提取毒液和毒腺Microdissections从蜘蛛的蛋白质组学和转录组分析

1.制备的电刺激的装置连接电刺激器电源线，插座和连接外部脚踏板的外部信号输入。 注：电线必须妥善绝缘，裸露的金属提供电流应不被感动。戴乳胶或丁腈手套保护。连接电源线和连接电线时电刺激器的电源开关应处于OFF位置。 连接正极，以红色输出端上的电刺激器（当极性开关处于正常模式）和负电极连接到黑色的输出端相连。注：每个电极导线应终止于一个鳄鱼夹。 设置刺激到以下推荐的初始设置：电压= 7 V，频率=每秒1个脉冲，延迟= 0毫秒，持续时间= 200毫秒，双脉冲开关=正规，​​模式切换= OFF。 电极通过连接鳄鱼夹voltme测试输出器正面和负面的测试线。开启刺激器电源开关，并提供电流脚踏板。 2.制备固定化镊子等材料沾羽镊子一个叉成液体的塑料涂层，并等待四小时让涂料干燥。紧紧包住相对叉齿的尖端15毫米与棉缝纫线的单个层，以及固定用线通过捆扎结束于一个结。 注意：该线程用于吸收施加的盐溶液，以促进导电，而塑料涂层提供绝缘以阻止电流。 砍钝的皮下注射针头的针尖锋利的剪刀，顺利开通用砂纸。连接针在真空垃圾收集器（ 例如 ，真空过滤烧瓶）经由管道。 注：针会吸走水分和反刍，将成为完成由刺激器电极产生的电路。针口万亩圣足够小，以不伤害蜘蛛，但足够大以真空溶液而不堵塞（ 如 ，25的G轨距×1个半，参见材料清单）。 位置轻量级镊子水平在使用乙烯树脂被覆双叉钳固定到下视解剖显微镜的字段一个磁性底座或固定台装置的密闭位置时，在顶部钳涂塑叉和螺纹涂覆叉上底部。 注意：双叉钳被维持在通过夹具夹持固定位置到磁性底座（参见材料清单）。一个橡胶圈可以紧密地固定围绕轻量级钳子的齿尖，旁边的夹持器，以增加额外的压力，以保持轻量级钳子在周围一次引入的蜘蛛闭合位置。 连接正极鳄鱼夹钳“底部叉线的上游和高度负鳄鱼夹钝金属真空针。 </li> 测试电路的电流与电压表通过将正极引线上线和鳄鱼夹，并把负极导线上的真空钝针之间钳爪。按脚踏板，以确保检测到足够的电流，并且如果检测到足够的电流，除去引线。 准备几个微细管毒液集合。拥有一个单独的微毛细管的一端用戴着手套的手，并在用无菌镊子金属的另一端，水平放置钳持月底在本生灯火焰。拉在与金属镊子远离火焰来创建一个细长尖端微细管，同时保持另一​​端在一个固定的位置。 注意：戴防护眼镜作为微毛细管容易破裂。 在培养皿中搁置在安装油灰条制备微毛细管。检查在解剖显微镜下微细管端，并创建一个小的，倾斜的开口在拉出端灭菌金属镊子。 啦贝尔可变数量的无菌0.5毫升管。加无菌去离子水，无菌管中（ 例如 ，5微升灭菌的去离子水）。靠近管并置于试管置于冰上。 制备盐溶液在烧杯中，并填充第二个烧杯用高压灭菌水。 在镊子3.固定蜘蛛打开CO 2罐，并从封闭的塑料瓶收集蜘蛛传输使用长金属镊子（见材料清单）成CO 2室。 注：黑寡妇蜘蛛有危险的毒液;总是这个协议时戴上手套。 保持蜘蛛在室内5-10分钟或直到麻醉，不再动时，轻轻地打了招呼，长镊子。用移液管以润湿线程上钳子用生理盐水溶液。 注：有关二氧化碳麻醉参数黑寡妇指南，请参阅西班牙广场和摩尔19。 从CO 2检索麻醉蜘蛛室通过使用钝解剖钳和手套的手的腿前采摘它。移动麻醉蜘蛛轻量级钳装置。封闭轻量级镊子尖头分开，并把蜘蛛的头胸部的插脚之间，让叉子紧紧地固定住，但没有被压碎，收关，确保蜘蛛。确保蜘蛛放置甲壳背侧面向下（见Foelix 20，用于引导到蜘蛛解剖学），搁在螺纹涂覆叉，和甲壳的腹侧朝向塑料涂层，而正极仍然附着于底叉。蜘蛛处理工作时快。 调整解剖显微镜的放大倍率，对焦和光源，直到蜘蛛的螯肢和獠牙都清晰可见。 4.收集毒液打开真空并利用第二钝尖注射器Ñ喷蜘蛛螯肢溶液与水eedle。吸走水用真空针以除去杂质。 触摸真空针附着负极蜘蛛主席台和提供脉冲与脚踏板的一个或更多次。如果有必要的真空客场吐出。 注：蜘蛛是主席台后口里面螯肢的螯肢和endites（见Foelix 20详细解剖蜘蛛）之间的背侧面。注意：对于每一个脉冲，蜘蛛的腿合同，毒液会显示为明显的水滴摆脱獠牙。 收集毒液水滴与微细管尖和传输毛细管末端浸入0.5毫升管与水或缓冲溶液（溶液将被吸入到毛细管）。 注意：避免穿刺蜘蛛与毛细管可能导致血淋巴污染而死亡。此外，还要避免毛细血管的污染丝绸和胶水从喷丝头。 连接传输注射器管适配器微毛细管（在端相对的收集尖）和dispense毒液液回管。把管上的冰。 注：在附近的锐器容器处置废物的毛细血管。 将打开塑料瓶收集，伴随着它的上限，接近蜘蛛。小心地抓住蜘蛛的腿在一个手持钝解剖钳小心地打开羽量级镊子尖头用另一只手，滑蜘蛛进入收集瓶钝钳，迅速接近上限。继续在-80℃的冰柜旁边的蜘蛛和储存含毒液管时结束。 注：继续从钳子移动时，蛛放回瓶中谨慎操作。确保收集瓶和瓶盖就在附近，以蜘蛛为它的快速传递和戴手套。 5.毒液腺解剖蜂毒采集后两到三天，麻醉蜘蛛在CO 2室（见步骤3.1）。填写液氮载体和地点旁边的解剖显微镜。 注：WH恩正与液态氮，用眼保护和低温手套。 干净的夹层区和解剖钳与解决方案，消除RNA酶和DNA污染。填补小培养皿下解剖显微镜解剖缓冲液（ 如柠檬酸1X盐水钠（SSC）缓冲液）放置。 从CO 2室转让蜘蛛培养皿中使用镊子，迅速 ​​从腹部分开的头胸部。 握住解剖显微镜下用镊子将头胸部和螯肢定位到视野。使用第二个钳子的两端尖锐削减角质层加入甲壳的螯肢的横向方面。横向抓住用第二个钳子的螯肢，轻轻拉扯来回，直到毒腺被拉出。 从螯肢单独的腺体（或离开附着螯肢如果需要的话），并转移到cyrosafe0.5毫升管。地方CLOS编管在液氮中。 注：每个夹层应不超过15分钟。 直到完成重复清扫额外的蜘蛛。从液氮输送管到-80℃的冰箱中。