في وقت مبكر شفافة بصريا، وتمكين التصور التنمية مع stereomicroscope بسيطة 3. تطور الجنين الزرد سريعا، مع عمليات انشقاق، تكون المعيدة، وتوالد العديد من الهياكل، مثل القلب والكلى، أنجزت إلى حد كبير على مدى اليوم الأول للتنمية 3. Tانه الوقت من مراحل اليرقات إلى مرحلة النضج الجنسي يأخذ 2-3 أشهر، والبالغين هي الفقاريات الصغيرة حوالي 3-4 سم في الطول، والكثير من الأسماك يمكن الحفاظ على الحد الأدنى من الفضاء في 2. بالإضافة إلى ذلك، الزرد الكبار لديهم خصوبة عالية، مع كل الأسماك قادرة على إنتاج عدة مئات من الأجنة في الأسبوع 2. جعلت هذه الصفات لمعرفة منشأ من الزرد لالأمام وعكس شاشات الوراثية. الزرد حاصلا على درجة عالية من الحفظ في التشريح، وبيولوجيا الخلايا، وعلم وظائف الأعضاء مع أكثر الأنواع الفقارية متقدمة مثل الثدييات 2،4. في الواقع، أظهرت تحليل تسلسل الجينوم الأخيرة التي الزرد يحتوي homologs إلى ما يقرب من 70٪ من الجينات البشرية 5. وقد مكن هذا الحفظ الباحثين لاستخدام الزرد كنموذج للعديد من الأمراض التي تصيب الإنسان، بما في ذلك الظروف الجنينية والكبار 2،4. مجتمعة، جعلت هذه العوامل الزرد نظام ممتاز للشاشات تهدف إلى تحديد الجينات التي هيضروري لتطور الجنين الطبيعي الفقاريات.
تم تنفيذ عدد من الشاشات على نطاق واسع في الزرد وحددت عدة آلاف من الطفرات في الجينات التنموية 6-8. في الذكور البالغين الزرد هو قابل للالطفرات، ويمكن أن تتولد التعديلات الكروموسومات مع ارتفاع وتيرة نسبيا باستخدام ethylnitrosourea المغير الكيميائية (ENU) 6،7 أو فيروسات الطفرات إقحامي 9. حتى الآن، تم إنشاء أكثر من 9،000 طفرات وراثية، وتشمل الجينات التي تؤثر على كافة جوانب التطور الجنيني. وقد أنشأت المجتمع الزرد بنك مركزي من هذه المسوخ في مركز الزرد الدولية الموارد (أو ZIRC) 10، والتي جمعت ما يقرب من 5،000 الأليلات الطافرة والمعدلة وراثيا من مختلف أنحاء العالم. وقد تم تحليل العديد من هذه الطفرات والمستنسخة، وإعطاء الباحثين في مختلف التخصصات البيولوجية المعلومات القيمة التي استخدمت لندف بصرف النظر أستاذ دائملنا مسارات الخلوية والفسيولوجية من خلال رؤى الناشئة مع التجارب الزرد.
على الرغم من أن حددت شاشات قدما عددا كبيرا من الجينات الهامة، والكثير لم يتم حتى الآن تقدير عن الشبكات التنظيمية الوراثية التي تتوسط عدد لا يحصى من العمليات. لم تصل العديد من الشاشات التي بذلت حتى الآن التشبع، وبالتالي إلى الأمام وكذلك شاشات الوراثية العكسية ظلت حجر الزاوية لتحديد آليات التطور الجنيني وتحليلها. في حين أن هناك رؤى الهائلة التي يمكن استخلاصها من أي خط متحولة الزرد واحدة، كان عاملا رئيسيا يحد في مجال تاريخيا الجهد تستغرق وقتا طويلا تشارك في الاستنساخ الموضعية. لهذا السبب، ظلت هوية العديد من الطفرات المستحثة كيميائيا لغزا. ومع ذلك، مع ظهور الأخيرة من نهج تسلسل الجينوم التي تسهل الاستنساخ السريع 11-14، وتحديد كفاءة لا يصدق من الطفرات الوراثية هو الآن الحديدasible.
الشاشة إلى الأمام تنميط في الزرد هو شاشة مضاعفا التي يمكن تحديد الطفرات المتنحية في غضون ثلاثة أجيال 6،7 (الشكل 1، يسار العمود). ينطوي هذا الأسلوب الطفرات في توليد الخلايا الجرثومية من الوالدين (P) من الذكور، ومن ثم التزاوج هذه الذكور مع الإناث نوع البرية. كل من الجيل الأول (F1) ذرية من هذا التزاوج سوف تؤوي احد أو أكثر من الطفرات فريدة من نوعها نظرا لمساهمات الكروموسومات من الجينوم الأب تحور. تثار ذرية F1 وoutcrossed مع أنواع البرية لخلق أسر F2. في الأسرة F2، سوف يكون إما الأشقاء النوع البري أو متخالف ناقلات، وincrossed عشوائيا لتوليد براثن F3 التي يتم تحليلها لالنمط الظاهري (ق) من الفائدة. سوف براثن F3 ناقلات متخالف تحتوي على 25٪ النوع البري، و 50٪ متخالف، و 25٪ الأسماك متحولة متماثلة اللواقح. هذا المخطط الفرز متعددة الأجيال فعالة، ولكن العيب الرئيسي لهذا واحديتضمن pproach الوقت اللازم للتحضير للشاشة: تشارك على الأقل 1 سنة من تربية الأسماك وحدها، لأن كل جيل يتطلب حوالي 3 أشهر لتصل إلى مرحلة النضج الجنسي. قيود أخرى من هذا النوع من الشاشة مضاعفا هي العمل، والفضاء، وتكلفة السكن هذه الأجيال.
الشاشة هي واحدة فرداني البديلة التي يمكن استخدامها لتحديد وعزل الطفرات المتنحية في وقت لاحق باستخدام استراتيجيات مماثلة الطفرات 15 (الشكل 1، العمود الأيمن). وقد وصفت إنتاج الأجنة الزرد فرداني الأولى أكثر من 30 عاما منذ 16 عاما، ولقد تم الاستفادة من قدرة الزرد عادة مضاعفا لتطوير لعدة أيام مع الصيغة الصبغية الكروموسومات فرداني للعديد من الدراسات الجينية منذ هذا الوقت. والفائدة الرئيسية من الشاشة فرداني هو أن هذا الأسلوب لا ينطوي على جمع العائلات F2 من أجل كشف عن الأليلات المتنحية متحولة. بدلا من ذلك، يتم تقييم إناث الجيل F1 للمن الطفرات المتنحية تغاير الزيجوت في عملية الفائدة من خلال دراسة أبنائهم F2 في حالة فرداني (الشكل 1، العمود الأيمن). وعموما، فإن الخطوات لشراء أجنة فرداني هي واضحة نسبيا (الشكل 2). بعد إعداد الحلول اللازمة لمعالجة الحيوانات المنوية، ويتم الحصول على البيض من الإناث الجيل F1 من خلال التلاعب دليل وذلك لقذف (أو "الضغط") البيض من البطن. مرة واحدة يتم الحصول على البيض، وأنها المخصبة في المختبر عن طريق التعرض للأشعة فوق البنفسجية (UV) المعطل الحيوانات المنوية. الحيوانات المنوية المعطل الأشعة فوق البنفسجية غير قادرين على المساهمة الحمض النووي قابلة للحياة إلى البيض يرجع ذلك إلى حقيقة أن الطول الموجي للأشعة فوق البنفسجية قصيرة crosslinks الحمض النووي الأب. ومع ذلك، فإن الحيوانات المنوية لا تزال قادرة على تحريك النشاط البيض والأحداث المرتبطة بالتنمية لاقحي. عند تنشيط التمثيل الغذائي، فإن البيض استكمال الانقسام الاختزالي الثاني، والمضي قدما لتطوير فقط مع نسخة واحدة تودع أمهات كل chromosoلي. بسبب هذا 1N الصيغة الصبغية، الجنين يخضع لعواقب التنموية للأليل متحولة المتنحية، إذا كان موجودا على كروموسوم الأمهات. وبالتالي كل مخلب فرداني F2 سوف تحتوي على 50٪ و 50٪ wildtype الأجنة متحولة إذا كانت الأم هي الناقل متخالف من أليل المتنحية توغل بالكامل. هذا التوزيع من المورثات الجنينية يمكن بسهولة نسبية من حيث تقييم مخلب لوجود النمط الظاهري متحولة (ق) من الفائدة. إذا تم الكشف عن مثل هذا النمط الظاهري، وoutcrossed مؤسس الجيل F1 الإناث فيما بعد إلى نوع البرية الزرد الذكور لخلق وجمع المزيد من حاملات متخالف. لأنه ليس من الضروري تنشئة أجيال متعددة لأداء الشاشة، يمكن للباحث انقاذ وقتا طويلا، والعمل، ومساحة الحوض، ولكن لا يزال لديه القدرة على مسح عدد كبير من الجينوم على أساس عدد من الإناث F1 فحصها. وبالتالي، شاشات فرداني مجدية خاصة بالنسبة للمختبرات الصغيرة أو المشاريع التي بدأت في absenc(ه) من تمويل كبير.
ومع ذلك، هناك العديد من القيود والعوائق لاستخدام النباتات الاحاديه. أول والأجنة الزرد فرداني يعيش لعدة أيام فقط، ويموت عادة بين 3 و 5 أيام بعد الإخصاب (DPF) 15. الأجنة الزرد فرداني يمكن تمييزها عن diploids يعتمد على عدة خصائص، أهمها كونه الجسم القصير وممتلئ الجسم الذي لديه مع ذلك العدد المعتاد من قطاعات الجسيدة 15،17. كما تقدم التنمية، وزيادة المعروضات موت الخلايا في الدماغ والدورة الدموية والفقراء، وعادة ما يرتبط بها مع تجميع الدم بنسبة 2-3 DPF وذمة 15،17. علاوة على ذلك، تفشل النباتات الاحاديه لتضخيم 15،17 السباحة المثانة. بغض النظر عن هذه الاختلافات المورفولوجية، تتشكل معظم الأعضاء والأنسجة الرئيسية، بما في ذلك القلب، والعين، والحبل الظهري 15،17. وأشار ميزة واحدة عن براثن فرداني هو أنها تحتوي على مجموعة من الظواهر من حيث أصناف من الأجنة المعيبة & #8212؛ لاحظ ميزة عبر سلالات الزرد. وبالتالي، ينبغي للمرء أن تحقق إذا كانت الأنسجة (ق) ونقطة زمنية من الفائدة تظهر التطور الطبيعي معقول في نوع السلالة البرية فرداني، وبالتالي لديها القدرة على أن تقيم لعيوب وراثية في الشاشة أو المشروع البحثي الأخرى.
على الرغم من هذه التحديات، تم تنفيذها شاشات فرداني بنجاح لتحديد الجينات الضرورية لعمليات التنمية في وقت مبكر من الزرد، وتم البروتوكولات فرداني راسخة الموارد في المجتمع لعدة سنوات 15-19. في الآونة الأخيرة، وقد استخدمت عملية توليد أجنة الأسماك فرداني من قبل الباحثين لخلق فرداني الجذعية الجنينية (ES) الثقافات الخلية من الأسماك الميداكا 20،21. بعد إنتاج أجنة في المختبر الميداكا فرداني، استخدمت أجنة لاستخلاص الثقافات الخلية الأولية التي تم passaged لمدة 15 أسابيع تليها 5-8 أسابيع أخرى لتوليد الحيوانات المستنسخة نقية من خلايا فرداني معخصائص الخلية ES 15-19. الجيل الأسماك فرداني خطوط الخلايا ES يبشر بالخير في المستقبل واسعة لتحليل الظواهر المتنحية في الأنساب الخلية الفقاريات، ويمثل نهجا جديدا للتحليل الجيني في السنوات المقبلة. وبالتالي، وتوليد أجنة الأسماك فرداني وقد تزايد الطلبات في المجتمع البحوث الطبية الحيوية. توفر هذه المقالة الفيديو مظاهرة البصرية من الخطوات المتبعة مع إنتاج الأجنة الزرد فرداني في المختبر باستخدام الحيوانات المنوية المعطل للأشعة فوق البنفسجية بناء على البروتوكولات المعمول 15-19،22.
Protocol
Representative Results
Discussion
فحص فرداني هو تقنية مفيدة لاكتشاف الجينات الأساسية اللازمة لمراحل النمو المبكرة. علاوة على ذلك، تم استخدام زراعة الخلايا فرداني من الأسماك الميداكا لعزل خطوط الخلايا ES-مثل التي لديها العديد من التطبيقات البحثية والإمكانات، مما يدل على أن الخلايا فرداني قد توفر مكانا قيما المستقبل لأنواع أخرى من الفقاريات الدراسات الجينية 20،21. يوفر هذا البروتوكول مظاهرة من أساليب المشاركة مع أداء إنتاج الأجنة الزرد فرداني من خلال التخصيب في المختبر مع الأشعة فوق البنفسجية المعطل الحيوانات المنوية. هذه المنهجية يمكن استخدامها لأداء شاشات فرداني قدما الأسماك F1 mutagenized، والتي يمكن إجراؤها باستخدام نوع البرية، المعدلة وراثيا أو سلالات متحولة للفحص محسن / القامع.
على الرغم من أن الوقت الفحص باستخدام استراتيجية فرداني هو تقصير كبير بالمقارنة مع الفحص مضاعفا، وسوف يستغرق عدة أشهر ومع ذلك لإكمال. ونحن descriسرير سابقا، هناك العديد من الفوائد التي توجد عن طريق إجراء الشاشة باستخدام مخطط فرداني، والتي يمكن أن تساعد في تقديم مساهمات الرواية إلى المعرفة الحالية حول أي عدد من الأحداث التنموية. منهجية الشاشة فرداني هو أكثر كفاءة لتحديد الأليلات المتنحية متحولة من شاشات مقرها مضاعفا، ويرجع ذلك إلى الحد من الوقت، والفضاء، وعدد من الأسماك التي يحتاجها. ومع ذلك، هناك العديد من المزالق إلى شاشة فرداني. ويمكن للشاشة فرداني فقط تحديد طفرات في الجينات التي تنشط خلال الأيام القليلة الأولى من التنمية، حيث أن الجنين يمكن البقاء على قيد الحياة فقط لفترة محدودة مع الجينوم فرداني. أن الجينات التي يتم التعبير عنها في وقت لاحق في التنمية لا بد من تحديد بطريقة مختلفة، مثل شاشة مضاعفا. أيضا، بعض الأجهزة لا تتطور بشكل صحيح في كائن فرداني. قد يكون هناك تشوهات التشريحية، أو الوقت تأخر التنمية، والتي قد تسبب الطفرة ينبغي تفويتها بواسطة تقنية الفحص فرداني. أنان بالإضافة إلى ذلك، بعض سلالات من الأسماك لا تتطور وكذلك في حالة فرداني 15. النباتات الاحاديه يمكن تصنيفها من خلال سلسلة من الميزات الجنينية الدرجات الجيدة والمتوسطة والفقراء، مع والأجنة هي الأكثر طبيعية، B تعيين الأجنة بعيوب في المحور ولكن رئيس واضحة والذيل، وC / D لتعيين الأجنة مع التعرف الميزات (جماهير خلايا كرات فوق صفار) 15،17. نسب الأجنة داخل هذه الفئات تختلف من سلالة الزرد، مع زيادة أعداد النباتات الاحاديه أفضل نوعية أكثر انتشارا على وجه الخصوص الخلفيات الوراثية 15،17. نظرا لهذه العوامل، فمن الضروري إيجاد سلالة مناسبة من الزرد لأداء الطفرات والصلبان اللاحقة. في تجربتنا الأخيرة، أنتجت نوع البرية توبنغن سلالة النباتات الاحاديه قابلة للفحص (كما هو موضح في الشكلين 3 و 4) على الرغم من الباحثين الزرد تاريخيا استخدمت AB أو AB * سلالات لexperim فردانيentation 15.
بالإضافة إلى هذه التحديات المذكورة آنفا، لن جميع الإناث الزرد الكبار معبي إنتاج القابض على أداء تقنية الضغط. على سبيل المثال، في العمل مع ENU mutagenized-توبنغن إناث السلالة، ما يقرب من نصف جميع الإناث أنتجت القابض على الضغط، وكانت بعض جزء من هذه (عادة 10-30٪) وسوء نوعية الجنين أو تعذر المخصبة. وبالتالي، لأداء شاشة فرداني لا بد من خطة لرفع مرتين على الأقل العديد من الأسماك حسب الحاجة لفحص العدد المطلوب من الجينوم (تمثل كل أنثى فحص الجينوم واحد). بغض النظر عن هذا الاعتبار، فإن فوائد أسلوب فرداني الفرز لتغطية أعداد كبيرة من الجينوم دون مرفق الحيوانية الضخمة هي في الواقع كبيرة جدا إذا كان الاختبار هو قابلة للدولة فرداني. ومع ذلك، فإنه تجدر الإشارة أيضا إلى أن دراسة أخرى من الطفرة (ق) التي تم تحديدها في مخلب فرداني وتعتمد بشكل كامل على رفع بنجاحن هجين الأباعد من مؤسس الإناث. كما هو الحال مع أي شاشة، 'يضرب' حددت في البداية أثناء عملية الفرز يجب أن يعاد تحديدها في الدولة مضاعفا.
على الرغم من مطبات باستخدام شاشة فرداني، وقد أظهرت لها أن تكون ناجحة جدا في تحديد المسوخ، والتي تم تحليلها في العمق مع المكاسب الثاقبة إلى الميدان العلمي 15. يمكن تنفيذها شاشات فرداني للتحقيق في عمليات أخرى غير مفهومة التنمية الفقاريات. باستخدام النباتات الاحاديه للشاشات محسن والقامع هو أحد السبل لكسب مزيد من التبصر في الأنشطة والشبكة التنظيمية من الجينات في المصالح. ويمكن أيضا أن تستخدم تقنية فحص فرداني لتحديد القدرة والمكثفات من المسوخ التي تم عزلها بواسطة طرق مثل الطفرات الكيميائية أو إقحامي أو الوراثة عكس النهج مثل الحراثة أو TALENs. وباختصار، يمكن mutagenized متحولة معزولة سابقا مع ENU وفرزهم للمحسنات أو لياليuppressors من النمط الظاهري متحولة الأصلي. يجب أن تكون متحولة قادرة على الوصول إلى مراحل الكبار، ولذلك فمن الضروري أن يكون هناك حيوان أو متخالف ضعف الأسماك متحولة متماثلة اللواقح لأداء هذه الشاشة، ومع ذلك سمحت التطورات الحديثة في نقل الجينات الباحثين للالتفاف على هذه المشكلة. يمكن تعلم كيفية التعامل مع مسارات في التنمية يؤدي إلى الكثير من الاحتمالات المثيرة بما في ذلك احتمال مسارات إقلاق لعلاج الحالات المرضية.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من خلال تمويل لRAW مما يلي: منح المعاهد الوطنية للصحة K01 DK083512، DP2 OD008470، وR01 DK100237؛ مسيرة الدايمات جائزة باسل أوكونور الباحث كاتب # 5 FY12-75؛ بدء الأموال من جامعة نوتردام كلية العلوم وقسم العلوم البيولوجية؛ وهدية سخية للجامعة نوتردام من إليزابيث ومايكل غالاغر نيابة عن غالاغر الأسرة لتعزيز أبحاث الخلايا الجذعية. كان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر أو إعداد المخطوطة. نشكر الموظفين من قسم العلوم البيولوجية لدعمهم، ومركز للبحوث اسماك الزرد في نوتردام لتفانيهم المتميز في رعاية ورفاه لدينا مستعمرة الزرد. نشكر GF غيرلاخ لأخذ الصور المقدمة في الشكل 4. وأخيرا، نشكر جميع أعضاء مختبر أبحاثنا على تعليقاتهم والمناقشات وinsigHTS عن هذا العمل.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Hank's Stock Solution #1 | 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #2 | 0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #4 | 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #5 | 1.23 g MgSO4-7H2O in 50 ml ddH2O | ||
| Hank's Premix | Combine in the following order: (1) 10.0 ml HS#1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solutions and Premix at 4 degrees Celcius. | ||
| Hank's Stock Solution #6 | 0.35 g NaHCO3 in 10.0 mls ddH2O; make fresh on day of use. | ||
| Hank's Final working solution | Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6 | ||
| XX-Series UV Bench lamp | UVP | 95-0042-05 | Model XX-15S Bench Lamp |
| XX Bench Stand (Adjustable) | UVP | 18-0062-01 | Model XX-15 Stand |
| Embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
| 50 X E3 | 250 mM NaCl, 8.5 mM KCL, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination. | ||
| 1 X E3 | Dilute 50 X E3 in distilled water | ||
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ645; SMZ1000 |
Riferimenti
- Haffter, P., Nüsslein-Volhard, C. Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish. Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
- Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
- Haffter, P., et al. The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 1-26 (1996).
- Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-43 (1996).
- Eisen, J. S. Zebrafish make a big splash. Cell. 87, 969-977 (1996).
- Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).
- Bradford, Y., et al. ZFIN: enhancements and updates to the zebrafish model organism database. Nucleic Acids Res. 39, (2011).
- Bowen, M. E., et al. Efficient mapping and cloning of mutations in zebrafish by low-coverage whole-genome sequencing. Genetica. 190, 1017-1024 (2012).
- Leshchiner, I., et al. Mutation mapping and identification by whole-genome sequencing. Genome Res. 22, 1541-1548 (2012).
- Obholzer, N., et al. Rapid positional cloning of zebrafish mutations by linkage and homozygosity mapping using whole-genome sequencing. Development. 139, 4280-4290 (2012).
- Voz, M. L., et al. Fast homozygosity mapping and identification of a zebrafish ENU-induced mutation by whole-genome sequencing. PLoS ONE. 7, (2012).
- Walker, C. Haploid screens and gamma ray mutagenesis. Meth Cell Biol. 60, 43-70 (1999).
- Steisinger, G., et al. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291, 293-296 (1981).
- Westerfield, M. Chapter 2, Embryo Production by in vitro fertilization.”. The Zebrafish Book 4th ed. , (2000).
- Walker, C., et al. Making gynogenetic diploid zebrafish by early pressure. (28), (2009).
- Westerfield, M. Chapter 10: Recipes.”. The Zebrafish Book 4th ed. , (2000).
- Yi, M., Hong, N., Hong, Y. Generation of medaka fish haploid embryonic stem cells. Science. 326, 430-433 (2009).
- Yi, M., Hong, N., Hong, Y. Derivation and characterization of haploid embryonic stem cell cultures in medaka fish. Nat Protoc. 5, 1418-1430 (2010).
- Layton, J. E. . Undertaking a successful gynogenetic haploid screen in zebrafish.” Zebrafish, Methods and Protocols. 1st ed. , (2009).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals form retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
