프로테옴 Transcriptomic 분석에 대한 거미의 독을 추출하고 독 그랜드 Microdissections
Summary
이 기사는 1 위해 전기 자극을 이용하여 거미의 독을 추출하기위한 프로토콜), 프로 테오 믹 특성을 수행 2) 독 선 유전자 발현을 자극, 3) 독의 기능 연구를 수행을 제공합니다. 이는 유전자 발현 연구를위한 독 그랜드 microdissections의 설명이 이어진다.
Abstract
독의 화학적 일반적으로 다양한 생리 활성을 가진 수많은 단백질과 펩타이드를 포함하는 복잡한 분비물이다. 독 단백질의 기능적 특성은 세포의 수용체에 대한 약물 리드 나 프로브의 식별을 포함하여 중요한 생물 의학 응용 프로그램을 가지고 있습니다. 거미 독이 생물 종 중 가장 풍부한 분기 군이지만, 단지 몇 종의 독액 인해 작은 동물로부터 독 분 수량을 수집과 관련된 어려움에 부분적으로 잘 이해된다. 이 논문은 서양의 검은 과부 (Latrodectus의 개밥 바라기)의 절차를 시연, 전기 자극을 이용하여 거미의 독의 수집을위한 프로토콜을 제시한다. 수집 된 독은 질량 분석을 통해 직접 단백질 식별, 기능 분석 및 transcriptomic 연구 독 유전자 발현의 자극을 포함하여 다양한 다운 스트림 분석에 유용합니다. 이러한 기술은 이소 프로토콜을 통해 장점을 갖는다독의 일환으로 분비되지 않는 세포 단백질에서 정품 독의 구성 요소를 분리하지 않는 전체 글 랜드 균질에서 후반 독. 대표적인 결과는 질량 분석기를 사용하여 수집 된 샘플로부터 공지 독 펩티드의 검출을 보여준다. 독 수집 절차의 결과는이 시퀀스 레벨에서 독 발현 된 단백질 및 펩티드의 특성에 이르게한다는 증명으로, 거미 독 땀샘 해부 용 프로토콜에 따른다.
Introduction
독은 주로 포식 또는 방어의 목적으로 다른 동물에 주입 동물의 분비물이며, 또한 생물 의학 관련 1-3으로 중요한 생물학적 응용 프로그램을. 특정 동물의 독을 합성하지만 진화 독립적 때문에 생산은 무척추 동물 (예를 들면, 자포 동물, 콘 달팽이, 전갈, 거미)과 척추 동물 (예를 들면, 뱀, 일부 물고기와 포유 동물)에서 분류 학적으로 널리 퍼져 여러 번 1,4 . 독의 생화학 적 특성은 전형적으로 크게 급속 구성 독소 일을 제공하는 주입 동물의 순환계 신경계에 작용하는 단백질 및 펩티드의 매우 다양한 구성된다 보여준다. 악의에 찬 동물의 작은 부분은 인간, synanthropic 분포 5 특히 종을 위협 할 수 있습니다. 독의 구성과 기능 활동의 연구는 중요한 역할을했다척추 동물의 세포 성분 (특히 신경 세포의 이온 채널) 6과 기본적인 세포 프로세스 (예 : neurosecretion)를 7 해명의 기능 특성. 또한, 선택 독 펩타이드는 암과 통증 8,9에 대한 치료로서 그 용도를 포함하여 생물 의학 상황에서 유용한 특성을 가지고 있고, 후보 물질 리드와 해독제 개발을위한 채굴된다. 독은 따라서 이러한 위험 분비물의 컬렉션이 많은 유틸리티가 있습니다, 생태 및 진화 연구 1,4,10,11에서 눈에 띄는 역할을한다.
40,000 설명 거미 (주문 Araneae)의 종과 송곳니 (12)에 종료 독 분비를 쌍으로 가지고 있어요 100 개 이상의 거미 가족 중 하나를 제외하고 모두>가 있습니다. 거미의 높은 종 다양성은 악의에 찬 생물의 가장 큰 분기 군을 대표하는 것이 좋습니다. 그러나, 거미 독의 생화학 적 특성은 L가argely 대부분 인간 envenomation와 연관된 종의 소수 농축시켰다. 거미 독의 최근 프로테오믹스 및 transcriptomic 연구들은 일반적으로 많은 독특한 단백질과 펩타이드 2,13,14를 포함 나타냅니다. 높은 처리량의 cDNA 서열 분석 및 질량 분석 펩티드 핑거 발전 하였을 독 단백질 (15)의 발견을 촉진했다. 그럼에도 불구하고, 이러한 작업은 기술에 대한 충분한 독 및 / 또는 거미의 독을 분비하고, 자세한 설명서의 컬렉션으로 시작 16 몇 가지 있습니다.
이 논문은 비슷한 크기의 거미에 적용 할 수있는 검은 과부 거미의 독과 독을 분비의 수집을위한 프로토콜을 제시한다. 별도로 땀샘에서 독의 컬렉션은 다른 세포 기능을 수행하는 단백질과 반대로 독으로 분비되는 단백질의 식별을 가능하게한다. 검은 부와 다른 Latrodectus 종은 널리 때문에 가끔 넘치도록 땀, 근육의 수축, 고혈압, 호흡 곤란 및 누덕 누덕 기운 마비 5 동반 인간에 심한 통증이 발생 그들의 높은 신경 독성 독,에 가장 위험한 거미들로 인식된다. 여기에 제시된 독 수집 프로토콜은 근육의 수축과 독의 방출을 유도하는 마취 거미에 전류를 전달하기 위해 전기 자극을 사용합니다. 독 방울 신속 마이크로 모세 혈관과 수집 및 냉동 저장을위한 튜브에 분배된다. 프로토콜이 위험한 절차를 관련이 있기 때문에, 그것은 단지 잘 훈련 된 개인에 의해 수행되어야하며주의 주요 단계에 촉구한다. 수집 된 독은 특성화 및 생리 학적 실험 또는 기능 분석 (18)의 구성 분자 (2)의 분리 등의 다양한 용도를 갖고, 독 11 유전자 발현을 자극. 프로토콜 대하여 descr로 결론독 동맥 박리와 독 특정 유전자의 복제에 유용 보존 iption은, 표현하는 다른 거미 10, 11에 독을 고갈 다음 2~3일 발생하는 것으로 나타났다.
Protocol
Representative Results
Discussion
독은 생리 학적 반응 단백질, 펩타이드 및 신약 개발을위한 응용 프로그램과 다른 분자의 중요한 원천뿐만 아니라 셀룰러 및 생태 학적 연구 1-3의 근본적인 측면을 나타냅니다. 그러나, 특히 위험하거나 작은 동물 독의 수집은 어려운 작업이다. 이 프로토콜은 독과 독 분비가 검은 과부 거미에서 수집 할 수있는 방법을 보여줍니다, 그리고 독에서 복제 독의 MuDPIT 분석 및 cDNA를 유래의 단백질 데이터베이스의 조합을 통해이 방식의 성공 (21)을 땀샘을 확인합니다. 이 프로토콜은 검은 과부와 중간 크기 거미, 잘 작동하는 동안 다른 독 수집 기술은 그러나, 피펫 예를 들어, 24.이 후자의 방법 유리에 이빨에서 독을 직접 흡입으로 큰 mygalomorph (거미 같은) 거미를 위해 사용되어왔다 , aggressi되지 않는 작은 크기의 거미를 위해 잘 작동하지 않습니다했습니다.
좀 더 일상적인, 일관성 있고, 빨리이되도록 여기에 설명 된 독 수집 프로토콜 중 하나 특히 중요한 측면은 수집 과정의 준비 및 최적화의 초기 단계입니다. 이 프로토콜은 마스터에 처음 도전이지만, 반복 시험으로, 그것은 쉽고 빠르게된다. 주의 또한 유해 거미 취급, 전류, 미세 점 유리 마이크로 모세관, 및 주사기 바늘의 사용을 포함하는 모든 주요 단계에서 압박된다. 그것은 마이크로 모세 혈관을 형성 할 때 안경뿐만 아니라, 니트릴 장갑, 실험실 코트, 긴 바지 및 폐쇄 신발로 적절한 개인 보호 장비를 착용하는 것이 중요합니다.
독 컬렉션 또 다른 도전 형태는 양 리 수집 될 수있는 어느 하나의 거미, 특히 Latrodectus 종에 의해 생산 독 소량기껏해야 각 당 1-2 마이크로 리터에 mited. 단백질 젤 또는 기능 분석과 같은 다운 스트림 애플리케이션에 충분한 독을 얻는 것은 하나의 튜브에 여러 사람들로부터 독의 조합을 필요로 할 수있다. 이러한 경우, 독은 동일한 성별, 개체 발생 단계의 개체로부터 결합되어야하고, 인구 일부 독액 25, 26, intersexual 발달 지리적 변동의 인식을 부여. 거미는 또한 적은 양의 글 랜드의 최근의 고갈을 반영 할 수있다 개인들 사이에서 생산 된 독의 양에 상당한 차이가 발생할 수 있습니다. 따라서 그들의 마지막 수유 후 독 며칠를 수집하는 것이 바람직 할 수있다. 작은 독가 해제되면, 과도한 전류는 체액 또는 사망과 독의 오염으로 이어지는, 표피가 파열 될 수있는 거미에 적용해서는 안된다.
거미의시와 독 샘플의 오염LK 또는 인간의 소스는 멸균 또는 청소 장비의 사용을 피해야한다. 이러한 문제에도 불구하고, 순수한 독의 수집, 살아있는 거미를 떠나, (다른 세포 단백질에서 독 성분을 분리하지 않음)과 거미를 죽이고 선 균질에서 독을 얻는 방법에 바람직하다. 이것은 샘플이 빠르게 단백질 분해를 방지하기 위해 냉동되도록하는 것도 매우 중요하다.
독 추출하여 독 분비선에서 독 유전자 발현을 자극 후속 독 생산을 촉진한다. 거미 독 고갈 살아 남기 위해이 프로토콜을 허용하기 때문에 따라서, 자신의 글 랜드 해부 할 수있는 몇 가지 일 후에 독 유전자 발현이 같은 성적은 10, 11를 복제 등의 유전 연구를위한 충분한 것으로 예상되는 시점에서 (거미를 죽이는). 몇 가지 중요한주의 사항은 독 글 랜드 해부에주의해야합니다. 중점 실험실 equipm의 사용에 배치해야ENT와 RNA를 분해 RNases의 무료 시약. 따라서이 된 RNase과 DNA 오염을 제거 솔루션과 집게 및 기타 비 일회용 장비와 표면을 닦아하는 것이 좋습니다. 해부는 또한 조직의 RNA의 무결성을 보장하기 위해 가능한 빨리 그리고 직접적 냉동로서 수행되어야한다. 그들의 두흉부 복부 빠르게 분리 한 후 마지막으로 해부 만, 마취 거미 수행하여야한다.
결론적으로,이 문서는 거미의 독과 독 분비를 얻을 수있는 검증 프로토콜을 제공합니다. 독과 독을 분비는 단백질 체학 및 transcriptomic 접근 방식을 사용하여 단백질과 펩타이드 성분의 분리 및 특성에 대한 수 있습니다. 또한, 독 샘플은 그 구성 분자의 생물 의학 및 약학 적 잠재력을 결정하는 기능 분석의 시작 포인트를 나타낼 수있다. 거의 모든 거미가 독을 생산하고 넓은 다이버개별 종에 의해 합성 된 독 성분의 SITY는 독 분자의 광대 한 다양성이 아직 13 발견 할 수 있습니다 제안합니다. 따라서,이 프로토콜은 거미 독에 존재하는 생물학적 활성 분자의 풍부한 원천을 조사하는 도구를 제공합니다.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
나는이 프로토콜의 개발에 그들의 도움을 다음 분들께 감사 : 척 크리스텐슨, 그레타 Binford, 알렉스 K. 랭커스터, 콘라드 Zinsmaier 및 메이스 이마 드를. 질량 분석 및 단백질 체학 데이터는 AZCC에 SWEHSC, NIH / NCI 부여 CA023074에 NIEHS 부여 ES06694 지원 애리조나 단백질 체학 (Proteomics) 컨소시엄과 아리조나 대학의 BIO5 연구소에 의해 인수되었다. 이 작품에 대한 자금 제시카 E. 의복 보조금 1F32GM83661-01과 1R15GM097714-01에서 국립 보건원 (일반 의학의 국립 연구소)에서 제공되었다.
Materials
| Nerve and muscle stimulator (electro-stimulator) | Grass Technologies | SD9 | http://www.grasstechnologies.com/products/stimulators/stimsd9.html |
| Voltmeter | RadioShack | 22-223 | any generic voltmeter/multimeter can be substituted |
| Pointed Featherweight Forceps | Bioquip | 4748 | |
| Plasti Dip | Performix | Available at Ace Hardware | |
| 21 G X 1 1/2in Precision Glide hypodermic syringe needle | BD Medical | 305190 | |
| Vacuum filter flask 1L | Nalgene | DS4101-1000 | smaller flask sizes may also work |
| Buchner Two Piece funnel, 90 mm | Nalgene | 4280-0900 | |
| 5 microlitter Capillary Bores (Micro capillaries) | VWR | 53508-375 | |
| Mounting putty strip | Loctite | Available at Ace Hardware | |
| Fisherbrand* General-Purpose Extra-Long Forceps Length: 11-13/16 in. | Fisher | 10-316C | |
| SSC Buffer, 20X (pH 7.0), Molecular Grade | Promega | V4261 | can be made from stock chemicals (150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate) |
| Eppendorf safe-lock tubes 0.5 mL tubes (cryogenic safe) | Eppendorf | 22363611 | |
| Nalgene Dewar, 1L, HDPE, Liquid nitrogen benchtop flask | Thermo Scientific | 4150-1000 | |
| Rnase Away | VWR | 53225-514 | |
| Ultra Fine Tweezers (dissecting forceps) | EMS | 78310-0 | similar high-quality fine point forceps can be substituted |
| Foot switch/pedal | Linemaster Switch Corp. | 491-S | |
| Two-pronged extension clamp, with vinyl covered sleeves, 8.5 inches | VWR | 21570-007 | similar models could be substituted |
| Clamp Holder | VWR | 89084-746 | similar models could be substituted, must accommodate diameter of extension clamp rod |
| Magnetic base (holds extension clamp via clamp holder) | VWR | 300042-270 | similar apparatus able to securely hold extension clamp in fixed position may be substituted |
| Plastic Collecting Vials (large/40 dram) | Bioquip | 8940 | |
| Cotton sewing thread | Threadart.com | THRCOT9 | similar product could be substituted |
Riferimenti
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