מvoxels לידע: מדריך מעשי לפילוח אלקטרונים מורכבים מיקרוסקופית 3D-Data
Summary
צוואר הבקבוק במיקרוסקופ האלקטרונים 3D סלולארי הוא הבלטת תכונות (פילוח) במפות צפיפות 3D המורכבות ביותר. פיתחנו סדרה של קריטריונים, אשר מספקת הנחיות באשר אשר גישת פילוח (ידנית, חצי אוטומטי, או אוטומטי) היא מתאים ביותר עבור סוגי נתונים שונים, ובכך לספק נקודה מוצא לפילוח יעיל.
Abstract
גישות במיקרוסקופ אלקטרונים 3D מודרניות לאחרונה אפשרו תובנה חסרת תקדים לתוך ארגון ultrastructural 3D של תאים ורקמות, המאפשרות ההדמיה של מכונות macromolecular גדולות, כגון מתחמי הידבקות, כמו גם מבנים מסדר גבוה, כגון שלד התא ואברונים תאיים בהם תא המתאים והקשר רקמה. לאור המורכבות האינהרנטית של כרכים סלולריים, זה חיוני כדי לחלץ תחילה את התכונות של עניין, על מנת לאפשר להדמיה, כימות, ולכן הבנה של הארגון שלהם 3D. כל קבוצת נתונים מוגדרת על ידי מאפיינים ברורים, לדוגמא, יחס, אות לרעש פריכות (חדות) של נתונים, ההטרוגניות של התכונות שלו, צפיפות של תכונות, נוכחות או עדר של צורות אופייניות המאפשרות זיהוי קל, ואחוז של כל הנפח שאזור ספציפי של עניין תופס. כל המאפיינים האלה צריכים להילקח בחשבוןכאשר מחליט על שמתקרב לקחת לפילוח.
שש ערכות נתונים ultrastructural השונות 3D שהוצגו התקבלו על ידי שלוש הדמיה שונה גישות: טומוגרפיה של אלקטרון צבעוני משובצת שרף, התמקדה יון beam- ומיקרוסקופיה בלוק סדרתי סריקת פרצוף אלקטרון (FIB-SEM, SBF-SEM) של דגימות המעטה מוכתמות ומוכתמות בכבדות , בהתאמה. עבור ערכות נתונים אלה, ארבע גישות פילוח שונות יושמו: (1) בניית מודל מלא הוראות ואחרי אך ורק על ידי הדמיה של המודל, (2) פילוח מעקב הידני של נתונים ואחריו משטח טיוח, (3) גישות אוטומטיות למחצה ואחרי על ידי עיבוד פני השטח, או אלגוריתמי פילוח (4) אוטומטיים אישית מעוצבת ואחרי עיבוד פני השטח וניתוח כמותי. בהתאם לשילוב של מאפייני ערכת הנתונים, נמצא כי בדרך כלל אחד מארבע גישות קטגורי אלה בביצועיו לאחרים, אבל תלוי ברצף של קריטריונים המדויקים, מוגישה מחדש מאשר אחד עשויה להיות מוצלחת. על סמך נתונים אלה, אנו מציעים תכנית קביעת סדרי עדיפויות שמסווגת את שני מאפייני מערך נתונים אובייקטיביים וקריטריונים אישיים הסובייקטיבית לניתוח ערכות נתונים השונים.
Introduction
באופן מסורתי, במיקרוסקופ האלקטרונים שדה (EM) היה מחולק ל1) סניף הביולוגיה המבני באמצעות TEM ברזולוציה גבוה וסופר גבוה, בשילוב בדרך כלל עם מידע סמוי או מפורש בממוצע כדי לחקור את המבנה תלת ממדים (3D) של קומפלקסי macromolecular עם הרכב מוגדר ובדרך כלל גודל קטן יחסית 1-4, ו2) סניף ההדמיה הסלולרי שבנופים סלולריים כולו הם דמיינו 1,5,6. בעוד ענף הביולוגיה המבני עבר פיתוח מרהיב בארבעת העשורים האחרונים, ענף הביולוגיה של התא היה בעיקר מוגבל לשני ממדים, לעתים קרובות על דגימות פחות מ-אופטימלי נשמרו. רק עם כניסתו של טומוגרפיה של האלקטרון בעשור האחרון יש הדמיה ultrastructural תא ביולוגית הורחבה לתוך הממד השלישי 5,7, שבו בדרך כלל בממוצע לא יכול להתבצע כנופים סלולריים, ובכך התכונות של עניין, הם בדרך כלל ייחודיים.
למרות סצנות סלולריות דמיינו לעתים קרובות מדהימות לעין, מיצוי יעיל של התכונות של עניין וניתוח כמותי שלאחר מכן כרכים סלולריים המורכבים ביותר כגון לפגר, בין שאר משום שהרכב החלבון המדויק הוא בדרך כלל לא ידוע, ולכן עושה את זה מאתגר לפרש סלולארי אלה כרכי 3D. למועד זה, מומחיות ביולוגית נרחבת יש צורך לעתים קרובות כדי לפרש tomograms המורכב, או אפילו לזהות את האזורים החשובים ומרכיבים חיוניים בנפח 3D. כסיבוך נוסף, ויזואליזציה של כרכי 3D להפליא לא טריוויאלית. ניתן לחשוב כרכי 3D של וכך דמיינו כערימות של תמונות 2D. בדיקת Slice-by-פרוסת תמונות 2D רציפות מפחיתה את המורכבות, אך הוא גם גבולות כוללים חילוץ וניתוח ובכך כמותי לשני ממדים. עם זאת, עבור רוב אובייקטי 3D, התיאור של כרכי 3D רק כערימה של מטוסים ברציפות מובילה לשלמהפרספקטיבה מעוותת ד אל טבע 3D של מערכת מסוימת. צורות אלטרנטיביות לבדיקה ויזואלית דורשות גם טיוח נפח או משטח טיוח, ש- בהתחשב באופי לעתים קרובות הצפוף של סלולארי נפח-יכול בקלות להוביל להשקפה חסומה של אובייקטים מקוננים או להציף משתמש לחלוטין, ובכך פילוח ידני אינטראקטיבי קשה.
כדי לתקן את החסמים אלה, מגוון גדול של חילוץ תכונה אוטומטי גישות (פילוח) פותחו שהן בדרך כלל גם density- או 8-10 מבוסס שיפוע. עם זאת, שיטות אלה נוטים למגזר כולו הנפח ללא קשר לאילו תחומים או תכונות הן עניין למומחה, אם כי חלק מהשיטות האחרונות יכולות למקד תכונה ספציפית של עניין, כגון סיביים אקטין 11. בנוסף, תוכניות ביצוע פילוח אוטומטי יכולות לפעמים לגרום לייצור של מספר רב של כרכי משנה (לדוגמא, בעת החלת immersio קו פרשת מיםn פילוח) שלעתים קרובות צריך להיות ממוזגים ידני בחזרה הלמרכיב את כל התכונה של עניין או להיות חשוף לפילוח נוסף. זה נכון בעיקר עבור ערכות נתונים מורכבות וצפופות, וכך האלגוריתמים ביותר טיוח אינם מסוגלים לחלץ רק את התכונות של עניין בנאמנות, ומאמצי אוצרות משמעותיים על ידי מומחה לעתים קרובות יש צורך לייצר רצוי נפח מפולח.
יתר על כן, פתרונות מותאמים אישית לבעיה מאוד ספציפית, לעתים קרובות שפורסמו כנייר מפגש מדעי, עם לא מעט דגש על הפיכתם רחבה וכלים מקיפים נגישים לחוקרים שאין להם ידע אינטימי של תחומי מתמטיקה, מדעי מחשב ו / או גרפיקה ממוחשבת. סביבת תוכנת תכנות להתאמה אישית, המכילה מגוון רחב של ספריות ניתוח תמונה, יכולה להיות קבוצת כלי רבת עוצמה המאפשרת למשתמשים לכתוב מודולים שלהם בצורה יעילה לפילוח מדויק. עם זאת, גישה זו דורשת שלוחההכשרת ensive ורקע במדעי מחשב כדי לנצל את התכונות או היכולות לניתוח תמונה רבות שלה. אחד יכול לעבוד בתוך כגון סביבת תוכנה תכליתית עבור קבוצות מסוימות הנתונים שבו התכונות דלילות יותר, למשל, על ידי שימוש בגישות המבוססת על צורה רבות עוצמה הנשענות על הגיאומטריה הייחודית של "תבניות" כדי להפריד בין אובייקטים של עניין מסביבתם 12,13 .
מגוון הוגן של הדמיה חבילות גרפיקה ממוחשבת קיימים לפילוח ידני אינטראקטיבי ובניית מודל. חלק מהחבילות זמינות מסחרי, ואילו אחרים הם ממוצא האקדמי ומופצים ללא תשלום, כגון: אוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו 14 כימרה, אוניברסיטת קולורדו 15 IMOD, ואוניברסיטת טקסס אוסטין VolumeRover 16. עם זאת, מגוון ומורכבות הרחב של תכונות ויכולות תוכניות אלה יש steepens העקומה למידה עבור each. תוכניות הדמיה מסוימות לספק מודלים גיאומטריים פשוטים, כגון כדורים ומקלות בגדלים שונים, אשר יכול להיות ממוקם בתוך מפות צפיפות על מנת ליצור מודל מופשט של המורכב 3D הנפח. מודלים אלה לאחר מכן לאפשר מדידות גיאומטריות ונפח פשוטים ולכן מעבר לרק "תמונה היפה". מעקב ידני כזה של אובייקטים עובד היטב עבור כרכים שבו רק מספר קטן של אובייקטים צריך להיות נעוצה וחילוץ. עם זאת, הפיתוח האחרון של ההדמיה ultrastructural 3D נפח הגדול תוך שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים סורק אלומת יונים ממוקד (FIB-SEM) 17-20 או במיקרוסקופ אלקטרונים פנים סריקת בלוק סדרתי (SBF-SEM) 21 מציג את הסיבוך נוסף שהגודל של נתוני 3D סטים יכולים לנוע בין ג'יגה לעשרות ומאות ג'יגה, ואפילו טרה. לכן, כרכי 3D גדולים כזה הם כמעט בלתי נגישים להבלטת תכונות ידניות, והישג אוטומטי למחצה מודרך משתמש יעיל ומכאןחילוץ יור יהיה אחד מצווארי הבקבוק לניתוח יעיל של כרכי 3D בעתיד הנראה לעין.
מוצג כאן ארבע גישות פילוח שונות המשמשות באופן שיגרתי במגוון רחב של סוגים ביולוגיים תמונה. אז שיטות אלה בהשוואה ליעילותם לסוגים שונים של ערכות נתונים, המאפשרות הידור למדריך כדי לעזור לביולוגים להחליט מה עשוי להיות גישת הפילוח הטובה ביותר להפקת תכונה יעילה של הנתונים שלהם. כמדריכים למשתמש מפורטים זמינים עבור רוב התוכניות המתוארות, המטרה היא לא להפוך את המשתמשים פוטנציאליים מכירים כל אחד מהחבילות אלה בפרט. במקום זאת, המטרה היא להפגין את העוצמות ומגבלות בהתאמה של אסטרטגיות פילוח השונות אלה על ידי יישום אותם לערכות נתונים שש דוגמא עם מאפיינים שונים. באמצעות השוואה זו, סדרה של קריטריונים פותחו המבוססות גם על מאפייני תמונה האובייקטיביים שלערכות נתונים 3D, כגון ניגוד נתונים, פריכות, צפיפות, ומורכבות, או נובעים משיקולים סובייקטיביים, כגון מטרה הרצויה עבור פילוח, מורפולוגיות של התכונות כדי להיות מקוטעות, צפיפות אוכלוסייה של התכונות של עניין, כלומר את החלק היחסי של הנפח תפוס על ידי התכונה של עניין, ואיך הוא יתקדם בצורה אופטימלית עם משאבים מוגבלים, כגון זמן וזמינות של צוות. ערכות נתונים אלה שונים דוגמא ממחישות כיצד ניתן ליישם קריטריונים אובייקטיביים וסובייקטיביים אלה ברצף במגוון רחב של שילובים כדי להניב זיווג של גישות חילוץ תכונה מסוימות עם סוגים מסוימים של ערכות נתונים. ההמלצות ניתנו יהיה בתקווה לעזור טירונים מתמודדות עם מגוון גדול של אפשרויות פילוח לבחור את גישת הפילוח היעילה ביותר עבורו 3D הנפח שלהם.
למרות ההתמקדות של מאמר זה הוא הבלטת תכונות, תשומת לב לאיסוף נתונים ועיבוד נתונים מראש הוא קריטי לים יעילegmentation. לעתים קרובות הכתמה של דגימות יכולה להיות לא אחידה, ולכן, יש לשקול חפצים מכתים פוטנציאליים בהליך הפילוח. עם זאת, כתם בדרך כלל נותן אות לרעש גבוהה יותר, ולכן דורש פחות סינון וטיפול מתמטי אחר של כרכים סלולריים, אשר עלול גם לגרום לחפצים. ערכות נתונים תמונת הגלם המתאימות צריכה להיות שנרכשו בהגדרות קונטרסט ופיקסל מצלמה הנכונות, מיושר, ושחזרו ל3D נפח. לtomograms, תמונות מיושרות משוחזרות בדרך כלל באמצעות משוקללת בחזרה הקרנה, ולאחר מכן ערכת הנתונים היא בדרך כלל נתון לאלגוריתמי denoising כגון דיפוזיה אינה ליניארי איזוטרופי 22, סינון דו צדדי 23, או חציון רקורסיבית סינון 24. נתוני הדמיה FIB-SEM וSBF-SEM מיושרים ידי פרוסות ברציפות מקשר צולבות בXY תוכניות ניצול כגון ImageJ 25. שיפור לעומת וסינון ניתן ליישם כדי לשפר את התכונות שלריבית ובכך לבטל את רעש ערימת התמונה. סינון יכול להתבצע גם על כל הנפח לפני subvolume בחירה או על subvolumes נבחר, כגישות סינון יכולות להיות המחשוב יקרה. Down-הדגימה של נתונים (binning), אשר לעתים משמש להפחתת רעש ו / או צמצום גודל קובץ, מומלץ רק אם הנתונים כבר oversampled באופן משמעותי בהשוואה להחלטה הצפויה.
לאחר הפחתת רעשים, אז יכולות להיות מפולחות התמונות מעובדות על ידי שיטות שונות, ולהתמקד במחקר זה הוא על ארבעה אלה: (1) דור מופשט מדריך למודל באמצעות יצירת מודל כדור מקל ו, (2) מעקב ידני של תכונות של עניין, (3) צפיפות מבוססת סף אוטומטי, ו (4) פילוח אוטומטי בהתאמה אישית באמצעות תסריט לפילוח ספציפי פרויקט. פילוח גבול 8 ופילוח פרשת המים immersive 10 חלופות טובות יותר לקביעת ערכי סף פשוט, אבל לאהיי שייך לאותה קטגוריה, ולא נכלל באופן מפורש בדיון הזה.
מעקב ידני של צפיפויות דורש מתאר את התכונות של עניין, לחתוך-by-פרוס, המאפשר השמירה של הצפיפות המקורית של אזורי משנה הסלולר בהתאמה. גישה זו מאפשרת שליטה מקסימלי בתהליך הפילוח, אבל היא תהליך מייגע ועתירת עבודה.
אוטומטי גישות פילוח צפיפות (וקשור) המבוסס על סף הן חצי אוטומטיות, שבו אלגוריתם בוחר פיקסלים המבוססים על סט של פרמטרים המוגדר על ידי משתמש. כמה חבילות אקדמיות (חינם) להדמיה, כגון קליפורניה בסן פרנסיסקו כימרה, IMOD, פיג'י 26, וVolumeRover זמינות, כמו גם מסחריות (הדורשות רישיונות בתשלום) חבילות, ושני הסוגים בדרך כלל כוללים אחד או יותר מהגישות פילוח אלה. חבילות התוכנה המשמשות בעבודה זו כדי להמחיש שיטות שונות אלה כוללות שני תוכניות מסחריות וים פתוח אקדמיתוכניות ource לידניות יצירת מודל מופשט, כמו גם פילוח צפיפות ידני ואוטומטי. עם זאת, תוכנת קוד פתוחה יכולה לפעמים להציע אפשרויות מתקדמות יותר באמצעות האפשרות של התאמה אישית.
השוואה של טכניקות אלה באמצעות סוגים שונים של ערכות נתונים הובילה למצגת הבאה של כללים וההנחיות כיצד לפנות לפילוח של כרכי 3D נתונים ביולוגיים מגוונים, אשר למיטב ידיעתנו טרם פורסמו. לפיכך, זה הוא ההשוואה השיטתית הראשונה של הגישות השונות והתועלת שלהם על ערכות נתונים עם משתנה מאפיינים עבור משתמשים עם מטרות שונות.
Protocol
Representative Results
Discussion
אסטרטגיות יעילות להפקת תכונות רלוונטיות מכרכי 3D EM נחוצים בדחיפות על מנת לשמור על קשר עם הצונאמי נתונים שלאחרונה פגע הדמיה ביולוגית. בעוד יכולים להיות שנוצרו נתונים בשעות או ימים, זה לוקח חודשים רבים כדי לנתח את כרכי 3D בעומק. לכן, ברור כי ניתוח התמונה הפך את צוואר הבקבוק לתגליות מדעיות; ללא פתרונות הולמים לבעיות אלה, מדעני הדמיה הפכו הקורבנות של ההצלחה שלהם. מדובר בין שאר בשל המורכבות הגבוהה של נתונים וגם ההצטופפות מולקולארית נמצאת בדרך כלל בתאים ביולוגיים, שבו חלבונים וקומפלקסי חלבוני גבול אחד את השני ובעצם להופיע כשיפוע רציף של צפיפות בגווני אפור. הבעיה היא מסובכת בשל פגמי הכנת מדגם והדמיה, ובחלק מחפצי שחזור תמונת מקרים, שמוביל לנתונים נפח פחות ממושלם שיכול להוות אתגר לגישה אוטומטית לחלוטיןes. המשמעותי ביותר, עם זאת, היא העובדה שהמומחים בהכנת מדגם, הדמיה, והפרשנות הביולוגית לעתים רחוקות בקיאים במדע חישובים, ולכן דורשים הדרכה על איך לגשת להבלטת תכונות וניתוח ביעילות. לכן, באמצעות השימוש בדוגמאות שונות, הפרוטוקול מסביר כיצד להכין נתונים לפילוח, כמו גם צעדים לדור במדריך מופשט מודל, פילוח מבוסס צפיפות אוטומטי, מעקב ידני של תכונות של עניין, ופילוח אוטומטי בהתאמה אישית. ניתן למצוא הגישות ידניות ואוטומטיות המפורטים בנוהל במגוון גדול של תוכנות פילוח, שחלקם הוזכרו כאן, אבל אחרים לבצע פעולות דומות והם באותה מידה גם מתאימים.
התוצאות מראות כי אפקטיבי של כל אחת מהגישות פילוח 3D משתנה עבור כל סוג של ערכות נתונים שונים. למרות הגישות השונות המיוצרות באופן איכותי שלהדמיות 3D imilar כמוצר סופי, את כמות הזמן והמאמץ שהושקעו בכל אחת, במהלך תהליך הפילוח מגוון באופן משמעותי. ההמלצות למאפייני תמונה מתאימות ומטרות אישיות לכל גישה לפילוח מסוכמות באיור 5, שמוסבר בהרחבה בארבעת הסעיפים הקטנים הבאים. קריטריונים אלה הוחלו על ששת מערכי נתונים, כפי שמוצגים בתרשים זרימת החלטה של איור 6. למרות איורים 5 ו -6 הם רק נועדו לספק רציונל לכל קבוצת נתונים וכיצד כל אחד מהקריטריונים שוקללו בתהליך קבלת החלטות, הם אינם מספקים הדרכה חסינת תקלות, אלא נקודת התחלה. יש פשוט יותר מדי קריטריונים רבים המשפיעים על תהליך קבלת החלטות: חלקם קריטריונים אובייקטיביים, כגון מאפייני ערכת נתונים, ואילו אחרים הם קריטריונים סובייקטיביים יותר, כגון מטרה הרצויה. זה בטוח לומר כי ערכות נתונים המציגות לב גבוהאל של ניגוד עם גבולות חדים חדים, יש להם תכונות שהם גם נפרדים והומוגנית יחסית (לא יותר מדי מגוונים), ומעובדים במטרה להציג מודל צפיפות עבור מספר גדול של אובייקטים, גישות אוטומטיות תהיה מעולה, אם לא ל העובדה שגישות ידניות פשוט להיות משאב -prohibitive (זמן). מצד השני, אם לעומת זאת היא נמוכה, נתונים מעורפלים ולכן דורשים ידע של מומחה, האובייקטים הם צפופים, והתכונות להראות גיוון גבוה ולכן הם הטרוגנית, ייתכן שאין לי אחד כל ברירה אחרת מאשר הבלטת תכונות ידניות / פילוח.
מדריך להפשטת דגם דור
מעקב מודל מופשט ידני הוא יעיל במיוחד בפילוח אלמנטים ליניארי, מתן נקודות זרעים (כדורים) שניתן לחבר באופן אוטומטי (מקלות). כדורים כאלה ומקלות-דגמים יכולים להיות חזקים מאוד כדי למדוד אורךnd כיוון של מודל כזה ולספק מודל מופשט במידה מספקת עבור שניהם בדיקה איכותית וניתוח כמותי. דור מודל המופשט ידני נפוצה בעת מזעור משאבים שהושקעו בניתוח הוא חשוב יותר מנאמנות מוחלטת לצורות של הנתונים המקוריים. זה הכי מוצלח עם תכונות ליניארי והומוגנית של עניין (למשל, חוטים, צינורות). לעומת זאת הנתונים, פריכות, וצפיפות לא משחקים תפקיד מרכזי בקביעת ההצלחה של שיטה זו, כל עוד העין האנושית יכולה לזהות את האובייקט של עניין. לפעמים גם יכולים להיות מנוצלים דגמים כגון שלד למגזר מפת 3D באזור סביב השלד. למרות שהמודל הוא מופשט ולא השתקפות של צפיפות מדויקת, הוא מייצג גרסת skeletonized של צפיפות 3D ובכך מאפשר להדמיה ללא עומס וניתוח איכותי. ניתן גם נקבעו מדידות כמותיות כגון אורך מהמודל המשוער. עבורדוגמא לתוכנה עם דור מודל מופשט במדריך, אנא בקר במדריך למשתמש מפורט של כימרה באינטרנט בhttp://www.cgl.ucsf.edu/chimera/current/docs/UsersGuide/index.html.
איתור ידני של תכונות של ריבית
מעקב מכחול ידני עובד היטב עם כמעט כל מאפייני נתונים, אבל זה גם הזמן רב ביותר בשיטה. בזמנים, זה רק הטכניקה לחילוץ תכונה של עניין מסט תמונה מורכב המכיל מגוון רחב של תכונות, כגון קרום התא הדק ומפותל. כלי שימושי אחת בחלק מהתוכניות מאפשר לאינטרפולציה בין פרוסות מפולחות לסירוגין כאשר התכונה של שינויי ריבית בצורה חלקה. מעקב ידני יכול להיות מיושם באופן יעיל ביותר, אם נתונים הוא פריכים ויש לו בינוני עד גבוה, לעומת זאת, אבל יכול גם להיות מנוצל זהעבור ערכות נתונים מאתגרות יותר, כל עוד שהמשתמש מכיר את מושא העניין. מורכבות הנתונים יכולות לנוע בין אובייקטים דיסקרטיים לערכות נתונים מורכבות וצפופות, שבו חפצים ארוזים באופן הדוק. במקרה האחרון, פילוח ידני עשוי להיות הבחירה היחידה, כגישות אוטומטיות לעתים קרובות מאבק למגזר הנפח הרצוי ולחלץ יותר מדי או מעט מדי. מורפולוגיות תכונה קשות, כגון סדינים או כרכים מפותלים, יכולות גם להיות מופקים בשיטה זו. עם זאת, המשתמש צריך לזכור כי בסיס הנתונים עם מספר מאפיינים קשים יכולים להיות מקוטע רק אם צפיפות האוכלוסייה של התכונות של עניין היא נמוכה, כמו פילוח של צפיפות אוכלוסייה גבוהה של התכונות של עניין הופך להיות בזמן אוסרני. לדוגמא של תוכנה עם מעקב ידני, אנא בקרו במדריך למשתמש מפורט של עמירה המקוונת בhttp://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf.
פילוח מבוסס צפיפות אוטומטית
בניגוד לטכניקות ידניות, הגישות האוטומטיות הן בדרך כלל פחות זמן רב, שהוא גורם חשוב לשקול בעת פילוח ערימה גדולה של תמונות. עם זאת, קביעת ערכי סף פשוט לא יכול להיות מדויקת כ, והרבה יותר זמן יכול להיות שהוצאה על עידון ואוצרות של הנפח המפולח באופן אוטומטי. פילוח מבוסס צפיפות אוטומטית עובד הכי טוב על ערכות נתונים המציגות מספר רב של תכונות דומות של עניין שכולם דורשים פילוח. אם הנתונים הוא מורכבים יותר, טכניקות האוטומטיות אלה עדיין יכולות לשמש כצעד ראשוני, אך סביר להניח כי תדרוש קצת התערבות ידנית לאורך הקו כדי לציין subvolume המכיל את התכונה של עניין. אסטרטגיה זו בדרך כלל עובדת היטב על מורפולוגיות ליניארי או כרכים מפותלים, אבל זה מוצלח לעתים רחוקות עם סדינים מפותלים דקים כגוןתא ממברנות. התערבות משתמש מינימאלית עם גישות אוטומטיות מאפשרת פילוח באמצעות כמויות גדולות או קטנות, בזמן שמשקיע משאבי משתמש כמה כגון זמן בתמורה לאיכות גבוהה. לדוגמא של תוכנה עם פילוח מבוסס צפיפות אוטומטית, אנא בקרו במדריך למשתמש מפורט של עמירה המקוונת בhttp://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf.
מותאם אישית מותאם אוטומטית פילוח
Custom-מותאם פילוח אוטומטי מאפשר כוח ההתאמה האישית של אלגוריתמים לערכת נתונים ספציפי, אך לעתים קרובות ספציפי לנתונים שנקבעו או סוג נתונים, המתאימים למספר מוגבל של מאפייני תכונה, ולא ניתן להכליל בקלות. ההליך לראווה כאן שונה מגישות הכלליות אוטומטי הפילוח, כגון טבילת קו פרשת מים ורמה אחרת שיטות סט, אשר מסתמכות על קביעה מתוכנתת של נקודות זרע קריטיות, ואחריו התרחבות קובייה צועדת במהירות מנקודות הזרע אלה. וריאציה על נושא זה היא פילוח גבול, שבו מידע וקטור השיפוע מודיע גבולות תכונה. בניגוד לכך, את התסריט המותאם אישית משמש כאן מסתמך על שלב אימונים שבו המשתמש עוקב באופן ידני כמה דוגמאות. באמצעות למידת מכונה, אלגוריתמים ספציפיים יהיו לזהות ולאחר מכן ילמדו לזהות באופן עצמאי תכונות ומאפיינים נמצאו נתונים באופן עקבי בסימנים. משתמש מומחה יכול להכשיר את האלגוריתמים ולשפר את הדיוק של פילוח על פי כולל יותר דוגמא עקבות כדי לספק סדרה גדולה יותר של קריטריוני תכונה. בסך הכל, גישות thresholding וגישות בנושא, או אפילו בהתאמה אישית לא יכולות להיות שימושיות כדי לחלץ תכונה אחת של ריבית מתמונה עם מגוון מורכב של האברונים או צורות, כמו אוצרות עשויות להיות בדיוק כמו עבודה אינטנסיבית כמעקב ידני.
">אסטרטגיות לTriaging נתונים ובחירת גישת פילוח
בהתחשב בקריטריונים סובייקטיביים ואובייקטיביים מוצגים באיור 4 וסיכום של מערכי נתונים מתאימים באיור 5, את ערכת קבלת ההחלטות המתוארות באיור 6 יכולה לסייע להערכה אפקטיבית של אסטרטגיות הבלטת תכונות למגוון גדול של ערכות נתונים. ערכות הנתונים triaged בארבע החלטות ברציפות, כל אחד מהם עשוי לכלול כל אחד מארבעת היעדים בהתאמה, כמו גם את ארבעת הקריטריונים סובייקטיביים הציגו באיור 4. כדוגמא, איור 6 הוא רציונלים לtriaging כל אחד מהנתונים שש סטים שמוצגים באיור 3. אין ספק, לכל הנתונים שנקבעו שאין דרך ייחודית בודדת, אך נתיבים שונים למדי באמצעות מטריצה זו הבאה קריטריונים שונים לקבלת החלטות שעלולות להוביל to זהה או שונה ההמלצה לפילוח נתונים. בעוד כל קבוצת הנתונים תהיה סט של תכונות, שלא ניתן לצפות משלו, מקבלות שש דוגמאות, כל זיווג עם הסבר של הרציונל העומד מאחורי גישת חילוץ / פילוח התכונה המועדפת. רוב כולל גם הצעה למסלול החלטה חלופית שגם תוצאות בשימוש באותו או גישת פילוח שונה (איור 6).
Kinocilium הוא נתונים פריכים משובצים בגבולות מוגדרים וברורים, מה שהופך את גישות אוטומטיות יותר סיכוי להצליח. כל התכונות של עניין מופרדים היטב, שוב העדפת גישה אוטומטית. בנוסף, התכונות של עניין דומות זה לזה, מה שהופך אותו אידיאלי ערכת נתונים הומוגנית יחסית לפילוח בהתאמה אישית. לבסוף, המטרה הייתה לחלץ את כל התכונה, העדפת גישה חצי אוטומטי. כתוצאה מכך, זה היה להסיק כי thresholding אוטומטי (קו מוצק ירוק), כמו גם (גישה אישית מעוצב למשל, לעצב את הפילוח בפיקוח) (קו ירוק מנוקד) שניהם צפוי לעשות כן במערך נתונים זה.
קריטריונים דומים, אם כי הניחו בסדר שונה ברשת קבלת החלטות, חל על המקרה של חיידקים. גישה בהתאמה אישית מומלצת בין שאר משום שמערך נתונים זה היה גדול מאוד; ומכאן, משאבים מוגבלים לאסור גישת התערבות / פילוח ידנית עתירת עבודה. בעוד thresholding היה הניב תוצאות מתקבלות על הדעת, הגישה אישית מעוצב הייתה מסוגלת לבצע יעד המרכזי של המחקר כדי להפריד את צורות חיידקים עגלגלות מפיקדונות המתכת תאיים, הממוקמים גם בין בחיידקים או בסמוך לחיידקים, ולכן גישה בהתאמה אישית הייתה מעדיפה.
עבור ערכות נתונים stereocilia, השיקול הראשון היה המטרה הרצויה: המטרה יכולה להיות או להראות כל הצפיפותאו ליצור מודלים גיאומטריים. הנפח של העניין היה אזור צפוף, והמטרה הייתה קטע מספר רב של עצמים כאובייקטים מופרדים על מנת לבצע ניתוח נפח הכמותי, כוללים אורכים, מספרים, מרחקים, כיוון, וכו 'זה היה מועיל בהמשך שהאובייקטים של העניין היה בעיקר ליניארי, וזה עשה את מודל גיאומטרי התחקות השיטה של בחירה. עם זאת, אם במקום המטרה הייתה להראות את כל הצפיפות, אז מורפולוגיה התכונה ליניארי, כמו גם גבוה יחסית לעומת גבולות ברורים וחדים תגרום פרוטוקול thresholding אוטומטי אפשרי.
קרום התא ומקרי נתונים מיטוכונדריה מאתגרים לגישות אוטומטיות בשל הקטגוריות של מורפולוגיה תכונה: גיליונות וכרכים מפותלים, בהתאמה. המטרה היא לעקוב אחר קווי המתאר תא או מיטוכונדריה במדויק, אבל יש משאבים רק סופיים לכך. בנוסף, התכונות של היתרההערכה היא מורכבות ולא יכולה להיות בקלות זוהתה באופן אוטומטי או בקידוד לעצב, אם כי לנתונים מיטוכונדריה מגדיר את גישת scripting המותאמת אישית נלקחה לחיידקים עשויים להיות מיושמים עם התאמה אישית נוספת. למרבה המזל, את הקרום ומיטוכונדריה עצמם לייצג רק חלק קטן מכל הנפח ומכאן, מעקב ידני הוא פשוט אם כי גישה גוזל זמן. מעקב ידני הוא גם שיטת בחירה של ערכות נתונים מסוג זה כאשר לעומת זאת היא נמוכה למדי והגבולות הם די מטושטשים. כתוצאה מכך, גם אם הם מהווים חלק משמעותי מערכות נתונים, גיליונות מפותלים כזה חייבים להיות נעוץ באופן ידני, פשוט בגלל חוסר חלופה טובה יותר.
ערכת נתוני מפעל שמציבה אתגרים משלו, כי המטרה הייתה למגזר כל האובייקטים, שהם צפופים במרווחים ומרכיבים את נוף צפוף. מציג את הצפיפות כפי שהוא יאפשר מדידות על הצורה והארגון של האובייקטים, אבל בecause פילוח ידני כל אובייקט סיבי הוא יקר מדי, thresholding האוטומטי הועסק במקום.
הצעדים השונים ותוצאות מקבילה ביצירת מודל 3D הוצגו כאן, אבל יותר חשוב, מאפייני נתונים וקריטריונים אישיים מצאו להיות מכריעים בקביעת הדרך הטובה ביותר של פילוח גם הובהרה. המאפיינים החשובים של נתוני התמונה עצמה כוללים מה שמתואר כאן כניגוד לכך, צפיפות, פריכות, ומספר צורות או תכונות (כגון האברונים, חוטים, ממברנות) שונות. קריטריונים סובייקטיביים לשקול לכלול את המטרה הרצויה של פילוח (מדידה / ספירה, ייצוג skeletonized של נתונים / בו מוצגות כרכים בהדמיות 3D), מאפיינים מורפולוגיים של התכונה של עניין (ליניארי, מוארכת, ברשת, מורכבת, מפותלת), הצפיפות של תכונות של עניין ביחס לכל הנפח (את החלק היחסי של האובייקטים שחשוב וצריכים להוציא), ואיזון הפשרות של משקיע משאבים לנאמנות של הפילוח של הנתונים המקוריים והתמורה פוחתת על ההשקעה וכתוצאה מהשיפורים מצטברים להקצאה באופן משמעותי גבוהה יותר של משאבים.
תחום פילוח תמונה התבגר באופן משמעותי במהלך השנים האחרונות, עדיין אין כדור כסף, אין אלגוריתם או תכנית שיכול לעשות את כל זה. גדלי סט נתונים גדלו ממאה מגה בייט באופן שיגרתי עשרות ג'יגה בייט, והם עכשיו מתחילים יעלו על טרה, מה שהופך את פילוח מדריך לכמעט בלתי אפשרי. לפיכך, יותר משאבים צריכים להיות מושקעים בגישות הבלטת תכונות חכמות וזמן אפקטיבי המחקות את תהליך קבלת החלטות האנושי. מאמצים אלה צריכים להיות בשילוב עם (1) מערכת מידע גיאוגרפי (GIS) מבוססת בסיסי נתונים סמנטיים היררכיים (בדומה לGoogle Earth), (2) טכניקות הפשטת נתונים (כלומר, מעברמvoxel לייצוג / נפח גיאומטרי) תואם עם עיצוב בעזרת מחשב (CAD) תוכנה כדי להפחית באופן משמעותי את כמות הנתונים ובכך מאפשר את התצוגה של נפחים גדולים יותר 35, (3) טכניקות הדמיה, כפי שהם משמשים לעתים קרובות ב תחומי הנדסה, כמו גם יכולות (4) אנימציה מתקדמת וביצירת סרטים, כוללים אנימציות לטוס דרך (בדומה למה שפותח עבור תעשיית המשחקים).
ברור, הבלטת תכונות יעילה ופילוח נמצאים בלב של מהפכה הקרובה בהדמיה ברזולוציה גבוהה סלולרית, ובזמן שתמיד יש צורך בגישות טובות יותר, את העקרונות שהוצגו כאן, כמו גם דוגמאות של מה גישה נלקחו עבור סוגי נתונים שונים , יספק מידע רב ערך לקבלת החלטה על שמתקרבת לקחת.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to acknowledge and thank Tom Goddard at University of California San Francisco for his endless help with Chimera, Joel Mancuso and Chris Booth at Gatan, Inc. for their help with SBF-SEM data collection of bacteria dataset, Doug Wei at Zeiss, Inc. for his help with the FIB-SEM data collection of epithelial cell dataset, Kent McDonald at University of California Berkeley Electron Microscopy Lab for advice on sample preparation, TEM imaging and tomography, Roseann Csencsits at Lawrence Berkeley National Laboratory for her help taking the cryo-TEM image, Elena Bosneaga for cryo-sectioning of the plant dataset, Jocelyn Krey at Oregon Health and Science University for the dissection of utricle tissue, David Skinner at National Energy Research Scientific Computing Center (NERSC) and Jitendra Malik at University of California Berkeley for their advice in software infrastructure, and Pablo Arbelaez at University of California Berkeley for his codes contributions to the custom-tailored script presented in this article.
Research was supported by the U.S. Department of Energy, Office of Science under contract No. DE-AC02-05CH11231 [David Skinner], as well as U.S. National Institutes of Health (NIH) grant No. P01 GM051487 [M.A.] for the inner ear hair cell project and microscopy instrumentation use.
Materials
| Material Name | Company | Comments | |
| Amira | FEI Visualization Sciences Group | http://www.vsg3d.com/amira/overview | |
| Chimera | UCSF | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | |
| Fiji/ImageJ | National Institute of Health | http://fiji.sc/Fiji, http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| IMOD | Boulder Laboratory for 3D Electron Microscopy of Cells | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | |
| Photoshop | Adobe | http://www.adobe.com/products/ photoshopfamily.html | |
| MATLAB | MathWorks | http://www.mathworks.com/ | |
| VLFeat | VLFeat | http://www.vlfeat.org/ |
Riferimenti
- Auer, M. Three-dimensional electron cryo-microscopy as a powerful structural tool in molecular medicine. J Mol Med (Berl). 78 (4), 191-202 (2000).
- Johnson, M. C., Rudolph, F., Dreaden, T. M., Zhao, G., Barry, B. A., Schmidt-Krey, I. Assessing two-dimensional crystallization trials of small membrane proteins for structural biology studies by electron crystallography. Journal of visualized experiments JoVE. (44), e1846 (2010).
- Jun, S., Zhao, G., Ning, J., Gibson, G. A., Watkins, S. C., Zhang, P. Correlative microscopy for 3D structural analysis of dynamic interactions. Journal of visualized experiments JoVE. (76), e50386 (2013).
- Meng, X., Zhao, G., Zhang, P. Structure of HIV-1 capsid assemblies by cryo-electron microscopy and iterative helical real-space reconstruction. Journal of visualized experiments JoVE. (54), e3041 (2011).
- Chen, S., McDowall, A., et al. Electron Cryotomography of Bacterial Cells. Journal of visualized experiments JoVE. (39), e1943 (2010).
- Meyerson, J. R., White, T. A., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. Journal of visualized experiments JoVE. (58), e2770 (2011).
- Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. Structural studies by electron tomography: from cells to molecules. Annu Rev Biochem. 74, 833-865 (2005).
- Bajaj, C., Yu, Z., Auer, M. Volumetric feature extraction and visualization of tomographic molecular imaging. J Struct Biol. 144 (1-2), 132-143 (2003).
- Lin, G., Adiga, U., Olson, K., Guzowski, J. F., Barnes, C. A., Roysam, B. A hybrid 3D watershed algorithm incorporating gradient cues and object models for automatic segmentation of nuclei in confocal image stacks. Cytometry A. 56 (1), 23-36 (2003).
- Volkmann, N. A novel three-dimensional variant of the watershed transform for segmentation of electron density maps. Journal of Structural Biology. 138 (1), 123-129 (2002).
- Rigort, A., Günther, D., et al. Automated segmentation of electron tomograms for a quantitative description of actin filament networks. Journal of structural biology. 177 (1), 135-144 (2012).
- Cremers, D., Rousson, M., Deriche, R. A Review of Statistical Approaches to Level Set Segmentation. Integrating Color, Texture, Motion and Shape. International Journal of Computer Vision. 72 (2), 195-215 (2007).
- Lin, Z., Davis, L. S. Shape-based human detection and segmentation via hierarchical part-template matching. IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 32 (4), 604-618 (2010).
- Pettersen, E. F., Goddard, T. D., et al. UCSF Chimera–a visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
- Zhang, Q., Bettadapura, R., Bajaj, C. Macromolecular structure modeling from 3D EM using VolRover 2.0. Biopolymers. 97 (9), 709-731 (2012).
- Giannuzzi, L. A., Stevie, F. A. A review of focused ion beam milling techniques for TEM specimen preparation. Micron. 30 (3), 197-204 (1999).
- Heymann, J. A. W., Hayles, M., Gestmann, I., Giannuzzi, L. A., Lich, B., Subramaniam, S. Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope. Journal of structural biology. 155 (1), 63-73 (2006).
- Knott, G., Rosset, S., Cantoni, M. Focussed ion beam milling and scanning electron microscopy of brain tissue. Journal of visualized experiments JoVE. (53), e2588 (2011).
- Wirth, R. Focused Ion Beam (FIB) combined with SEM and TEM: Advanced analytical tools for studies of chemical composition, microstructure and crystal structure in geomaterials on a nanometre scale. Chemical Geology. 261 (3-4), 217-229 (2009).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2 (11), e329 (2004).
- Frangakis, A. S., Hegerl, R. Noise reduction in electron tomographic reconstructions using nonlinear anisotropic diffusion. Journal of structural biology. 135 (3), 239-250 (2001).
- Jiang, W., Baker, M. L., Wu, Q., Bajaj, C., Chiu, W. Applications of a bilateral denoising filter in biological electron microscopy. Journal of Structural Biology. 144 (1), 114-122 (2003).
- Van der Heide, P., Xu, X. P., Marsh, B. J., Hanein, D., Volkmann, N. Efficient automatic noise reduction of electron tomographic reconstructions based on iterative median filtering. Journal of structural biology. 158 (2), 196-204 (2007).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- MathWorks. . MATLAB. , (2012).
- Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. Systems, Man and Cybernetics, IEEE Transactions on. 9, 62-66 (1979).
- Vedaldi, A., Fulkerson, B. . VLFeat: An Open and Portable Library of Computer Vision Algorithms. , (2008).
- Zhu, S. C., Guo, C., Wang, Y., Xu, Z. What are Textons?. International Journal of Computer Vision. 62 (1-2), 121-143 (2005).
- Gagnon, L. H., Longo-Guess, C. M., et al. The chloride intracellular channel protein CLIC5 is expressed at high levels in hair cell stereocilia and is essential for normal inner ear function. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 26 (40), 10188-10198 (2006).
- Briand, P., Petersen, O. W., Van Deurs, B. A new diploid nontumorigenic human breast epithelial cell line isolated and propagated in chemically defined medium. In vitro cellular & developmental biology journal of the Tissue Culture Association. 23 (3), 181-188 (1987).
- Petersen, O. W., Rønnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Shin, J. B., Krey, J. F., et al. Molecular architecture of the chick vestibular hair bundle. Nature neuroscience. 16 (3), 365-374 (2013).
- Yang, W., Zeng, Z., Max, N., Auer, M., Crivelli, S. Simplified Surface Models of Tubular Bacteria and Cytoskeleta. Journal of Information & Computational Science. 9 (6), 1589-1598 (2012).
