Extractie van Venom en Venom Gland Microdissections van Spinnen voor proteoom en transcriptoom Analyses
Summary
Dit artikel geeft een protocol voor de winning van gif van spinnen met behulp van elektrische stimulatie om 1) uitvoeren van proteomics karakterisering, 2) het stimuleren van gifklier genexpressie, en 3) uitvoeren van functionele studies van vergiften. Daarna volgt een omschrijving van gifklier microdissections genexpressie studies.
Abstract
Vergiften chemisch complex afscheiding kenmerkend omvattende verschillende proteïnen en peptiden met verschillende fysiologische activiteiten. Functionele karakterisering van gif eiwitten heeft belangrijke biomedische toepassingen, met inbegrip van de identificatie van de drug leads of probes voor cellulaire receptoren. Spinnen zijn de meest soortenrijke clade van giftige organismen, maar het gif van slechts een paar soorten zijn goed begrepen, voor een deel te wijten aan de moeilijkheid in verband met het verzamelen van kleine hoeveelheden gif van kleine dieren. In deze paper wordt een protocol voor het verzamelen van gif van spinnen met behulp van elektrische stimulatie, waaruit de gevolgde procedure aan de westelijke zwarte weduwe (Latrodectus hesperus). De verzamelde gif is nuttig voor gevarieerde downstream analyses met inbegrip van directe identificatie eiwit via massaspectrometrie, functionele testen, en het stimuleren van gif genexpressie voor transcriptomische studies. Deze techniek heeft het voordeel boven protocollen isolaat gif uit totaal klier homogenaten die niet echt gif componenten van cellulaire eiwitten die niet worden uitgescheiden als deel van het gif doen scheiden. Representatieve resultaten tonen de detectie van bekende gif peptiden uit het verzamelde monster met massaspectrometrie. Het gif verzamelprocedure gevolgd door een protocol voor het ontleden spin gifklieren met resultaten tonen dat dit leidt tot de karakterisering van gif expressie gebrachte eiwitten en peptiden op het sequentieniveau.
Introduction
Vergiften zijn dierlijke afscheidingen overwegend geïnjecteerd in een ander dier voor de doeleinden van predatie of de verdediging, en hebben ook belangrijke biologische toepassingen met biomedische relevantie 1-3. Alleen bepaalde dieren synthetiseren gif, maar de productie taxonomisch wijdverspreid over ongewervelde (bijv cnidarians, kegel slakken, schorpioenen en spinnen) en vertebraten (bijvoorbeeld slangen, sommige vissen en zoogdieren), omdat het onafhankelijk is geëvolueerd meerdere keren 1,4 . Biochemische karakterisatie van vergiften tonen bijvoorbeeld zij bestaan uit een groot aantal eiwitten en peptiden, die grotendeels werken op de bloedsomloop en het zenuwstelsel van geïnjecteerde dieren snel leveren bestanddeel toxines 1. Een klein deel van de giftige dieren kunnen een bedreiging voor de mens, met name soorten met synantrope distributies 5 vormen. De studie gif samenstelling en functionele activiteiten heeft een belangrijke rol gespeeldde functionele karakterisatie van gewervelde cellulaire componenten (met name neuronale ionenkanalen) 6 en ophelderen fundamentele cellulaire processen (bijv neurosecretie) 7. Bovendien selecteert gif peptiden hebben nuttige eigenschappen in biomedische contexten, met inbegrip van hun toepassingen als behandelingen voor kanker en pijn 8,9, en worden ontgonnen met kandidaat-medicijn leads en antivenom ontwikkeling. Venoms ook een prominente rol spelen in de ecologische en evolutionaire onderzoek 1,4,10,11, waardoor de verzameling van deze gevaarlijke afscheiding heeft vele nutsbedrijven.
Er zijn> 40.000 beschreven soorten spinnen (Orde Araneae), en alle, maar een van de meer dan 100 spin families bezitten gepaarde gifklieren die eindigen in giftanden 12. De hoge diversiteit aan spinnen soorten suggereert dat zij vertegenwoordigen de grootste clade van giftige organismen. Echter, biochemische karakterisering van spin gif heeft largely geconcentreerd op een klein aantal soorten het vaakst geassocieerd met menselijke envenomation. Recente proteoom en transcriptoom studies van spin gif geven ze vele unieke eiwitten en peptiden 2,13,14 bevatten doorgaans. Advances in high-throughput cDNA sequentie en massaspectrometrie peptide fingerprinting sterk vergemakkelijkt de ontdekking van deze gif eiwitten 15. Toch begint deze werkzaamheden met het verzamelen van voldoende gif en / of de gifklieren van de spinnen, en gedetailleerde documentatie voor dergelijke technieken zijn weinig 16.
In deze paper wordt een protocol voor het verzamelen van gif en gifklieren van zwarte weduwe spinnen, die kan worden toegepast op vergelijkbare grootte spinnen. De collectie gif afzonderlijk van de klieren kunnen identificatie van eiwitten die worden uitgescheiden in het gif in tegenstelling tot eiwitten uitvoeren van andere cellulaire functies. Zwarte weduwen en andere Latrodectus soorten worden algemeen erkend als een van de meest gevaarlijke spinnen vanwege hun zeer neurotoxisch gif, wat ernstige pijn veroorzaakt bij mensen, die soms gepaard gaat met overmatig zweten, spiersamentrekkingen, hoge bloeddruk, ademhalingsproblemen en fragmentarisch verlamming 5. Het gif collectie protocol hier gepresenteerde maakt gebruik van elektro-stimulatie van elektrische stroom te leveren aan verdoofd spiders om spiersamentrekkingen en het vrijkomen van gif ontlokken. Venom druppels worden snel verzameld met micro-capillairen en loopt vervolgens in buizen voor vriezer bewaren. Omdat het protocol betreft gevaarlijke procedures, mag het alleen worden uitgevoerd door goed opgeleide personen en voorzichtigheid wordt aangedrongen op belangrijke stappen. De verzamelde gif heeft talrijke toepassingen, zoals de karakterisering en isolatie van samenstellende moleculen 2 om fysiologische experimenten of functionele testen 18 en gif genexpressie 11 stimuleren. Het protocol wordt afgesloten met een description van gifklier dissectie en behoud bruikbaar voor het kloneren van gif-specifieke genen, waarvan de expressie is aangetoond dat het plaatsvindt 2-3 dagen na gif depletie in verschillende spinnen 10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vergiften een belangrijke bron van fysiologisch reactieve proteïnen, peptiden en andere moleculen met de toepassingen voor geneesmiddelenonderzoek, maar ook de fundamentele aspecten van cellulaire en ecologisch onderzoek 1-3. Echter, het verzamelen van gif, in het bijzonder van gevaarlijke of kleine dieren, is een uitdagende taak. Dit protocol laat zien hoe gif en gifklieren kunnen worden afgehaald bij zwarte weduwe spinnen, en bevestigt het succes van deze aanpak via een combinatie van MuDPIT analyse van het gif en een eiwit databank afgeleid van cDNA's gekloond van gifklieren 21. Hoewel dit protocol werkt goed voor zwarte weduwen en middelgrote spinnen, andere gif verzameling technieken zijn gebruikt voor grotere mygalomorph (tarantula-achtige) spinnen, zoals directe aspiratie van gif uit giftanden in glas pipetten bv, 24. Deze laatste benadering is echter , zal niet goed werken voor kleinere spinnen die niet aggressive.
Een bijzonder kritisch aspect van het gif verzameling protocol hier beschreven is de eerste fase van voorbereiding en optimalisering van de collectie proces zodat het meer routinematige, consistente en sneller. Het protocol is in eerste instantie een uitdaging om te beheersen, maar met herhaalde proeven, wordt het gemakkelijker en sneller. Voorzichtigheid is ook aangedrongen op alle kritieke fases die de hantering van gevaarlijke spinnen, het gebruik van elektrische stroom, fine-point glazen micro haarvaten, en injectienaalden. Het is belangrijk om de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen te dragen zoals nitril handschoenen, een laboratoriumjas, lange broek en gesloten schoenen, alsook een veiligheidsbril bij het vormgeven van micro haarvaten.
Een uitdagend aspect aan gif collectie is de kleine hoeveelheid gif geproduceerd door één spin, vooral Latrodectus soorten, waarvan de bedragen worden verzameld, kunnen li zijnmited 1-2 microliter per individu best. Verkrijgen van voldoende gif voor verdere toepassingen, zoals proteïne gels of functionele testen kunnen de combinatie van gif uit meerdere individuen in één buis vereist. In dergelijke gevallen moet het gif alleen worden gecombineerd uit personen van hetzelfde geslacht, ontogenetische podium, en de bevolking gezien de erkenning van intersexual, ontwikkelingsstoornissen en geografische variabiliteit in sommige vergiften 25, 26. Spinnen kunnen vertonen ook aanzienlijke variatie in de hoeveelheid gif geproduceerd tussen individuen, waarbij kleinere hoeveelheden de recente uitputting van de klier kunnen weerspiegelen. Zo kan het raadzaam zijn om gif meerdere dagen te verzamelen na hun laatste voeding zijn. Bij geringer gif vrijkomt, dienen overmatig stroom niet toegepast op de spin, die kan de cuticula scheuren, waardoor verontreiniging van het gif met hemolymfe of dood.
Besmetting van gif monsters met spin silk of menselijke bronnen moet ook worden vermeden door gebruik van steriele of schoon materiaal. Ondanks deze uitdagingen, de verzameling van pure gif, het verlaten van de spin leeft, is te verkiezen boven methoden die gif te verkrijgen van klier homogenates (die geen gif componenten hoeft te scheiden van andere cellulaire eiwitten) en doodt de spin. Het is ook essentieel dat de steekproeven snel bevroren om eiwitafbraak te voorkomen.
De winning van gif bevordert latere gif productie, waardoor gif genexpressie stimuleren in het gif klier. Aldus omdat protocol maakt spinnen gif uitputting overleven, de klieren worden ontleed enkele dagen later (doden van de spin) op een plaats waar gif genexpressie wordt verwacht voldoende genetische studies, zoals transcript klonen 10,11 zijn. Een aantal belangrijke voorzorgsmaatregelen moeten ook worden genomen in gifklier dissecties. De nadruk moet op het gebruik van lab equipm worden geplaatstent en reagentia die vrij zijn van RNases dat RNA afbreken zijn. Zo is het raadzaam om te vegen pincet en andere herbruikbare apparatuur en oppervlakken met oplossingen die RNase en DNA verontreiniging te elimineren. Dissecties moet zo snel mogelijk en direct bevroren worden uitgevoerd om verder te zorgen RNA integriteit van het weefsel. Tenslotte moet ontledingen alleen worden uitgevoerd op verdoofd spinnen, na cephalothorax en buik snel gescheiden.
Tot slot, dit artikel geeft een geverifieerd protocol om spin gif en gifklieren verkrijgen. Venom en gifklieren zorgen voor de isolatie en karakterisering van hun eiwitten en peptiden onderdelen met behulp van proteomics en transcriptomische benaderingen. Bovendien kan gif monsters het uitgangspunt van functionele assays, die de biomedische en farmacologische potentie van de samenstellende moleculen te bepalen vertegenwoordigen. Bijna alle spinnen produceren gif, en de brede duikersiteit van gif componenten gesynthetiseerd door individuele soorten suggereert een enorme verscheidenheid aan gif moleculen worden nog ontdekt worden 13. Derhalve is dit protocol geeft een aantal instrumenten om de rijke bron van biologisch actieve moleculen in spin gif onderzoeken.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ik dank de volgende personen voor hun hulp bij de ontwikkeling van dit protocol: Chuck Kristensen, Greta Binford, Alex K. Lancaster, Konrad Zinsmaier en Mays Imad. Massaspectrometrie en proteomics data werden verworven door de Arizona Proteomics Consortium ondersteund door NIEHS subsidie ES06694 de SWEHSC, NIH / NCI subsidie CA023074 de AZCC en door de BIO5 Instituut van de Universiteit van Arizona. De financiering van dit werk werd geleverd door de National Institutes of Health (Nationaal Instituut voor Algemene Geneeskunde) uit subsidies 1F32GM83661-01 en 1R15GM097714-01 aan Jessica E. Garb.
Materials
| Nerve and muscle stimulator (electro-stimulator) | Grass Technologies | SD9 | http://www.grasstechnologies.com/products/stimulators/stimsd9.html |
| Voltmeter | RadioShack | 22-223 | any generic voltmeter/multimeter can be substituted |
| Pointed Featherweight Forceps | Bioquip | 4748 | |
| Plasti Dip | Performix | Available at Ace Hardware | |
| 21 G X 1 1/2in Precision Glide hypodermic syringe needle | BD Medical | 305190 | |
| Vacuum filter flask 1L | Nalgene | DS4101-1000 | smaller flask sizes may also work |
| Buchner Two Piece funnel, 90 mm | Nalgene | 4280-0900 | |
| 5 microlitter Capillary Bores (Micro capillaries) | VWR | 53508-375 | |
| Mounting putty strip | Loctite | Available at Ace Hardware | |
| Fisherbrand* General-Purpose Extra-Long Forceps Length: 11-13/16 in. | Fisher | 10-316C | |
| SSC Buffer, 20X (pH 7.0), Molecular Grade | Promega | V4261 | can be made from stock chemicals (150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate) |
| Eppendorf safe-lock tubes 0.5 mL tubes (cryogenic safe) | Eppendorf | 22363611 | |
| Nalgene Dewar, 1L, HDPE, Liquid nitrogen benchtop flask | Thermo Scientific | 4150-1000 | |
| Rnase Away | VWR | 53225-514 | |
| Ultra Fine Tweezers (dissecting forceps) | EMS | 78310-0 | similar high-quality fine point forceps can be substituted |
| Foot switch/pedal | Linemaster Switch Corp. | 491-S | |
| Two-pronged extension clamp, with vinyl covered sleeves, 8.5 inches | VWR | 21570-007 | similar models could be substituted |
| Clamp Holder | VWR | 89084-746 | similar models could be substituted, must accommodate diameter of extension clamp rod |
| Magnetic base (holds extension clamp via clamp holder) | VWR | 300042-270 | similar apparatus able to securely hold extension clamp in fixed position may be substituted |
| Plastic Collecting Vials (large/40 dram) | Bioquip | 8940 | |
| Cotton sewing thread | Threadart.com | THRCOT9 | similar product could be substituted |
Riferimenti
- Fry, B. G., et al. The toxicogenomic multiverse: convergent recruitment of proteins into animal venoms. Annu. Rev. Genom. Hum. G. 10, 483-511 (2009).
- Escoubas, P., Quinton, L., Nicholson, G. M. Venomics: unravelling the complexity of animal venoms with mass spectrometry. J. Mass. Spectrom. 43 (3), 279-295 (2008).
- Twede, V. D., Miljanich, G., Olivera, B. M., Bulaj, G. Neuroprotective and cardioprotective conopeptides: An emerging class of drug leads. Curr. Opin. Drug Disc. 12 (2), 231-239 (2009).
- Casewell, N. R., Wüster, W., Vonk, F. J., Harrison, R. A., Fry, B. G. Complex cocktails: the evolutionary novelty of venoms. Trends Ecol. Evol. 28 (4), 219-229 (2013).
- Vetter, R. S., Isbister, G. K. Medical aspects of spider bites. Annu. Rev. Entomol. 53, 409-429 (2008).
- Adams, M. E., Myers, R. A., Imperial, J. S., Olivera, B. M. Toxityping rat brain calcium channels with omega-toxins from spider and cone snail venoms. Biochimica. 32 (47), 12566-12570 (1993).
- Silva, J. -. P., et al. Latrophilin 1 and its endogenous ligand Lasso/Teneurin-2 form a high-affinity transsynaptic receptor pair with signaling capabilities. PNAS. 108 (29), 12113-12118 (2011).
- Williams, J. A., Day, M., Heavner, J. E. Ziconotide: an update and review. Expert Opin. Pharmacother. 9 (9), 1575-1583 (2008).
- Veiseh, M., et al. Tumor paint: a chlorotoxin:Cy5.5 bioconjugate for intraoperative visualization of cancer foci. Cancer Res. 67 (14), 6882-6888 (2007).
- Binford, G. J., et al. Molecular evolution, functional variation, and proposed nomenclature of the gene family that includes sphingomyelinase D in sicariid spider venoms. Mol. Biol. Evol. 26 (3), 547-566 (2009).
- Garb, J. E., Hayashi, C. Y. Molecular evolution of α-latrotoxin, the exceptionally potent vertebrate neurotoxin in black widow spider venom. Mol. Biol. Evol. 30 (5), 999-1014 (2013).
- Platnick, N. I. . The World Spider Catalog., Version 14.0., DOI: 10.5531/db.iz.0001. , (2013).
- Sollod, B. L., Wilson, D., Zhaxybayeva, O., Gogarten, J. P., Drinkwater, R., King, G. F. Were arachnids the first to use combinatorial peptide libraries. Peptides. 26 (1), 131-139 (2005).
- King, G. F., Hardy, M. C. Spider-venom peptides: Structure, pharmacology, and potential for control of insect pests. Annu. Rev. Entomol. 58 (1), 475-496 (2013).
- Escoubas, P., Sollod, B., King, G. F. Venom landscapes: Mining the complexity of spider venoms via a combined cDNA and mass spectrometric approach. Toxicon. 47 (6), 650-663 (2006).
- Kristensen, C. Comments on the natural expression and artificial extraction of venom gland components from spiders. Toxin Rev. 24 (3-4), 257-270 (2005).
- Ushkaryov, Y. A., Volynski, K. E., Ashton, A. C. The multiple actions of black widow spider toxins and their selective use in neurosecretion studies. Toxicon. 43 (5), 527-542 (2004).
- Graudins, A., et al. Cloning and activity of a novel α-latrotoxin from red-back spider venom. Biochem. Pharmacol. 83 (1), 170-183 (2012).
- Spagna, J. C., Moore, A. M. F. Safe immobilization by CO2 of Latrodectus hesperus (Arachnida: Theridiidae). Pan-Pac. Entomo. l. 74 (4), 210-213 (1998).
- Foelix, R. . Biology of Spiders. , (2010).
- Haney, R. A., Ayoub, N. A., Clarke, T. H., Hayashi, C. Y., Garb, J. E. Dramatic expansion of the black widow toxin arsenal uncovered by multi-tissue transcriptomics and venom proteomics. BMC Genomics. 15, 366 (2014).
- Pescatori, M., Bradbury, A., Bouet, F., Gargano, N., Mastrogiacomo, A., Grasso, A. The cloning of a cDNA encoding a protein (latrodectin) which co-purifies with the α-latrotoxin from the black widow spider Latrodectus tredecimguttatus (Theridiidae). Eur. J. Biochem. 230 (1), 322-328 (1995).
- Grasso, A., Pescatori, M. Structural and functional studies of latrodectin from the venom of black widow spider (Latrodectus tredecimguttatus). Adv. Exp. Med. Biol. 391, 237-243 (1996).
- Szeto, T. H., et al. Isolation of a funnel-web spider polypeptide with homology to mamba intestinal toxin 1 and the embryonic head inducer Dickkopf-1. Toxicon. 38, 429-442 (2000).
- Binford, G. J. An analysis of geographic and intersexual chemical variation in venoms of the spider Tegenaria agrestis (Agelenidae). Toxicon. 39, 955-968 (2001).
- Alape-Girón, A., et al. Snake venomics of the lancehead pitviper Bothrops asper: geographic, individual, and ontogenetic variations. J. Proteome. Res. 7 (8), 3556-3571 (2008).
