A detecção in situ de células T CD4 autoreactive em Cérebro e Coração Usando principal de histocompatibilidade Dextramers classe II
Summary
O protocolo para detectar células auto-reactivas T CD4 no cérebro e no coração por coloração direta com complexo de histocompatibilidade principal dextramers classe II foi descrito neste relatório. Para análise detalhada, um método confiável para enumerar as freqüências de células T CD4 + antígeno-específicas in situ também é concebido.
Abstract
This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-α (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler’s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the ‘Z’ serial images.
Introduction
O uso do complexo principal de histocompatibilidade tetrâmeros (MHC) de classe II, para a detecção de células específicas para o antigénio T CD4 tem sido um desafio 1-7. Para aumentar a sensibilidade de detecção de tetrâmeros de MHC de classe II, a equipe de pesquisa criou tetrâmeros de próxima geração, designadas "dextramers" 8. Dextramers conter esqueletos de dextrano na qual várias unidades químicas da estreptavidina-fluoróforo são conjugados, de tal modo que vários monómeros, de péptidos biotinilados de MHC-tethered pode ser ligado a uma molécula de dextrano 9. Assim, grandes agregados de dextramers MHC que contêm vários complexos MHC-péptido podem interagir com múltiplos receptores de células T (TCRs).
Este grupo recentemente gerado dextramers para vários auto-antigénios e demonstrado que a sensibilidade de detecção de dextramers foi aproximadamente cinco vezes mais do que 8 tetrâmeros. Os sistemas experimentais incluem encefalomielite auto-imune experimental (EAE) induzida com proteína proteolipidica (PLP) em murganhos SJL 139-151; EAE induzida com glicoproteína de mielina oligodendrócitos (MOG) 35-55 em camundongos C57BL / 6; e miocardite auto-imune experimental (EAM) induzida com miosina cardíaca pesada cadeia-α (MyHC) 334-352 em camundongos A / J. Este estudo demonstra a utilização de PLP 139-151 – e MyHC 334-352 dextramers para detectar células específicas para o antigénio T CD4 in situ com especificidade pelo desenvolvimento de um protocolo de coloração directa, eliminando assim a necessidade de amplificar os sinais de utilizar anticorpos fluoróforo, uma aproximar comumente empregado com o uso de tetrâmeros. Além disso, um método global de avaliar tecidos também foi concebida de forma fiável para enumerar as frequências de células T CD4 + específicas para o antigénio in situ 10. Detecção de células T específicas para o antigénio in situ permite a delineação dos eventos causados por estímulos antigénicos específicos de as causadas pela activação do espectador. De igual modo, a técnica em si tu também provides oportunidades de acompanhar a cinética de infiltração de células T específicas de antigénios nos órgãos-alvo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ao contrário I tetrâmeros de MHC de classe, o uso de tetrâmeros de MHC de classe II para aplicações de rotina continua a ser um desafio, especialmente para enumerar as freqüências precursoras de células CD4 T auto-reativas de baixa afinidade, em parte devido à sua dependência de ativação 6,15-17. Recentemente, este problema foi contornado pela criação da nova geração de tetrâmeros, chamado "dextramers", permitindo-nos para as células específicas para o antigénio T CD4 para um con…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela American Heart Association e Fundação Cardiomiopatia das Crianças (SDG2462390204001) e os Institutos Nacionais de Saúde (HL114669). CM é um receptor de um pós-doutorado concessão bolsa de pesquisa concedido pela Fundação Miocardite, NJ.
Materials
| CFA | Sigma Aldrich, St Louis, MO | 5881 | Store at 4οC |
| MTB H37Rv extract | Difco Laboratories, Detroit, MI | 231141 | Store at 4οC |
| PT | List Biologicals Laboratories, Campbell, CA | 181 | Store at 4οC |
| 1x PBS | Corning, Manassas, VA | 21-040-CV | Store at 4οC |
| Female A/J mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME | 646 | |
| Female SJL/J mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME | 686 | |
| Leur-lok sterile 1 ml syrringe | BD, Franklin Lakes, NJ | 309628 | |
| Leur-lok sterile 3 ml syrringe | BD, Franklin Lakes, NJ | 309657 | |
| Sterile needle, 18 G | BD, Franklin Lakes, NJ | 305195 | |
| Sterile needle, 27 1/2 G | BD, Franklin Lakes, NJ | 305109 | |
| 3-way stopcock | Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH | MX5311L | |
| Kerlix gauze bandage rolls | Covidien, Mansfield, MA | 6720 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 34155 | |
| Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade | Promega corporation, Madison, WI | V2111 | |
| Immunopure normal goat serum | Thermo Scientific, Waltham, MA | 31873 | Store at -20 οC |
| Anti-mouse CD4 conjugated with PE dye | eBioscience, San Diego, CA | 12004185 | Store at 4οC |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 19202 | Store at 4οC |
| Faramount Aqueous Mounting Medium | Dako, Carpinteria, CA | 10073021 | |
| Conical tube (15ml) | BD Biosciences, San Jose, CA | 352099 | |
| Conical tube (50 ml) | BD Biosciences, San Jose, CA | 352070 | |
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | BD Biosciences, San Jose, CA | 356775 | |
| Water color #2 brushes | Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY | 73502 | |
| Plain Microscope slides, size: 3" x 1" x 1.2 mm | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 1255010 | |
| Premium Cover glass, 22 x 22-1 | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12548B | |
| Disposable deep base mold histology cassettes | Laboratory prodcust, Rochester, NY | M-475-10 | |
| Loctite Super glue | Henkel Corporation, Westlake, OH | 1471879 | |
| Razor blades | Gillette SuperSilver | ||
| Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK) | Neopeptide, Cambridge, MA | Store at 4οC | |
| PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF) | Neopeptide, Cambridge, MA | Store at 4οC | |
| MHC class II/IAs PLP 139-151 or TMEV 70-86 dextramers conjugated with APC dye | Store at 4οC | ||
| MHC class II/IAk Myhc 334-352 or or RNase 40-56 dextramers conjugated with APC dye | Store at 4οC | ||
| Dextran conjugated SA-APC | Immundex, Copenhagen, Demark | Store at 4οC | |
| Sterile surgical scissors and forceps | INOX tool Corporation | ||
| Micro oven | GE Healthcare, Pittsuburgh, PA | ||
| Leica VT 1200 Vibratome | Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL | ||
| Olympus BX 60 Laser scanning confocal microscope | Olympus America, Inc. Center Valley, PA | ||
| Nikon A1-Eclipse 90i confocal microscope | Nikon Inc. Melville, NY |
Riferimenti
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