Høy gjennomstrømming Bildeanalyse av Tumor Spheroids: Et brukervennlig program for å måle størrelsen på Spheroids automatisk og nøyaktig

SpheroidSizer er utviklet for å produsere automatisert deteksjon, avgrensning og måling av 3D sfæroider, med bemerkelsesverdig redusert arbeidskraft og akutt økt effektivitet for store mengder bilder. Figur 1a viser arbeidsflyten av SpheroidSizer. Kjernen beregningsmåten omfatter automatisert initialisering, aktiv kontur algoritme og kontur kvantifisering. Etter automatisert beregning, bruker kvalitetskontroll funksjonen en kombinasjon av "Manual Initialize" og "Hånd Draw" verktøy for å berge noen ufullkommen segmentering. Figur 1B viser detaljert automatisert aktiv kontur algoritme. Den innledende trinn (0. iterasjon) benytter basisbildeprosesseringstrinn for å generere omtrentlige størrelsen og plasseringen av den sfæroide og generere en sfærisk kontur initiering med en beregnet størrelse. Innvielsen kontur trekkes inn i den aktive konturen algoritmen. I sin tur gjentar det å justere i henhold til det lokale bildetgradient og form kurvatur. Den aktive konturen algoritmen er ferdig når konturen stabiliserer (konvergerer), dvs. 477 iterasjoner for dette bildet, eller når den forhåndsdefinerte maksimale antall gjentakelser blir henrettet. I dette eksemplet er initialisering kontur hensikt forstørret for bedre å frem algoritmen. I virkeligheten er initialisering vanligvis svært nær den faktiske grensen og mye færre iterasjoner er nødvendig for algoritmen til å konvergere. Deretter tar algoritmen morfometriske målinger av den detekterte sfæroide grense. De store og små aksene i spheroid måles MATLAB bildebehandling verktøykasse (figur 1C). Den store akse er definert som den linjesegment kobler et enkelt par av de fjerneste punkter på konturen, som er referert til lengden (L). Den mindre aksen er definert som den lengste linje vinkelrett på hovedaksen, som er referert til bredden (W). I dette tilfelle verdiene av L og W er svært nær ettersomspheroid er sfærisk. Volumet av den sfæroide er beregnet som V = 0,5 * L * W 2. En av funksjonene i SpheroidSizer er dens automatisert deteksjon av grensen av sfæroider selv på bilder med ujevn eller støyende bakgrunn utnytte den aktive konturen algoritmen (Tall 2B-D). Computational behandling av lyse feltet bilder er ofte plaget av ujevn bakgrunn, som villeder adaptive thresholding-baserte metoder for å produsere uønskede thresholding resultater. Problemet er spesielt tydelig når det multi-brønn plater blir brukt og veggene i brønnene kan skape skygge på bildene. Imidlertid, fordi den aktive kontur algoritmen er ikke følsom for den gradvise endringen i skyggelegging bakgrunn, er det i stand til å identifisere sfæroide segmentering i disse lyse feltbilder med riktig initialisering. Figur 2 viser noen eksempler på bilder med ujevn eller støyende bakgrunn, som ujevn belysning (Figur 2B </strong>), rusk (figur 2C) eller nekrotisk kjerne (figur 2D). Med automatisert aktive kontur algoritme, delineates SpheroidSizer Disse sfæroider nøyaktig i alle disse bildene som vist i den røde konturen på det nedre panel i hver figur. Kvalitetskontroll funksjon i SpheroidSizer er nøkkelen til en høy gjennomstrømming arbeidsflyt. "Manuell Initialize" og "Hånd Draw" verktøy er verdifulle gratis verktøy for dette programmet. Blant hundrevis eller tusenvis av bilder, er det uunngåelig at den automatiserte algoritmen er ikke i stand til riktig oppdage sfæroider i noen bilder. Som illustrert i figur 3A, når feilaktig deteksjon av den sfæroide forårsakes på grunn av klargjøringstrinn, det vil si feil størrelse eller plassering av initiering kontur i bildet (topp-panelet), arbeider "Manual Initialize"-verktøyet ved å tillate brukeren å riktig definere plasseringen og størrelsen på SPHEROID manuelt (nedre panel). Det utløser den aktive konturen algoritme for å sette i gang med manuelt definert kontur og gjennomføre til sammen på ønsket disposisjon. For disse tøffe bilder som originalbildet i Figur 3B, er spheroid ligger i et distraherende og støyende bakgrunn. SpheroidSizer er ikke i stand til skikkelig identifisere spheroid ved automatisert metode (øverste panel) eller av "Manual Initialize" verktøy med riktig initialisering (midtre panelet). I dette tilfellet kan "Hand Draw"-verktøyet brukes til å tegne omrisset av den sfæroide manuelt som vist i det nedre panel. Programmet benytter den brukerdefinerte grense for å måle de store og små aksene av sfæroide, og beregne volumet. Alle de korrigerte resultater er umiddelbart innlemmet i "Resultater", og kan følgelig eksporteres. For å bestemme ytelsen til SpheroidSizer i større datasett, vi først sammenligne driftstiden vedanalysere det samme settet med 288 bilder med en) manuelle målinger med mikroskop leverandør medfølgende programvaren; 2) SpheroidSizer med en single-core vanlig laptop; og 3) SpheroidSizer med en multi-core parallell databehandling ytelse arbeidsstasjon. De manuelle målingene følger våre typiske protokollen før utvikle programvaren: lengden og bredden på hver spheroid er tegnet for hånd og målt med leverandøren program (sett de røde linjene i den øvre delen av figur 4A); så brukeren kopiene ned verdiene av målinger. SpheroidSizer behandler hvert bilde ved å generere spheroid grensen (som får rødt omriss i nedre panel av figur 4A), måle aksial større og mindre lengde, og eksportere resultatene i regneark. Som det fremgår av tabell 1, basert på beregningen av 288 bilder, tar det et gjennomsnitt på 31,67 sek for å måle en sfæroide per bilde manuelt; mens det tar bare SpheroidSizer mindre enn 2 sek & # 160; når du kjører på en single-core vanlig laptop; og mindre enn ett sekund når du kjører på en 12-core ytelse arbeidsstasjon. Derfor er bildeanalyse enn 18x raskere per bilde ved hjelp SpheroidSizer enn manuelle målinger. Det reduserer dramatisk arbeidskraft når mer enn tusen bildene analyseres. Deretter sammenligner vi variasjonen i målinger av de 24 sfæroider vist i figur 4A mellom manuelle målinger og SpheroidSizer. De 24 sfæroider måles tre ganger av begge metoder; og standardavviket for hver enkelt spheroid beregnes. Som vist i figur 4B, er standardavviket fra SpheroidSizer (grønn linje og prikker) er nær null med unntak av de tre sfæroider som er korrigert ved kvalitetskontrolltrinn, noe som fremdeles viser mindre standardavvik enn de fra den manuelle målinger metoden. Alt dette viser at SpheroidSizer utfører bildeanalyse mer effektivt og nøyaktig. e_content "> Vi gjennomførte en narkotika-skjermen ved hjelp av menneskelige BON-en 3D tumor sfæroider å finne ut hvilke forbindelser i kombinasjon med en Hsp90 inhibitor er de potensielle kandidater for testing av anti-tumor effekter in vivo. Menneske BON-en 3D-tumor sfæroider ble dyrket på agarose-belagt 96-brønners plater som beskrevet i forrige papir 15. Åtte forskjellige forbindelser med seks seriefortynning pluss media og kjøretøyet ble screenet for sine enkle og kombinatoriske effekter med 10 nM og 20 nM Hsp90 inhibitor i duplikater hhv. To ving ble brukes for hver konsentrasjon av den individuelle forbindelse eller de kombinerte forbindelser. fire 96-brønners plater med totalt 384 sfæroider ble anvendt. Alle sfæroider ble fotografert ved 0, 72, 144, 168 og 192 timer. Totalt 1920 bilder ble fremstilt fra dette eksperimentet. Det tok SpheroidSizer bare 30 minutter å fullføre beregningsanalyse av de 1920 bildene med en ekstra 50 min for kvalitetskontroll og eksport av data. SpheroidSizer hastigheter opp bildeanalyse prosessen enormt. Figur 5A viser et skjermbilde av mappen ordninger og filnavn for dette eksperimentet som et eksempel for Protocol Trinn 3.3. Figurene 5B-E viser skjermbilder av bildeanalyse pop-up vinduer og resultater . hjelp SpheroidSizer som illustrasjoner til Protocol trinn 4, 5, og 7 Tar volumene av 3D sfæroider fra den formaterte resultattabellen eksportert fra SpheroidSizer, gjorde vi grafer – vekst av 3D tumor sfæroider på sammensatte behandlinger versus tid av behandlinger. To representative grafer fra dette forsøk er vist på figur 5F og 5G. Figur 5F viser at den kombinerte behandlinger av Hsp90 inhibitor og cladribin (grønn linje) inhibere veksten av 3D sfæroider mer enn én behandling av Hsp90 inhibitorer (purple linje) eller cladribin (oransje linje), noe som tyder på at den kombinerte behandlinger av Hsp90 inhibitor og kladribin kan ha anti-tumor effects in vivo. Figur 5G viser at den kombinerte behandlinger av Hsp90 inhibitor og adriamycin (grønn linje) ikke hemmer veksten av 3D sfæroider mer enn én behandling av adriamycin (oransje linje) eller Hsp90 inhibitorer (purple linje), noe som tyder på at den kombinerte behandlinger av Hsp90 inhibitor og adriamycin kanskje ikke har anti-tumoreffekt in vivo. Dette eksperimentet hjalp oss å velge forbindelsene for å teste deres anti-tumorvirkninger in vivo og SpheroidSizer er nøkkelen til den raske eksperimentelle dataanalyse. Tabell 1. Sammenligning av driftstiden på bildeanalyse mellom manuelle målinger og SpheroidSizer når analysere det samme settet med 288 bilder. Vennligst cslikke her for å se en større versjon av denne tabellen. Figur 1 SpheroidSizer -… En åpen kildekode-program for å måle spheroid størrelse A) Kjernen arbeidsflyten av søknaden B) Illustrasjon av den aktive konturen algoritmen på ulike stadier av iterasjon. Vær oppmerksom på at initialisering kontur (iterasjon 0) ble med vilje forstørres for å vise frem algoritmen. C) De større og mindre målinger aksial lengde og beregning av volumet av SpheroidSizer. L – hovedakse: linjesegment kobler et enkelt par med fjerneste punkter på konturen (referert til lengden); W – akse: den lengste linje vinkelrett på hovedaksen (referert til bredde). <p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> Figur 2. Representative resultater fra den automatiserte segmentering av SpheroidSizer, viser robusthet mot ulike bildeforhold. A) bilder Typisk god kvalitet. B) med forskjellig lysstyrke og kontrast. C) Bilder med distraherende rusk. D) Bilder av sfæroider med nekrotisk kjerne . Bilder på den øvre delen av hver figur er kilde / originalbildene; bilder på den nedre panel av hver figur er kvalitetskontroll bilder; og den røde omrisset er den sfæroide segmentering tegnet ved automatisert beregning. hres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51639/51639fig3.jpg "/> Figur 3.. Illustrasjon av "Manual Initialize" og "Hand Draw" verktøy. A) "Manuell Initialize" verktøyet lar tegningen av en passende ellipse form over spheroid for initialisering, når unøyaktig spheroid segmentering skjer etter den automatiserte initialisering. B ) Den "Hand Draw"-verktøyet gir nøyaktig hånd tegning av spheroid grensen, når unøyaktige sfæroide segmentations oppstå med både automatiske og manuelle initialisering. Den blå linjen rundt spheroid viser initialisering kontur; den røde omrisset er det identifisert spheroid grensen. Vær oppmerksom på at spheroid i "Manuell Initialize" i A) og spheroid i "Hand Draw" i B) er med hensikt forstørret for å bedre vise frem verktøy. <img alt="Figur 4" fo:content-width = "5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/51639/51639fig4highres.jpg" "> Figur 4. Sammenligning av bildeanalyse ytelse mellom SpheroidSizer og manuelle målinger ved å analysere det samme settet av 24 bilder. A) Representative sfæroider for å vise hvordan den lengde og bredde av sfæroider som er bestemt av manuelle målinger og SpheroidSizer. Topp 24 bilder inneholder håndtegnet lengde / bredde på hver spheroid i røde linjer ved hjelp av manuelle målinger; lavere 24 bilder (de samme 24 bilder) inneholder data trukket spheroid grensen i rødt omriss hjelp SpheroidSizer. B) Standardavvik av lengde eller bredde fra tre målinger på hver enkelt spheroid. Figur 5. Et representativt eksempel på utnyttelse av SpheroidSizer i narkotika skjermen – bildeanalyse på Sfæroidene 'bilder som ble samlet inn fra en narkotika-skjermen ved hjelp av BON-en 3D-tumor sfæroider A) Et skjermbilde av mappen ordninger og filnavn for dette prosjektet B) Et skjermbilde av den avanserte.. konfigurasjoner vindu i SpheroidSizer. C) Et skjermbilde av SpheroidSizer1.0 vindu med vises Resultater. D) Et skjermbilde av formatet utdatafilen eksportert fra SpheroidSizer. E) Et skjermbilde av listen output file eksportert fra SpheroidSizer. F) Vekst av 3D-tumor sfæroider ved behandlinger med Hsp90 hemmer og kladribin. G) Vekst av 3D-tumor sfæroider ved behandlinger med Hsp90 hemmer og adriamycin. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet. </p>