Vi presenterar en hög genomströmning bildanalys programvara för att mäta storleken på tredimensionella tumör sfäroider avbildas med ljusfält mikroskopi. Denna applikation ger ett snabbt och effektivt sätt att undersöka effekterna av terapeutiska läkemedel på sfäroider, vilket är till nytta för forskare som vill använda spheroids i drogskärmar.
Det ökande antalet ansökningar av tredimensionella (3D) tumör spheroids som en modell för läkemedelsforskning in vitro kräver anpassning till storskalig screening format i varje steg av en drog skärm, inklusive storskaliga bildanalys. För närvarande finns ingen klar att använda och fri bildanalysmjukvara för att möta detta stort format. De flesta befintliga metoder involverar manuellt rita längden och bredden på de avbildade 3D spheroids, vilket är en mödosam och tidskrävande process. Denna studie presenterar en hög genomströmning bildanalys programvara – SpheroidSizer, som mäter den större och mindre axiell längd av de avbildade 3D tumör spheroids automatiskt och noggrant; beräknar volymen för varje enskild 3D tumör spheroid; matar sedan ut resultaten i två olika former i kalkylblad för enkla manipulationer i den efterföljande dataanalys. Den största fördelen med denna programvara är dess kraftfulla bildanalys program som äranpassad för ett stort antal bilder. Det ger hög genomströmning beräkningar och kvalitetskontroll arbetsflöde. Den beräknade tiden för att bearbeta 1.000 bilder är ca 15 min på ett minimalt konfigurerad bärbar dator, eller ca 1 min på en multi-core prestanda arbetsstation. Det grafiska användargränssnittet (GUI) är också utformad för enkel kvalitetskontroll, och användare kan manuellt åsidosätta datorresultat. Nyckeln metod som används i denna programvara är anpassad från den aktiva kontur algoritmen, även känd som ormar, som är speciellt lämplig för bilder med ojämn belysning och bullrig bakgrund som ofta plågar automatiserad bildbehandling i hög genomströmning skärmar. Den kostnadsfria "Manuell Initiera" och "Hand Draw" verktyg ger flexibilitet att SpheroidSizer att hantera olika typer av sfäroider och olika bildkvalitet. Denna high-throughput bildanalys programvara minskar anmärkningsvärt arbete och snabbar upp analysprocessen. Att genomföra detta program är beneficial för 3D tumör sfäroider att bli en rutin i modell vitro för drog skärmar i industri och akademi.
Tredimensionell (3D) tumör sfäroider är "sfäriskt symmetriska aggregat av tumörceller som är analoga med vävnader, utan artificiellt substrat för cellvidhäftning" 1-3. Den cytologi och morfologi av tumören sfäroider bättre härmar vivo tumörvävnad som organisation och mikromiljöer än monolager tvådimensionella (2D)-celler i. 3D tumör sfäroider har blivit en praktisk modell för hög kapacitet visningar av anti-cancer terapeutiska droger eller undersöka effekten av läkemedelskandidater in vitro innan in vivo djur eller kliniska tester 4. Kliniskt, är effekten av eventuella läkemedel mot cancer behandling utvärderas baserat på minskad tumörtillväxt. Analogt kan spheroid volym användas som ett mått på effektiviteten för in vitro-studier cancerläkemedel. Sfäroid volym (V = 0,5 * Längd * Bredd 2) bestäms utifrån den större och mindre axiell längd (mer känd som längd och bredd)av sfäroiderna 6, 7. De flesta forskare har att rita manuellt längd och bredd på varje sfäroid, ofta med hjälp av programvara som erbjuds av mikroskopi företag och säljs tillsammans med avbildningsinstrument. Denna teknik blir problematiskt när hög kapacitet drogskärmar utförs och mer än hundra bilder produceras. Några aktuella studier rapporterade användningen av öppna källbildanalysprogram verktygslådor såsom CellProfiler 8-10 och ImageJ 11 utveckla rudimentära segmente rutiner / makron som involverade belysning korrigering och enkel tröskel. Dessa rutiner behöver ofta åter justeras för olika partier av bilder beroende på belysningen skick och bildkontrast förändring; därför kan dessa mjukvarupaket inte uppfyller robustkravet för bildanalys med hög genomströmning. Friedrich och medarbetare (2009) använt proprietär programvara för att mäta sfäroid volym semi-automtiskt 5. Den metod som beskrivs i Monazzam och hans kollegors papper 10 var en semi-automatisk metod för att mäta sfäroid storlek bara för ett litet antal bilder. Därför finns det ett tydligt behov av robusta, flexibla, automatiserade och färdiga att använda bild analysverktyg för 3D tumör spheroids.
I denna studie beskriver vi SpheroidSizer – en MATLAB-baserad och open-source program för att mäta storleken på tumör sfäroider automatiskt och korrekt. SpheroidSizer är utformad för att behandla många olika partier av bilder i 3D spheroids i samma session. Använda den aktiva konturalgoritmen 12-14, kan SpheroidSizer tolerera bildkontrastförändringar, kraftigt ignorera gradvis förändring av bakgrundsbelysningen och erkänna spheroids i bilden. Det kan också tolerera många vanliga artefakter, till exempel, skräp, härstammar från provet. Arbetsflödet är utformad så att användarna kan utföra kvalitets control under eller efter beräkning. Manuellt överskrivning av analysresultatet kan lätt genomföras på plats. Att dra nytta av den parallella beräkningar verktygslåda, kan analyshastigheten ytterligare av att samordna flera datorer kärnor att arbeta på beräkningen samtidigt på en användares dator. Dessutom SpheroidSizer matar ut resultaten i två olika former för att möjliggöra enkel gränssnitt med nedströms analysverktyg.
Denna studie presenterar en snabb, flexibel, effektiv och automatiserad program – SpheroidSizer för noggrann bestämning av storleken på 3D-tumör sfäroider. SpheroidSizer är enkel att använda och kräver minimal inmatning från användare. De mest kritiska stegen för exakt, problemfri och framgångsrikt driva SpheroidSizer inkluderar: att sfäroiderna avbildas i centrum av området utan att röra kanten av brunnen; alla filer som ska analyseras tillsammans som ett projekt ska avbildas under samma mikroskop med samma syfte; alla filer som ska analyseras är korrekta namnet och sätt som framgår av protokollet; och korrekta användardefinierade inställningar anges innan beräkning.
Fördelarna med SpheroidSizer innefattar dess förmåga att tolerera gradvis bakgrund förändring i bilden samt för att generera mjuka konturer, vilka motsvarar de allmänna sfäriska former av sfäroiderna som utnyttjar aktiv kontur-algoritm. Utförande av aktivkontur kan äventyras i två situationer: dålig initiering, eller förekomst av andra lokala kanter distraherande från den önskade konturen. Speciellt i våra testade fall, den andra situationen ibland hända när den nekrotiska kärnan i en stor sfäroid lockar aktiva konturen vilket resulterar i mindre kontur rapporteras. Det är värt att notera att andra automatiserade tröskelbaserade metoder lider även i denna situation, om inte tröskelvärdet är specifikt inställd för hand. Programvaran lägger därför fram för att hjälpa användarna upptäcka och åtgärda äventyras segmentering genom att erbjuda enkla kvalitets kontrollfunktioner. Om segmente fel händer från dålig initiering, kan användnings använda "Manuell Initiera" verktyg för att åsidosätta den automatiska initieringen. När bildkvaliteten är för dålig för aktiv kontur, kan användarna enkelt "Hand Draw" konturen som matar in kvantifiering. Befintlig programvara såsom CellProfiler kan anpassas för denna applikation i en semi-automatiserad Fashion. Arbetsflödet kan vara besvärlig när stora mängder bilder med olika avbildningsbetingelser presenteras eller när en delmängd av bilder behöver mer mänsklig inblandning för att mäta korrekt. SpheroidSizer ger en allt-i-en svit för beräkning och kvalitetskontroll för att hantera hög genomströmning bildanalys arbetsflöde.
SpheroidSizer är för närvarande begränsad till att upptäcka en sfäroid per bild och endast mäter den axiella längd sfäroid. Programmet kan utökas för att stödja ytterligare kvantifiering krävs av forskare såsom kvantifiering på sfäroider med nekrotisk kärna, upptäcka flera spheroids i en bild eller övervakning av formen på sfäroider. Vidare kan programmet modifieras för att detektera och mäta storleken på de exciderade tumörer från djur eller människa, som säkerligen kommer att vara till nytta för forskare när de utför in vivo pre-klinisk eller klinisk forskning. Efterbearbetning av de upptäckta spheroids kan också undersökas målning till att minska människans ansträngning som krävs för kvalitetskontroll och ytterligare förbättra genomströmningen. SpheroidSizer är en generaliserad bildanalys ansökan om 3D tumör sfäroider som produceras från alla celltyper, och därför kan användas av ett brett cancerforskarsamhället.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka för Raymond och Beverly Sackler Foundation för deras stöd i vår forskning.
Axiovert 200M inverted microscope | Carl Zeiss Microscopy, LLC | microscope for imaging | |
Vostro 1720 | Dell Inc. | single-core regular laptop | |
HP Z820 | HP Inc. | multi-core performance workstation | |
Matlab and Simulink R2013a | Mathworks, Inc, Natick, MA | Matlab software |